Articolo metodologico
Questo protocollo descrive la metodologia per ablare geneticamente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) utilizzando un modello transgenico di zebrafish. L'adattamento del protocollo per incorporare la modulazione della via di segnalazione utilizzando composti farmacologici è ampiamente dettagliato. È stata sviluppata una piattaforma MATLAB per quantificare la rigenerazione RPE basata sulla pigmentazione, che viene presentata e discussa.
L'epitelio pigmentato retinico (RPE) risiede nella parte posteriore dell'occhio e svolge funzioni essenziali per mantenere la salute e l'integrità dei tessuti retinici e vascolari adiacenti. Allo stato attuale, la limitata capacità riparativa dell'RPE nei mammiferi, che è limitata a piccole lesioni, ha ostacolato il progresso verso la comprensione dei processi rigenerativi RPE in vivo . Qui, viene fornita una metodologia dettagliata per facilitare lo studio della riparazione RPE in vivo utilizzando il pesce zebra, un modello di vertebrato in grado di una robusta rigenerazione dei tessuti. Questo protocollo descrive un paradigma di lesione transgenico mediato da nitroreduttasi/metronidazolo (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), che si traduce in ablazione dei due terzi centrali dell'RPE dopo 24 ore di trattamento con MTZ, con successivo recupero tissutale. L'attenzione è posta sulle ablazioni RPE nel pesce zebra larvale e sono anche delineati i metodi per testare gli effetti dei composti farmacologici sulla rigenerazione RPE. Viene inoltre discussa la generazione e la convalida di RpEGEN, uno script MATLAB creato per automatizzare la quantificazione della rigenerazione RPE basata sulla pigmentazione. Oltre ai meccanismi attivi di riparazione RPE, questo protocollo può essere esteso agli studi sulla degenerazione RPE e sulle risposte alle lesioni, nonché sugli effetti del danno RPE sui tessuti retinici e vascolari adiacenti, tra gli altri processi cellulari e molecolari. Questo sistema di zebrafish è promettente nell'identificazione di geni, reti e processi che guidano la rigenerazione RPE e i meccanismi correlati alla malattia RPE, con l'obiettivo a lungo termine di applicare queste conoscenze ai sistemi dei mammiferi e, in definitiva, allo sviluppo terapeutico.
La metodologia qui descritta descrive un protocollo per ablare geneticamente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) utilizzando il pesce zebra larvale. L'RPE si estende sulla parte posteriore dell'occhio e risiede tra gli strati stratificati della retina neurale e lo strato di vascolarizzazione che costituisce la coroide. Il supporto trofico, l'assorbimento della luce fototossica e il mantenimento delle proteine del ciclo visivo sono solo alcune delle funzioni critiche che l'RPE svolge che sono essenziali per sostenere la salute e l'integrità di questi tessuti adiacenti1. Il danno all'RPE dei mammiferi è riparabile quando le lesioni sono piccole<....
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Tutte le metodologie qui descritte sono conformi all'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Pittsburgh.
1. Preparazione prima della raccolta degli embrioni di zebrafish
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È noto che l'inibizione della via di segnalazione canonica Wnt compromette significativamente la rigenerazione RPE del pesce zebra utilizzando il paradigma di ablazione genetica (rpe65a:nfsB-eGFP) e la metodologia di manipolazione farmacologica (IWR-1) descritti nel protocollo3. Questo esperimento è stato ripetuto qui per convalidare un metodo automatizzato per quantificare la rigenerazione RPE del pesce zebra basato sulla pigmentazione. I risultati riassunti di seguito comprendevano tutt.......
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Questo protocollo descrive la metodologia per ablare geneticamente l'RPE e studiare i meccanismi di degenerazione e rigenerazione nel pesce zebra di età larvale. Questo protocollo è stato eseguito con successo anche nel pesce zebra adulto3 ma con una caratterizzazione meno estesa, motivo per cui le larve sono al centro dell'attenzione. Gli aspetti critici di questa parte del protocollo (fasi 1-4) includono: 1) aggiunta di 1,5x PTU agli embrioni prima dell'inizio della melanogenesi, 2) decorionazio.......
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L.L.L. è il co-inventore del brevetto statunitense n. 9.458.428, che descrive un metodo accelerato per derivare l'epitelio pigmentato retinico da cellule staminali pluripotenti umane; questo non è correlato al contenuto del presente documento. J.M.G. e G.B.F. non hanno nulla da rivelare.
Il lavoro qui descritto è stato supportato dal National Institutes of Health (RO1-EY29410 a J.M.G e NIH CORE Grant P30-EY08098 al Dipartimento di Oftalmologia); il Centro Immunotrapianto e Terapia UPMC (a L.L.L. e J.M.G.); e la Cattedra E. Ronald Salvitti in Ricerca Oftalmologica (a J.M.G.). Un ulteriore sostegno è stato ricevuto dalla Wiegand Fellowship in Ophthalmology (a L.L.L), dalla Eye & Ear Foundation di Pittsburgh e da una sovvenzione illimitata da Research to Prevent Blindness, New York, NY. Gli autori desiderano anche ringraziare Amanda Platt per l'assistenza tecnica e il Dr. Hugh Hammer e lo staff acquatico per l'eccellente supporto alla cura degli animali.....
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lab Materiale/Attrezzature | |||
| 2-(4-Amidinofenil)-6-indolecarbamidina dicloridrato (DAPI) | Millipore Sigma | D9542 | |
| Piastre a 6 pozzetti | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Provette coniche per centrifuga in polipropilene | Fisher Scientific | 05-539-13 | Il numero di catalogo è per provette da 50 mL |
| Penna per incisione con punta di diamante | Fisher Scientific | 50-254-51 | Prodotto da Electron Microscopy Sciences, articoli simili a questo codice sono adeguati |
| Dimetilsolfossido (DMSO) ≥ 99,7 % | Fisher Scientific | BP231 | Verificare i requisiti istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti chimici |
| Incubatrice per embrioni (grande) | Fisher Scientific | 3720A | |
| Incubatrice per embrioni (mini/da tavolo) | Labnet | I5110A | |
| Stereomicroscopio a fluorescenza | Zeiss | Axio Zoom.V16 | O simile, con laser/filtro di eccitazione a 488 nm |
| Pipetta in vetro Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-4 | Prodotto da Corning, non sterile |
| InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo | Millipore Sigma | 5.04462 | Prodotto da Calbiochem; 25 mM in DMSO; verificare i requisiti istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti chimici |
| Blu di metilene (polvere) | Fisher Scientific | BP117-100 | Disponibile anche come soluzione |
| preconfezionataMetronidazolo (MTZ) | Millipore Sigma | M3761 | Verificare i requisiti istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti chimici |
| N-feniltiourea (PTU) | Millipore Sigma | P7629 | Verificare i requisiti istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti chimici |
| Senza metanolo Senza metanolo | Fisher Scientific | AA433689M | Rifiuti chimici, è richiesto un corretto smaltimento |
| Piastre di Petri | Fisher Scientific | FB0875712 | 10 cm di diametro |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (bustine di polvere) | Millipore Sigma | P3813 | Utilizzato per produrre 10 X PBS stock |
| Pronase | Millipore Sigma | PRON-RO | |
| Incubatore a scuotimento | Benchmark | H2010 | Utilizzato per l'incubazione di MTZ per 1 ora a 37 gradi Celsius |
| Stereomicroscopio | Leica | S9i | O simile, con luce trasmessa illuminazione |
| Studente Dumont #5 pinze | Fine Science Tools | 91150-20 | Pinze a punta fine per la decorionazione manuale |
| Rotatore/agitatore da tavolo | Scilogex | SK-D1807-E | |
| Pipetta di trasferimento | Millipore Sigma | Z135003 | 3,2 mL estrazione della lampadina, non sterile |
| Tricaina metanassolato (MS-222) | Pentair | TRS1, TRS2, TRS5 | Disponibile anche da Fisher Scientific (NC0342409) |
| Supporto di montaggio antidissolvenza VECTASHIELD con DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Software Material | |||
| FIJI (Fiji is Just ImageJ) | FIJI (Fiji is Just ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/ | Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Costruzione: 269a0ad53f; Plugin necessario: Bio-Formattazioni, |
| esempi GRAMM e how-to, | MathWorks | https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like. | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Toolboxes necessari per eseguire RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox |
| MATLAB supporta | MathWorks | https://www.mathworks.com/support.html |
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