Il presente protocollo descrive la preparazione del campione e l'analisi dei dati per quantificare la fosforilazione proteica utilizzando un test di pull-down a singola molecola (SiMPull) migliorato.
Articolo metodologico
Il presente protocollo descrive la preparazione del campione e l'analisi dei dati per quantificare la fosforilazione proteica utilizzando un test di pull-down a singola molecola (SiMPull) migliorato.
La fosforilazione è una modifica post-traduzionale necessaria che regola la funzione proteica e dirige i risultati della segnalazione cellulare. Gli attuali metodi per misurare la fosforilazione delle proteine non possono preservare l'eterogeneità della fosforilazione tra le singole proteine. Il test di pull-down a singola molecola (SiMPull) è stato sviluppato per studiare la composizione di complessi macromolecolari tramite immunoprecipitazione di proteine su un coverslip di vetro seguito da imaging a singola molecola. La tecnica attuale è un adattamento di SiMPull che fornisce una robusta quantificazione dello stato di fosforilazione dei recettori di membrana a lunghezza intera a livello di singola molecola. L'imaging di migliaia di singoli recettori in questo modo consente di quantificare i modelli di fosforilazione delle proteine. Il presente protocollo descrive in dettaglio la procedura SiMPull ottimizzata, dalla preparazione del campione all'imaging. L'ottimizzazione della preparazione del vetro e dei protocolli di fissazione degli anticorpi migliora ulteriormente la qualità dei dati. L'attuale protocollo fornisce il codice per l'analisi dei dati a singola molecola che calcola la frazione di recettori fosforilati all'interno di un campione. Mentre questo lavoro si concentra sulla fosforilazione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), il protocollo può essere generalizzato ad altri recettori di membrana e molecole di segnalazione citosolica.
La segnalazione associata alla membrana è sintonizzata da una combinazione di attivazione del recettore di membrana indotta dal ligando e reclutamento di proteine accessorie a valle che propagano il segnale. La fosforilazione delle tirosinine chiave nelle code citoplasmatiche dei recettori è fondamentale per avviare la formazione di complessi di segnalazione, o signalosomi 1,2. Pertanto, una domanda importante in biologia è come vengono creati e mantenuti i modelli di fosforilazione per reclutare partner di segnalazione e dettare i risultati cellulari. Ciò include la comprensione dell'eterogeneità della fosfor....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
1. Preparazione coverslip
NOTA: Per questo passaggio, è necessario indossare dispositivi di protezione individuale (DPI), che includono un doppio strato di guanti in nitrile, occhiali di sicurezza o visiera e un camice da laboratorio.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Un cartone animato raffigurante il processo SiMPull è mostrato nella Figura 1A. I coverslip sono funzionalizzati utilizzando NeutrAvidin come ancoraggio per gli anticorpi anti-EGFR biotinilati per catturare EGFR-GFP dai lisati proteici totali. Dopo aver lavato via le proteine non legate, i recettori fosforilati sono etichettati con un anticorpo anti-fosfotirosina (anti-PY)15. La Figura 1B mostra un'immagine dell'array idrofobo, in cui è p.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato per consentire misurazioni quantitative della fosforilazione del recettore a livello di singola proteina. Sono state sviluppate diverse modifiche semplici ma importanti al protocollo SiMPull che hanno migliorato l'affidabilità della misurazione per il rilevamento della fosfo-tirosina, compresa la riduzione dell'autofluorescenza con il trattamento con NaBH4 e il postfissaggio del campione per prevenire la dissociazione degli anticorpi. L'utilizzo della maschera a .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 e R01CA248166 to DSL. EMB è stato supportato attraverso il programma ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) e JAR dal programma UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Riconosciamo con gratitudine l'utilizzo della risorsa condivisa di microscopia a fluorescenza del Comprehensive Cancer Center dell'Università del New Mexico, supportata da NIH P30CA118100. Vogliamo ringraziare i dottori Ankur Jain e Taekijip Ha, il cui sviluppo originale di SiMPull ha ispirato questo lavoro.
Indirizzo attuale di ES-C: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Researc....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | MTC Bio | C2000 | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7,4 | |||
| 10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaCl | T50 Tampone | ||
| 100 mm Piatto per coltura tissutale | CELLTREAT | 229620 | Conservazione di piranha in vetro/array 15 |
| mL provetta | |||
| 16% Paraformaldeide acquosa Scienze | microscopia elettronica | in soluzione 15710 | |
| Pericolosa provetta | Conservazione in vetro funzionalizzato / riutilizzo KOH | ||
| 50 mM Tris-HCl pH 7,2/150 mM Componente | tampone per lisi | ||
| 60 mm Piatto per coltura tissutale | Corning | 430166 | |
| 8% di glutaraldeide Soluzione acquosa | Microscopia elettronica Scienze | 16020 | Acetone pericoloso |
| (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Pericoloso |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
| EGF umano ricombinante senza animali | Peprotech | AF-100-15 | |
| EGFR anti-umano (dominio esterno) – Biotina | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
| Anticorpo anti-p-Tyr (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
| Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
| BCA Kit per il dosaggio delle proteine | Pierce | 23227 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5.000 | |
| Albumina | sierica bovinaGold Biotechnology | A-420-1 | Componente tampone di Tyrode |
| Imbuto | |||
| Bruciatore | |||
| Cloruro di calcio (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Raschietto cellulare componente tampone di Tyrode |
| Bioworld | 30900017-1 | ||
| Pallone filtrante conico | Fisher Scientific | S15464 | |
| Barattolo Coplin | WHEATON | 900470 | |
| Contacellule automatizzato Countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Vetrini coprioggetti 24 x 60 #1.5 | Scienze della microscopia elettronica | 63793 | |
| DipImage | https://diplib.org/ | ||
| DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
| Telecamera emCCD | Andor iXon | ||
| Fetale Siero Bovino, Optima | Bio-Techne | S12450H | Calore Inattivato |
| Fusion 360 Software | Autodesk | ||
| Geneticin G418 Disolfato | Caisson Labs | G030-5GM | |
| Acido acetico glaciale (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Pericoloso |
| Pipette sierologiche in vetro Bacchetta | |||
| agitazione in vetro | |||
| Glucosio (D-(+)-glucosio) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer |
| Component Halt Phosphotasi and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | TyrodeComponente tampone di VWR |
| Acido cloridrico (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Perossido di idrogeno pericoloso |
| (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
| Perossido di idrogeno (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
| Ghiaccio | |||
| IGEPAL CA-630 ( NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Componente tampone di lisi |
| ImmEdge Penna barriera idrofobica | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Immersol 518F olio da immersione | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| linea | |||
| L-glutammina | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
| Cloruro di magnessio esaidrato (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
| Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox e Statistics and Machine Learning Toolbox | |
| Metanolo (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Acqua |
| pericolosa Milli-Q | |||
| Kit di etichettatura degli anticorpi coloranti Mix-n-Stain CF | Biotium | 92245 | Kit di coniugazione suggerito |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidil valerato, MW 5.000 | |
| N-(2-amminoetil)-3-amminopropiltrimetossisilano | UCT United Chemical | A0700 | |
| Hazardous Nanogrid | Miraloma Tech | ||
| NeutrAvidin Biotina Proteina legante | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Azoto (gas compresso) | |||
| GPU NVIDIA con CUDA | Cerca la compatibilità con https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
| Microscopio Olympus iX71 | Olympus | ||
| Parafilm M | The Lab Depot | HS234526C | |
| PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
| PC-200 Piastra riscaldante analogica | Corning | 6795-200 | |
| Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
| Recettore fosfo-EGF (Tyr1068) (1H12) | Tecnologia di segnalazione cellulare | 2236BF | |
| Cloruro di potassio (KCl) | Millipore Sigma | di 529552 | Tyrode |
| Idrossido di potassio (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Filamento |
| PLA Premium pericoloso, diametro 1,75 mm | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Intervallo di temperatura di stampa: 205-235 ... Stampante |
| 3D C Pro2 | Becher | ||
| Pyrex 1 L | |||
| Splitter | Fotometrico | Modello QV2 | |
| Centrifuga refrigerata | Eppendorf | EP-5415R | |
| RevCount Contatori di celle, vetrini per conteggio celle EVE | VWR | 10027-446 | |
| Filtri di emissione Semrock: blu (445/45 nm), verde (525/45 nm), rosso (600/37 nm), rosso lontano (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
| Controllore sierologico per pipette | |||
| Pipette | |||
| smite pacchetto per l'analisi di singole molecole | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
| Bicarbonato di sodio (NaHCO3)Sigma | Aldrich | S6014 | |
| Boroidruro di sodio pericoloso (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode' s Componente tampone |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Attivazione mediante cicli successivi di calore e pH |
| Idrossido di sodio | VWR | BDH3247-1 | |
| Ortovanadato di sodio (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | |
| Acido solforico pericoloso (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | |
| Microsfere TetraSpeck | Thermo Fisher Scientific | T7279 | perle multifluorescenti |
| Tris (Trizma) | Millipore Sigma | T1503 | |
| Trypan colorazione blu, 0,4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Tripsina-EDTA 0,05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi permesso