Method Article

Un test di pull-down a singola molecola ottimizzato per la quantificazione della fosforilazione delle proteine

DOI:

10.3791/63665

⸱

June 6th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo descrive la preparazione del campione e l'analisi dei dati per quantificare la fosforilazione proteica utilizzando un test di pull-down a singola molecola (SiMPull) migliorato.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fosforilazione è una modifica post-traduzionale necessaria che regola la funzione proteica e dirige i risultati della segnalazione cellulare. Gli attuali metodi per misurare la fosforilazione delle proteine non possono preservare l'eterogeneità della fosforilazione tra le singole proteine. Il test di pull-down a singola molecola (SiMPull) è stato sviluppato per studiare la composizione di complessi macromolecolari tramite immunoprecipitazione di proteine su un coverslip di vetro seguito da imaging a singola molecola. La tecnica attuale è un adattamento di SiMPull che fornisce una robusta quantificazione dello stato di fosforilazione dei recettori di membrana a lunghezza intera a livello di singola molecola. L'imaging di migliaia di singoli recettori in questo modo consente di quantificare i modelli di fosforilazione delle proteine. Il presente protocollo descrive in dettaglio la procedura SiMPull ottimizzata, dalla preparazione del campione all'imaging. L'ottimizzazione della preparazione del vetro e dei protocolli di fissazione degli anticorpi migliora ulteriormente la qualità dei dati. L'attuale protocollo fornisce il codice per l'analisi dei dati a singola molecola che calcola la frazione di recettori fosforilati all'interno di un campione. Mentre questo lavoro si concentra sulla fosforilazione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), il protocollo può essere generalizzato ad altri recettori di membrana e molecole di segnalazione citosolica.

Introduction

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La segnalazione associata alla membrana è sintonizzata da una combinazione di attivazione del recettore di membrana indotta dal ligando e reclutamento di proteine accessorie a valle che propagano il segnale. La fosforilazione delle tirosinine chiave nelle code citoplasmatiche dei recettori è fondamentale per avviare la formazione di complessi di segnalazione, o signalosomi 1,2. Pertanto, una domanda importante in biologia è come vengono creati e mantenuti i modelli di fosforilazione per reclutare partner di segnalazione e dettare i risultati cellulari. Ciò include la comprensione dell'eterogeneità della fosfor....

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Protocol

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1. Preparazione coverslip

NOTA: Per questo passaggio, è necessario indossare dispositivi di protezione individuale (DPI), che includono un doppio strato di guanti in nitrile, occhiali di sicurezza o visiera e un camice da laboratorio.

  1. Eseguire l'incisione piranha per rimuovere i detriti organici dal vetro.
    ATTENZIONE: La soluzione di Piranha è un forte agente ossidante corrosivo e altamente reattivo a contatto con materiali organici. La reazione con detriti organici è esotermica e potenzialmente esplosiva. Pertanto, la procedura deve essere eseguita in una cappa chimica con l'anta abbassata. La vetreria Pyrex è....

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Results

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Un cartone animato raffigurante il processo SiMPull è mostrato nella Figura 1A. I coverslip sono funzionalizzati utilizzando NeutrAvidin come ancoraggio per gli anticorpi anti-EGFR biotinilati per catturare EGFR-GFP dai lisati proteici totali. Dopo aver lavato via le proteine non legate, i recettori fosforilati sono etichettati con un anticorpo anti-fosfotirosina (anti-PY)15. La Figura 1B mostra un'immagine dell'array idrofobo, in cui è p.......

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Discussion

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Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato per consentire misurazioni quantitative della fosforilazione del recettore a livello di singola proteina. Sono state sviluppate diverse modifiche semplici ma importanti al protocollo SiMPull che hanno migliorato l'affidabilità della misurazione per il rilevamento della fosfo-tirosina, compresa la riduzione dell'autofluorescenza con il trattamento con NaBH4 e il postfissaggio del campione per prevenire la dissociazione degli anticorpi. L'utilizzo della maschera a .......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 e R01CA248166 to DSL. EMB è stato supportato attraverso il programma ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) e JAR dal programma UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Riconosciamo con gratitudine l'utilizzo della risorsa condivisa di microscopia a fluorescenza del Comprehensive Cancer Center dell'Università del New Mexico, supportata da NIH P30CA118100. Vogliamo ringraziare i dottori Ankur Jain e Taekijip Ha, il cui sviluppo originale di SiMPull ha ispirato questo lavoro.
Indirizzo attuale di ES-C: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Researc....

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Materials

336

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provette per microcentrifuga da 1,5 mLMTC BioC2000
10 mM Tris-HCl pH 7,4
10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaClT50 Tampone
100 mm Piatto per coltura tissutaleCELLTREAT229620Conservazione di piranha in vetro/array 15
mL provetta
16% Paraformaldeide acquosa Scienzemicroscopia elettronicain soluzione 15710
Pericolosa provettaConservazione in vetro funzionalizzato / riutilizzo KOH
50 mM Tris-HCl pH 7,2/150 mM Componentetampone per lisi
60 mm Piatto per coltura tissutaleCorning430166
8% di glutaraldeide Soluzione acquosaMicroscopia elettronica Scienze16020Acetone pericoloso
(C3H6O)Millipore Sigma270725Pericoloso
Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
EGF umano ricombinante senza animaliPeprotechAF-100-15
EGFR anti-umano (dominio esterno) – BiotinaLeinco Technologies, IncE101
Anticorpo anti-p-Tyr (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Bath-sonicatorBranson1200
BCA Kit per il dosaggio delle proteinePierce23227
Biotin-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA, MW 5.000
Albuminasierica bovinaGold BiotechnologyA-420-1Componente tampone di Tyrode
Imbuto
Bruciatore
Cloruro di calcio (CaCl2)Millipore SigmaC4901Raschietto cellulare componente tampone di Tyrode
Bioworld30900017-1
Pallone filtrante conicoFisher ScientificS15464
Barattolo CoplinWHEATON900470
Contacellule automatizzato Countess IIThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Vetrini coprioggetti 24 x 60 #1.5Scienze della microscopia elettronica63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEMCaisson LabsDML19-500
Telecamera emCCDAndor iXon
Fetale Siero Bovino, OptimaBio-TechneS12450HCalore Inattivato
Fusion 360 SoftwareAutodesk
Geneticin G418 DisolfatoCaisson LabsG030-5GM
Acido acetico glaciale (CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01Pericoloso
Pipette sierologiche in vetro Bacchetta
agitazione in vetro
Glucosio (D-(+)-glucosio)Millipore SigmaD9434Tyrode's Buffer
Component Halt Phosphotasi and Protease Inhibitor Cocktail (100X)Thermo Fisher Scientific78446Lysis Buffer Component
HEPESMillipore SigmaH3375TyrodeComponente tampone di VWR
Acido cloridrico (HCl)VWRBDH7204-1Perossido di idrogeno pericoloso
(H2O2) (3%)HX0645
Perossido di idrogeno (H2O2) (30%)EMD MilliporeHX0635-2
Ghiaccio
IGEPAL CA-630 ( NP-40)Sigma AldrichI8896Componente tampone di lisi
ImmEdge Penna barriera idrofobicaVector LaboratoriesH-4000
Immersol 518F olio da immersioneZeiss444960-0000-000
linea
L-glutamminaThermo Fisher Scientific25030-164
Cloruro di magnessio esaidrato (MgCl2-6H2O)MPBio2191421Tyrode's Buffer Component
MatlabMathworksCurve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox e Statistics and Machine Learning Toolbox
Metanolo (CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1Acqua
pericolosa Milli-Q
Kit di etichettatura degli anticorpi coloranti Mix-n-Stain CFBiotium92245Kit di coniugazione suggerito
mPEGLaysan BiomPEG-succinimidil valerato, MW 5.000
N-(2-amminoetil)-3-amminopropiltrimetossisilanoUCT United ChemicalA0700
Hazardous NanogridMiraloma Tech
NeutrAvidin Biotina Proteina leganteThermo Fisher Scientific31000
Azoto (gas compresso)
GPU NVIDIA con CUDACerca la compatibilità con https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Microscopio Olympus iX71Olympus
Parafilm MThe Lab DepotHS234526C
PBS pH 7.4Caisson LabsPBL06
PC-200 Piastra riscaldante analogicaCorning6795-200
Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-163
Recettore fosfo-EGF (Tyr1068) (1H12)Tecnologia di segnalazione cellulare2236BF
Cloruro di potassio (KCl)Millipore Sigmadi 529552Tyrode
Idrossido di potassio (KOH)Millipore Sigma1050330500Filamento
PLA Premium pericoloso, diametro 1,75 mmRaise 3DPMS:2035U/RAL:3028Intervallo di temperatura di stampa: 205-235 ... Stampante
3D C Pro2Becher
Pyrex 1 L
SplitterFotometricoModello QV2
Centrifuga refrigerataEppendorfEP-5415R
RevCount Contatori di celle, vetrini per conteggio celle EVEVWR10027-446
Filtri di emissione Semrock: blu (445/45 nm), verde (525/45 nm), rosso (600/37 nm), rosso lontano (685/40 nm)SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
Controllore sierologico per pipette
Pipette
smite pacchetto per l'analisi di singole molecolehttps://github.com/LidkeLab/smite.git
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)SigmaAldrichS6014
Boroidruro di sodio pericoloso (NaBH4)Millipore Sigma452874Tyrode' s Componente tampone
Cloruro di sodio (NaCl)Millipore SigmaS9625Attivazione mediante cicli successivi di calore e pH
Idrossido di sodioVWRBDH3247-1
Ortovanadato di sodio (Na3VO4)Millipore SigmaS6508
Acido solforico pericoloso (H2SO4)Millipore Sigma258105
Microsfere TetraSpeckThermo Fisher ScientificT7279perle multifluorescenti
Tris (Trizma)Millipore SigmaT1503
Trypan colorazione blu, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061
Tripsina-EDTA 0,05%Thermo Fisher Scientific25300120
conica della conica da 50 mL NaCl BuchnerBunsendidi vuoto interna Pellicola sigillante mAb di topo Componente tampone Raise 3D Flaconi di stoccaggio PYREX 100 mL Corning 1395-100 CHOH/CHO riutilizza Becher Pyrex 250 mL Becher Pyrex 4 L Quad-view Immagine sierologiche pericolose base

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006....

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Single Molecule Pull DownProtein PhosphorylationPhosphorylation QuantificationEGFR PhosphorylationImmunoprecipitation AssayAntibody LabelingGlass PreparationSingle Molecule ImagingColocalization AnalysisGaussian Localization

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