Viene descritto un protocollo che utilizza la microdissezione laser per isolare i singoli tessuti nematodi per il sequenziamento dell'RNA. Il protocollo non richiede toolkit genetici specie-specifici, consentendo di confrontare i profili di espressione genica tra diverse specie a livello di campioni di tessuto singolo.
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Articolo metodologico
Microdissezione laser per applicazioni a tessuto singolo indipendenti dalla specie
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le metodologie a singola cellula hanno rivoluzionato l'analisi dei trascrittomi di specifici tipi cellulari. Tuttavia, spesso richiedono "toolkit" genetici specie-specifici, come i promotori che guidano l'espressione tessuto-specifica di proteine fluorescenti. Inoltre, i protocolli che interrompono i tessuti per isolare le singole cellule rimuovono le cellule dal loro ambiente nativo (ad esempio, la segnalazione dai vicini) e possono causare risposte allo stress o altre differenze dagli stati di espressione genica nativa. Nel presente protocollo, la microdissezione laser (LMD) è ottimizzata per isolare le singole punte della coda dei nematodi per lo studio dell'espressione genica durante la morfogenesi della punta della coda maschile.
LMD consente l'isolamento di una parte dell'animale senza la necessità di interruzioni cellulari o toolkit specifici per specie ed è quindi applicabile a qualsiasi specie. Successivamente, i protocolli di preparazione della libreria RNA-seq a singola cellula come CEL-Seq2 possono essere applicati a singoli tessuti isolati da LMD e analizzati utilizzando pipeline standard, dato che per la specie è disponibile un genoma o trascrittoma ben annotato. Tali dati possono essere utilizzati per stabilire quanto siano conservati o diversi i trascrittomi che sono alla base dello sviluppo di quel tessuto in specie diverse.
Le limitazioni includono la possibilità di tagliare il tessuto di interesse e la dimensione del campione. Un'analisi di potenza mostra che sono necessarie solo 70 punte di coda per condizione per l'80% di potenza. È necessaria una stretta sincronizzazione dello sviluppo per ottenere questo numero di animali nella stessa fase di sviluppo. Pertanto, viene descritto anche un metodo per sincronizzare gli animali a intervalli di 1 ora.
Introduzione
I nematodi, in particolare i nematodi rabditidi correlati al sistema modello Caenorhabditis elegans, sono un meraviglioso gruppo di animali per la biologia evolutiva dello sviluppo (EDB) per molte ragioni 1,2. I vantaggi includono il loro piccolo numero di cellule, lignaggi cellulari definiti e coerenti, la trasparenza e la facilità di coltura e allevamento. Ci sono anche molte risorse disponibili, tra cui genomi di alta qualità per più specie e per C. elegans, ampi strumenti genetici molecolari e conoscenze sullo sviluppo, la genetica, l'anatomia e la fisiologia<....
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Protocollo
1. Sincronizzazione worm
NOTA: Di seguito sono descritti due metodi per sincronizzare lo sviluppo di C. elegans e di altre specie di rabditidi.
- Sincronizzazione mediante arresto del primo stadio larvale (L1) dopo trattamento con ipoclorito alcalino (candeggina).
NOTA: questo metodo è stato descritto in precedenza in dettaglio19. Questo metodo si basa su due caratteristiche di C. elegans che sono vere anche per molte altre specie di rabditidi: (1) Il guscio d'uovo è resistente alla candeggina, mentre la cuticola che circonda i vermi adulti e larvali non lo è. (2) Le larv....
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Risultati
Dopo la microdissezione di cattura laser, le singole punte della coda di maschi ed ermafroditi a 4 punti temporali (L3 22 h dopo la schiusa; L4 24, 26 e 28 h dopo la schiusa) sono stati preparati per il sequenziamento dell'RNA utilizzando il protocollo CEL-Seq2. I primer CEL-Seq2 contengono codici a barre univoci che consentono di identificare bioinformaticamente le letture di sequenziamento da un particolare campione (in questo caso una singola punta di coda). I dati di sequenziamento sono stati generati con questo meto.......
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Discussione
Passaggi critici del metodo
Se eseguito correttamente, il metodo qui descritto otterrà profili di RNA robusti con un numero relativamente piccolo di campioni sezionati al laser (70 punte di coda in questo esempio). Tuttavia, per i campioni provenienti da animali in via di sviluppo, una stretta sincronizzazione è fondamentale per ridurre la variabilità tra i campioni. Per questo motivo, il protocollo consiglia il metodo hatch-off per la sincronizzazione worm. Qui, il ricercatore può determinare e contr.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da NIH (R01GM141395) e NSF (1656736) sovvenzioni a DF e NIH fellowship (F32GM136170) ad AW. La Figura 1 è stata creata con l'aiuto di BioRender.com.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5 µ Vetrini a membrana M PEN 11600288 Leica senza RNasi | per LMD | ||
| 500 & micro; L Provette PCR (senza nucleasi) | Axygen | 732-0675 | per tagliare le punte della coda in |
| Microscopio composto con obiettivo 40x e DIC | qualsiasi | per controllare l'età dei vermi | |
| Umidificatore da tavolo | qualsiasi | ||
| Microscopio da dissezione con base a luce trasmessa | qualsiasi | per tutti i lavori con vermi | |
| Tortette in vetro pasteur | qualsiasi | manico di plettro | |
| vetrini e vetrini coprioggetti | qualsiasi | per controllare l'età dei vermi Sistema di | |
| microdissezione LMD6 | Leica multiplo | per tagliare le punte della coda | |
| Provette LoBind 0,5 mL | Eppendorf | 22431005 | |
| M9 Ricetta tampone | in WormBook | ||
| Metanolo 99,8% | Sigma | 322415 | per fissare i vermi |
| NGM terreno di crescita | US Biologico | N1000 | È necessario aggiungere tamponi e sali: Ricetta in WormBook |
| P10 pipetta variablle volume | , ad es. pipetta Gilson | ||
| P1000 volume variabile | , ad es. pipetta Gilson | ||
| P2 a volume variabile | ad es. puntali per pipette Gilson | ||
| 1.000 &; L | qualsiasi | ||
| Puntali per pipette 1-10 & micro; L filtrato | qualsiasi | ||
| filo di platino iridio | Tritech | PT-9010 | per rendere |
| sterile il worm pick e privo di nucleasi Provette centrfughe da 1 mL | qualsiasi | ||
| Tween 20 | Sigma | P9416 | Aggiungere una quantità molto piccola al tampone M9 per evitare che i vermi si attacchino alle punte della pipetta |
| Piastre di Petri in plastica da 6 mm ventilate | qualsiasi | ||
| Per CEL-Seq2 | |||
| 4200 Sistema TapeStation con reagenti per il rilevamento di RNA e DNA ad alta sensibilità | Sistema di elettroforesi automatizzato | Aligent | |
| Perline AMPure XP | Perline Beckman Coulter | A63880 | Perline per la pulizia del DNA Tampone |
| legante le perle 20% PEG8000, 2,5 M NaCl | |||
| CEL-Seq2 primer (vedi Tabella S1) | Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf | 6335000020 | Termociclatore con coperchio e blocco programmabili per 200 &5; L tubi. |
| DNA polimerasi I (E. coli) | Invitrogen | 18052-025 | |
| miscela dNTP 10 mM | any | ||
| E. coli DNA ligasi | Invitrogen | 18052-019 | |
| Etanolo | |||
| ExoSAP-IT per la pulizia del prodotto PCR | Affymetrix | 78200 | soluzione esonucleasica |
| MEGAscript T7 Kit di trascrizione | Ambion | AM1334 | Per la fase 4.6.1 |
| Acqua priva di nucleasi | qualsiasi | ||
| Phusion PCR ad alta fedeltà Master Mix con tampone HF NEB | M0531 | PCR mix fase 4.9.7 | |
| hexamer casuale RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN | IDT | un primer con 6 nucleotidi che sono | |
| casuali RNA Fragmentation buffer | NEB | E6150S Tampone | |
| di arresto della frammentazione dell'RNA | NEB | E6150S | |
| RNA PCR Index Primers (RPI1– RPI48) | Illumina, NEB o IDT | RPIX nel passaggio del protocollo 4.9.7, sequenze disponibili da Illumina | |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | |
| RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Scientific | 7000TS1 | o qualsiasi altro prodotto simile |
| RNaseH (E. coli) | Invitrogen | 18021-071 | |
| RNaseOUT Recombinant Inibitore della ribonucleasi | Invitrogen | 10777-019 | |
| Tampone del secondo filamento | Invitrogen | 10812-014 | |
| Superscripit II | Invitrogen | 18064-014 | trascrittasi inversa |
Riferimenti
- Haag, E. S., Fitch, D. H. A., Delattre, M. From "the worm" to "the worms" and back again: the evolutionary developmental biology of nematodes. Genetics. 210 (2), 397-433 (2018).
- Sommer, R. J., Bumbarger, D. J.
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Ristampe e permessi
