Quantificazione completa rispetto a quella subregionale del carico di amiloide-beta sulle sezioni cerebrali del topo

Sommario

Il presente protocollo descrive e confronta la procedura per eseguire un'analisi a regione o sottoregione di interesse di sezioni cerebrali di topo sagittale per quantificare il carico di amiloide-beta nel modello murino transgenico APP / PS1 della malattia di Alzheimer.

Abstract

L'accumulo extracellulare di placche amiloide-beta (Aβ) è uno dei principali segni patologici della malattia di Alzheimer (AD) ed è l'obiettivo dell'unico trattamento modificante la malattia approvato dalla FDA per l'AD. Di conseguenza, l'uso di modelli murini transgenici che sovraesprimono la proteina precursore dell'amiloide e quindi accumulano placche Aβ cerebrali sono ampiamente utilizzati per modellare l'AD umano nei topi. Pertanto, i saggi immunologici, tra cui il saggio immunoassorbinte enzimatico (ELISA) e l'immunocolorazione, misurano comunemente il carico di Aβ nei tessuti cerebrali derivati da topi transgenici AD. Sebbene i metodi per il rilevamento e la quantificazione di Aβ siano stati ben stabiliti e documentati, l'impatto della dimensione della regione di interesse selezionata nel tessuto cerebrale sulle misurazioni del carico Aβ a seguito di immunocolorazione non è stato riportato. Pertanto, l'attuale protocollo mirava a confrontare le misurazioni del carico Aβ tra le regioni complete e secondarie di interesse utilizzando un software di analisi delle immagini. I passaggi coinvolti nella preparazione del tessuto cerebrale, nell'immunocolorazione della sezione cerebrale fluttuante, nell'imaging e nella quantificazione del carico di Aβ in intere sottoregioni di interesse sono descritti utilizzando sezioni cerebrali derivate da topi maschi doppio transgenico APP / PS1 di 13 mesi. L'attuale protocollo e i risultati forniscono preziose informazioni sull'impatto della dimensione della regione di interesse sulla quantificazione dell'area Aβ-positiva e mostrano una forte correlazione tra l'area Aβ-positiva ottenuta utilizzando le analisi complete e sottoregioni di interesse per sezioni cerebrali derivate da topi MASCHI APP/PS1 di 13 mesi che mostrano una diffusa deposizione di Aβ.

Introduzione

Il morbo di Alzheimer (AD), la sesta causa di morte negli Stati Uniti, continua ad essere una minaccia per la salute pubblica, con una stima di 6,2 milioni di americani che vivono con AD. Si prevede che raggiungerà i 13,8 milioni entro il 2060¹. Ad oggi, la gestione sintomatica attraverso farmaci come gli inibitori della colinesterasi e la memantina è il corso primario del trattamento². L'AD è caratterizzato da manifestazioni neuropatologiche come la deposizione extracellulare di placche di amiloide-beta (Aβ) e l'accumulo intracellulare iperfosforilato di tau sotto forma di grovigli neurofibrillari ^3,4. Formato da una scissione endoproteolitica della proteina precursore dell'amiloide (APP) tramite beta- e gamma-secretasi, aggrega ambrega per formare oligomeri e fibrille, portando a effetti neurotossici⁵. Aβ è stato ipotizzato per svolgere un ruolo patologico primario dal 1980, ed è l'obiettivo terapeutico dell'unica terapia modificante la malattia approvata dalla FDA per AD⁶. Di conseguenza, i modelli murini transgenici di AD che ospitano mutazioni nei geni con conseguente robusto accumulo cerebrale di Aβ sono stati ampiamente utilizzati per la ricerca preclinica sull'AD sin dai primi anni 1990⁷.

Il rilevamento di specie Aβ in questi cervelli di topo transgenico AD viene generalmente effettuato utilizzando due saggi immunologici: saggio immunoassorbente enzimatico (ELISA) e immunocolorazione. Il primo test consente la determinazione quantitativa di diverse specie di Aβ ed è meno dispendioso in termini di tempo rispetto all'immunocolorazione, che richiede diverse fasi sequenziali di elaborazione e imaging dei tessuti, tra cui sezionamento tissutale, immunocolorazione, imaging e quantificazione⁸. Inoltre, i risultati ottenuti a seguito dell'immunocolorazione sono semi-quantitativi⁸. Tuttavia, la capacità di localizzare spazialmente Aβ rende l'immunocolorazione un approccio interessante per il rilevamento di Aβ nei tessuti cerebrali⁸.

Durante l'utilizzo dell'immunocolorazione Aβ, diversi paradigmi di quantificazione sono stati impiegati da diversi gruppi di ricerca. Ad esempio, alcuni gruppi di ricerca quantificano il carico Aβ nell'intera regione di interesse (corteccia o ippocampo), mentre altri quantificano il carico Aβ in una specifica sottoregione di interesse (una parte della corteccia o dell'ippocampo)^9,10,11. Sebbene i metodi per il rilevamento e la quantificazione di Aβ siano stati ben stabiliti e documentati, l'impatto della dimensione della regione di interesse sulle misurazioni del carico Aβ a seguito di immunocolorazione non è stato riportato. Pertanto, l'attuale protocollo mirava a confrontare le misurazioni del carico Aβ tra le regioni complete e secondarie di interesse utilizzando un software di analisi delle immagini, ImageJ.

L'attuale studio ha utilizzato topi maschi doppio transgenico APP/PS1 di 13 mesi, che esprimono un APP chimerico topo/umano e una presenilina 1 mutante, per modellare l'insorgenza precoce di AD¹². I depositi di Aβ iniziano a svilupparsi entro i 6-7 mesi di età e si osserva un abbondante accumulo di Aβ sia nella corteccia che nell'ippocampo di questi topi entro i 9-10 mesi di età di¹² anni. I peptidi amiloidi transgenici e l'oloproteina possono essere rilevati da 6E10-immunocolor¹³, rendendolo un modello animale desiderabile per il presente protocollo. La procedura qui trattata include la preparazione del tessuto cerebrale, l'immunocolorazione di sezioni fluttuanti, l'imaging e la quantificazione del carico di Aβ in intere o sottoregioni di interesse. L'analisi mostra una forte correlazione tra la quantificazione completa e sub-regionale, indicando un robusto accordo tra questi due metodi nelle sezioni del tessuto cerebrale derivate da topi maschi APP / PS1 di 13 mesi che mostrano abbondanti depositi di Aβ.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le risorse animali da laboratorio dell'Università secondo protocolli approvati dall'Università della California, Irvine, Institutional Animal Care and Use Committee. Gli esperimenti sono stati eseguiti con topi maschi B6C3-Tg (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo / Mmjax (APP / PS1) (13 mesi, n = 35). I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione del tessuto cerebrale

1. Anestetizzare i topi utilizzando una dose letale di un anestetico a base di fenitoina/pentobarbital (150 mg/kg) iniettato per via intraperitoneale (vedere Tabella dei materiali) seguendo protocolli animali approvati. Eseguire la perfusione cardiaca con soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (1x PBS) per 5 minuti ad una velocità di 5 ml / min per liberare la vascolarizzazione cerebrale¹⁴.
2. Raccogliere il tessuto cerebrale seguendo il rapporto¹⁵ precedentemente pubblicato, separarlo nell'emisfero cerebrale sinistro e destro e posizionare l'emi-cervello destro di ciascun topo in un tubo conico da 15 ml contenente 5 ml di soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA) appena preparata in 1x PBS per 72 ore a 4 °C.
   NOTA: Il cervello può essere fissato per immersione da 24-72 ore a seconda dell'antigene studiato. L'emi-cervello sinistro, senza il cervelletto, può essere congelato a scatto in azoto liquido e quindi conservato a -80 °C, seguito dall'elaborazione per saggi biochimici come ELISA e rilevamento biochimico Aβ¹⁶.
   ATTENZIONE: il PFA è un probabile cancerogeno e il contatto cutaneo con il PFA può portare a sintomi allergici della pelle. Utilizzare guanti in nitrile o butile, maschere e protezione per gli occhi per maneggiarlo e prepararsi sotto un cappuccio di fumi chimici.
3. Dopo l'incubazione in PFA al 4%, incubare gli emi-cervelli sequenzialmente in 5 ml di soluzioni di saccarosio al 10%, 20% e 30% preparate in 1x PBS per 24 ore, ciascuna a 4 °C fino a quando il tessuto cerebrale affonda sul fondo del tubo conico.
4. Dopo l'incubazione nella soluzione di saccarosio al 30%, rimuovere l'emi-cervello, tamponare delicatamente il cervello su una carta da filtro per rimuovere la soluzione di saccarosio in eccesso e congelare l'emi-cervello fisso in ghiaccio secco in polvere per 30 minuti. Conservare l'emi-cervello congelato in fogli di alluminio ben etichettati a -80 °C fino alla criosezione.
   NOTA: Nel protocollo attuale, gli emi-cervelli sono stati conservati a -80 °C per 6-8 mesi.
5. Sezionare l'emi-cervello congelato in sezioni spesse 20 μm usando un criostato (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Per il protocollo attuale, gli emi-cervelli sono stati sezionati in sezioni sagittali e, se necessario, possono essere preparate anche sezioni coronali¹⁷. La fase 2 riguarda la colorazione immunofluorescente Aβ su campioni di tessuto cerebrale fissi e crioprotetti.

2. Immunofluorescenza

1. Posizionare le sezioni di tessuto cerebrale sagittale (fase 1.5) in una piastra a 24 pozzetti (fino a sei sezioni cerebrali di topo per 300 μL per pozzetto). Lavare per 5 minuti con 1x PBS tre volte a temperatura ambiente (23 °C) posizionando la piastra su uno shaker con un leggero vortice.
2. Incubare le sezioni del tessuto cerebrale con il 70% di acido formico in dH₂0 a temperatura ambiente per 10 min.
   ATTENZIONE: l'acido formico è corrosivo, quindi evitare il contatto con la pelle e gli occhi.
3. Lavare le sezioni di tessuto cerebrale per 5 minuti con dH₂0 tre volte a temperatura ambiente.
4. Blocca il legame non specifico con lo 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) e lo 0,3% di TritonX 100 (vedi Tabella dei materiali) in 1x PBS a temperatura ambiente per 1 ora.
5. Incubare le sezioni del tessuto cerebrale con un anticorpo primario marcato con fluoroforo (6E10, vedi Tabella dei materiali) diluito (1:1000) in 1x PBS contenente lo 0,3% di TritonX 100 a 4 °C per 24 ore.
   NOTA: Poiché l'anticorpo primario è coniugato con fluoroforo, la piastra deve essere coperta da questo passaggio in poi, o tutto il lavoro deve essere fatto in una stanza buia per mantenere l'efficacia del fluoroforo.
6. Lavare le sezioni del tessuto cerebrale per 10 minuti con 1x PBS tre volte a temperatura ambiente.
7. Montare le sezioni del tessuto cerebrale su vetrini caricati positivamente (vedi Tabella dei materiali) che sono ben etichettati (le informazioni sull'etichetta sul vetrino si basano sulla preferenza), dopo un breve lavaggio con dH₂0 per rimuovere i sali rimanenti. Lasciare asciugare all'aria le diapositive al buio.
   NOTA: Le sezioni cerebrali devono essere montate con attenzione per evitare pieghe e strappi, influenzando la quantificazione dei dati. In caso di strappi e/o pieghe che si trovano nella regione di interesse e possono interferire con la quantificazione dei dati, si consiglia di ricolorare e rimontare.
8. Montare le sezioni del tessuto cerebrale con un supporto di montaggio acquoso (vedere Tabella dei materiali) e posizionare il coperchio di vetro sul tessuto. Sigillare le estremità del coperchio con smalto trasparente e conservare i vetrini in una scatola di scorrimento a 4 °C fino all'imaging.
   NOTA: nel protocollo corrente, le diapositive sono state visualizzate entro 1 mese dalla colorazione.

3. Imaging

1. Immagina le sezioni cerebrali macchiate di 6E10 usando un microscopio a fluorescenza (epifluorescenza o confocale) (vedi Tabella dei materiali), che ha un obiettivo 2x per catturare l'intera sezione del tessuto cerebrale in un'unica immagine ed è dotato del filtro appropriato (GFP in questo lavoro).
   NOTA: le impostazioni di imaging devono essere coerenti tra diapositive diverse.
2. Salvare le immagini acquisite come file TIFF o come richiesto e aprirle nel software di analisi delle immagini (vedere Tabella dei materiali) come descritto nel passaggio 4.2 di seguito per la quantificazione 6E10.
   NOTA: includere una barra di scala prima di acquisire l'immagine da quantificare nel software di analisi delle immagini, ImageJ.

4. Analisi dell'intera regione di interesse

NOTA: Le due regioni di interesse del presente lavoro sono l'ippocampo e l'iso-corteccia. L'analisi della regione di interesse completa rappresenta l'analisi dell'intera iso-corteccia (indicata come la corteccia in avanti) o dell'ippocampo nella sezione del tessuto cerebrale ripreso.

1. Scaricare il software di analisi delle immagini (vedere Tabella dei materiali) e avviare il software una volta installato.
2. Una volta eseguito il software, fare clic su File | Apri | Scegli l'immagine da analizzare.
3. Clicca su Analizza | Imposta scala| Fare clic per rimuovere la scala. Selezionate lo strumento Diritto dalla barra degli strumenti del software e disegnate una linea retta lungo la lunghezza della barra della scala. Clicca su Analizza | Misura. Osservate la lunghezza o la distanza della barra della scala in pixel. Clicca su Analizza | Imposta scala.
   1. Nella finestra pop-up, inserisci la distanza in pixel, la distanza nota della barra della scala (in μm in questo caso) e l'unità di lunghezza come μm. Selezionare Globale per applicare la nuova impostazione di scala a tutte le immagini seguenti se vengono elaborate più immagini. Fare clic su OK per applicare le impostazioni.
      NOTA: Si consiglia sempre di verificare se la scala accurata viene applicata all'immagine prima di ulteriori analisi.
4. Per impostare la misurazione desiderata sull'area della sezione, vai ad Analizza | Impostare le misure | Selezionare le caselle Area ed Etichetta di visualizzazione. Verificare che l'immagine analizzata sia selezionata in Reindirizza a.
5. Per facilitare la visualizzazione dell'ippocampo o della corteccia, vai a Immagine | Regolare | Luminosità/Contrasto. Trascinare gradualmente la barra di scorrimento Massimo verso sinistra per aumentare la chiarezza dei tessuti fino a quando le regioni cerebrali di interesse non sono identificabili.
   NOTA: non applicare questa impostazione per evitare false misurazioni durante l'analisi, ma procedere al passaggio successivo.
6. Utilizzare lo strumento selezione poligono o selezione a mano libera per delineare la regione dell'ippocampo. Fare clic sull'opzione Ripristina delle impostazioni luminosità / contrasto una volta che l'ippocampo è delineato per tornare alla luminosità originale.
   NOTA: I passaggi devono essere ripetuti separatamente per la regione corticale.
7. Per misurare l'area totale del tessuto della regione selezionata, fare clic su Modifica | Chiaro all'esterno. Una volta che la regione selezionata è l'unica immagine sullo schermo, fai clic su Analizza | Misurare per ottenere l'area totale del tessuto analizzata in una finestra pop-up. Salvare i dati in un file Excel per un utilizzo successivo.
8. Per misurare l'area positiva 6E10, vai a Immagine | Regolare | Soglia di colore. Un filtro predefinito con il metodo Thresholding di solito fornisce i risultati desiderati evidenziando i segnali più forti in rosso.
   NOTA: la selezione ottimale della soglia dipenderà dallo sfondo dell'immagine e dall'intensità della colorazione. Selezionare un'impostazione di soglia che raccolga la macchia e non lo sfondo.
9. Dopo aver selezionato la soglia appropriata, selezionare Sfondo scuro. Questo evidenzierà le macchie Aβ (la macchia di interesse) su uno sfondo nero. Clicca su Seleziona | | originali Selezionare, dando i segnali scuri (i depositi Aβ) su uno sfondo bianco. Clicca su Analizza | Analizza le particelle e fai clic su OK quando viene generata la finestra pop-up.
10. Copia l'output di riepilogo generato dal software facendo clic su Modifica | Copia. Incolla nel file Excel avviato in precedenza con le rispettive etichette. Questa è l'area 6E10-positiva nelle regioni di interesse selezionate (ippocampo o corteccia).
    NOTA: in Excel, ci sarà una colonna per l'area totale 6E10-positiva (passaggio 4.10) e l'area totale del tessuto (passaggio 4.7).
11. Calcolare l'area 6E10-positiva (%) come segue¹⁶: (Area totale 6E10 positiva/Area totale del tessuto analizzata) x 100.

5. Analisi delle sottoregioni di interesse

NOTA: L'analisi della sottoregione di interesse rappresenta l'analisi di una parte della corteccia o dell'ippocampo nella sezione del tessuto cerebrale ripreso.

1. Scarica il software di analisi delle immagini e avvia il software una volta installato.
2. Una volta eseguito il software, fare clic su File | Apri | Scegli l'immagine da analizzare.
3. Clicca su Analizza | Imposta scala| Fare clic per rimuovere la scala. Selezionate lo strumento Dritto dalla barra degli strumenti del software e disegnate una linea retta lungo la lunghezza della barra della scala. Clicca su Analizza | Misura. Osservate la lunghezza o la distanza della barra della scala in pixel. Clicca su Analizza | Imposta scala.
   1. Nella finestra pop-up, inserisci la distanza in pixel, la distanza nota della barra della scala (in μm in questo caso) e inserisci l'unità di lunghezza come μm. Selezionare Globale per applicare la nuova impostazione di scala a tutte le immagini seguenti se vengono elaborate più immagini. Fare clic su OK per applicare le impostazioni.
      NOTA: Si consiglia sempre di verificare se la scala accurata viene applicata all'immagine prima di ulteriori analisi.
4. Per impostare la misurazione desiderata sull'area della sezione, vai ad Analizza | Impostare le misure | selezionare le caselle Area ed Etichetta di visualizzazione. Verificare che l'immagine analizzata sia selezionata in Reindirizza a.
5. Regola la luminosità e il contrasto se l'immagine è troppo debole e le regioni del cervello (ad esempio, l'ippocampo o la corteccia in questo caso) non possono essere facilmente identificate. Utilizzare la barra degli strumenti del software e fare clic su Immagine | Regolare | Luminosità/Contrasto e trascina i cursori Massimo verso sinistra in base alle esigenze per aumentare la visibilità del tessuto.
   NOTA: non applicare questa impostazione per evitare false misurazioni durante l'analisi, ma procedere al passaggio successivo.
6. Utilizzando lo strumento Rettangolo, selezionare la regione di interesse nella corteccia o nell'ippocampo. Usa la barra degli strumenti e fai clic su Modifica | | di selezione Specificare, modificando l'altezza e la larghezza in un valore predefinito. Regola la scatola, in modo che sia completamente coperta da tessuto. Ripristina la luminosità/contrasto per tornare alla luminosità originale.
   NOTA: la dimensione della casella utilizzata per selezionare le regioni di interesse deve essere coerente per tutte le immagini. Per la presente analisi, la dimensione della scatola era di 300 pixel x 300 pixel (equivalente a 1177 μm x 1177 μm) o 400 pixel x 200 pixel (equivalente a 1569 μm x 784 μm).
7. Duplica l'area di interesse selezionata facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla casella e facendo clic su Duplica. Si aprirà una nuova finestra con la regione selezionata. Rinominare l'immagine duplicata per visualizzare la regione in cui si trova (ad esempio, corteccia o ippocampo).
8. Regola il tipo di immagine duplicata utilizzando la barra degli strumenti e facendo clic su Immagine | Tipo | 8-Bit per convertire l'immagine RGB duplicata in 8-bit per analizzare al meglio le placche. Inverti l'immagine cliccando su Modifica | Invertire.
9. Per misurare l'area positiva 6E10, vai a Immagine | Regolare | Soglia. Un filtro predefinito con il metodo Thresholding di solito fornisce i risultati desiderati evidenziando i segnali più forti in rosso.
   NOTA: la selezione ottimale della soglia dipenderà dallo sfondo dell'immagine e dall'intensità della colorazione. Selezionare un'impostazione di soglia che raccolga la macchia e non lo sfondo.
10. Dopo aver selezionato la soglia appropriata, selezionare Applica.
11. Per analizzare l'area 6E10-positiva, utilizzare la barra degli strumenti e fare clic su Analizza | Analizza le particelle, assicurandoti che il "Riepiloga risultati" sia controllato.
12. Copia l'output di riepilogo con la %Area generata dal software facendo clic su Modifica | Copia. Incolla nel file Excel avviato in precedenza con le rispettive etichette.
13. Ripetere i passaggi 5.3-5.12 per le diverse regioni del tessuto. Assicurati che il posizionamento di ogni casella per delineare la regione di interesse sia coerente tra ogni immagine.
    NOTA: lo strumento di rotazione può essere utilizzato se le dimensioni della casella degli strumenti Rettangolo non possono adattarsi alla regione specificata a causa della curvatura del tessuto.
14. Per ruotare il rettangolo, utilizzare la barra degli strumenti e fare clic su Modifica | | di selezione Ruotare e regolare il grado di rotazione in base alle esigenze. Duplica l'immagine come indicato nel passaggio 5.7 e cancella l'esterno utilizzando la barra degli strumenti e facendo clic su Modifica | Chiaro all'esterno, che cancella le macchie 6E10 al di fuori del rettangolo specificato. Procedere con il passaggio 5.8 descritto sopra.

Risultati

Qui, vengono confrontati due diversi metodi per quantificare l'area 6E10-positiva nell'ippocampo e nella corteccia dei tessuti cerebrali del topo. I due metodi sono le analisi dell'intera regione e della sottoregione di interesse (Figura 1). L'analisi dell'intera regione di interesse, come suggerisce il nome, comporta la delineazione dell'intera regione di interesse (in questo caso, l'iso-corteccia o l'ippocampo) per determinare l'area 6E10-positiva (Figura 1A,B). L'analisi della sottoregione di interesse comporta la selezione di una regione predefinita all'interno della regione di interesse per determinare l'area positiva 6E10 (Figura 1C, D). Il protocollo Graduale ImageJ per i due metodi è illustrato nella Figura 2, nella Figura 3 e nella Figura 4.

Questo studio ha utilizzato tre lettori; due lettori indipendenti hanno eseguito l'analisi della sottoregione di interesse e il terzo lettore ha eseguito l'analisi dell'intera regione di interesse. Come si è visto nella Figura 5A,B, c'è stata una forte correlazione positiva significativa (p < 0,0001) tra l'area 6E10-positiva riportata dai due lettori che eseguono l'analisi della sottoregione di interesse (coefficiente di correlazione di Pearson r = 0,97 per la corteccia e r = 0,96 per l'ippocampo). Le aree 6E10-positive riportate dai due lettori per l'analisi della sub-regione di interesse sono state mediate, e la sotto-regione di interesse mediata 6E10-area positiva ha condiviso una forte correlazione positiva significativa (p < 0,0001) con l'area 6E10-positiva ottenuta utilizzando l'analisi della regione di interesse completa per entrambe le cortesi (coefficiente di correlazione di Pearson r = 0,96; Figura 5C) e l'ippocampo (coefficiente di correlazione di Pearson r = 0,95; Figura 5D). L'area corticale e ippocampale-6E10-positiva media ottenuta dalle analisi dell'intera regione e sottoregione di interesse era comparabile senza differenze significative, confermando l'accordo tra i due metodi (Figura 5E). Inoltre, l'Aβ1-42 insolubile è stato misurato in omogeneizzati dell'intero cervello in un sottogruppo di topi e l'area corticale (Figura 5F) e ippocampale (Figura 5G) 6E10 positiva determinata dall'analisi dell'intera regione di interesse era significativamente correlata (p < 0,01) correlata con il carico insolubile di Aβ1-42 utilizzando ELISA (vedi Tabella dei materiali).

Figura 1: Selezione di intere e sottoregioni di interesse. Immagini rappresentative che mostrano l'iso-corteccia completa (corteccia) e l'ippocampo delineati per l'analisi dell'intera regione di interesse in (A) e (B), rispettivamente. Le immagini rappresentative mostrano la selezione di sottoregioni della corteccia e dell'ippocampo per l'analisi della sottoregione di interesse in (C) e (D), rispettivamente. Barra della scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Protocollo per la quantificazione dell'area 6E10 positiva per l'intera regione di interesse. Fasi di analisi dell'immagine che mostrano l'immagine originale (A), l'immagine dopo la regolazione della luminosità/contrasto (B), la selezione dell'area di interesse (C), la cancellazione (D), la regolazione della soglia (E) e l'immagine finale pronta per l'analisi (F). I numeri nella figura indicano i numeri di passo nel protocollo. Barra della scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Protocollo per la sottoregione di interesse Quantificazione dell'area positiva 6E10. Fasi di analisi dell'immagine che mostrano l'immagine originale (A), l'immagine dopo la regolazione della luminosità/contrasto (B), la selezione dell'area di interesse (C), la duplicazione dell'immagine della regione di interesse (D), la modifica dell'immagine a 8 bit e l'inversione dell'immagine (E), la regolazione della soglia (F) e l'immagine finale pronta per l'analisi (G). I numeri nella figura indicano i numeri di passo nel protocollo. Barra della scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Protocollo per la rotazione della regione di interesse. Fasi di analisi dell'immagine che mostrano la selezione dell'area di interesse e la rotazione della casella di selezione per adattarsi alla curvatura del tessuto (A), l'immagine della regione di interesse dopo la duplicazione (B) e l'immagine dopo aver cancellato l'area esterna (non regione di interesse) (C). I numeri nella figura indicano il numero di passo nel protocollo. Barra della scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Correlazione tra le analisi complete e le sottoregioni di interesse. I grafici a dispersione mostrano la correlazione tra l'area 6E10-positiva da parte dei due lettori indipendenti che eseguono l'analisi della sottoregione di interesse per la corteccia (A) e l'ippocampo (B). Si osserva una forte correlazione positiva tra l'area 6E10-positiva risultante dall'analisi della sub-regione di interesse e l'analisi della regione di interesse completa sia per la corteccia (C) che per l'ippocampo (D). Non vi è alcuna differenza statisticamente significativa nell'area media 6E10-positiva per l'intera regione di interesse e la sub-regione di interesse analisi nella corteccia e nell'ippocampo (E). Una correlazione significativa è osservata tra le misurazioni Aβ1-42 insolubili di omogeneizzato dell'intero cervello utilizzando ELISA e l'analisi dell'intera regione di interesse sia per la corteccia (F) che per l'ippocampo (G). I dati sono stati analizzati utilizzando il coefficiente di correlazione di Pearson, r, in (A-D) e (F-G), e utilizzando misure ripetute bidirezionali ANOVA in (E) utilizzando un software di grafici e statistiche. I dati sono presentati come ± errore standard medio (SEM) di n = 35 topi in (E), e un p a due code < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo qui descritto delinea la procedura per la preparazione dell'emi-cervello per il sezionamento sagittale, la colorazione immunofluorescente dei depositi di Aβ utilizzando l'anticorpo 6E10 su sezioni fluttuanti, l'imaging delle sezioni cerebrali macchiate di Aβ seguito dalla quantificazione dei depositi di Aβ nella corteccia e nell'ippocampo del tessuto cerebrale di topo utilizzando un software di analisi delle immagini. Mentre ci sono protocolli pubblicati per quantificare il carico di Aβ nelle sezioni ^8,10 del tessuto cerebrale, questo protocollo descrive i passaggi coinvolti nella quantificazione del carico di Aβ nell'intera iso-corteccia (indicata come corteccia) e ippocampo rispetto al carico Aβ in una sottoregione di interesse nella corteccia e nell'ippocampo, quando questo può essere desiderato. Viene inoltre fornita la correlazione tra le analisi delle intere e delle sottoregioni di interesse.

Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo. In primo luogo, il protocollo descritto è per sezioni di tessuto cerebrale spesse 20 μm sottoposte a immunocolorazione fluttuante, che si traduce in una penetrazione ottimale degli anticorpi all'interno della sezione^{tissutale 18}. La tecnica del flottante può richiedere il trasferimento manuale delle sezioni tissutali tra le diverse soluzioni durante la colorazione immunofluorescente e un'attenta manipolazione delle sezioni tissutali durante la procedura. Ciò è particolarmente importante quando le sezioni tissutali sono immerse nella soluzione di acido formico al 70% per il recupero dell'antigene nel protocollo corrente, aumentando la fragilità dei tessuti per le sezioni sottili. Approcci alternativi al protocollo descritto includono l'uso di sezioni di tessuto più spesse (ad esempio, 30-40 μm) o l'utilizzo di sezioni di tessuto che sono direttamente montate su vetrini caricati positivamente prima della colorazione immunofluorescente. In secondo luogo, il protocollo qui descritto utilizza un anticorpo 6E10 marcato fluorescentemente. Oltre a utilizzare l'anticorpo 6E10 marcato con fluorescenza, gli anticorpi 6E10 non fluorescenti (ad esempio, l'anticorpo 6E10 coniugato con perossidasi di rafano) possono anche essere utilizzati per rilevare il carico di Aβ nelle sezioni del tessuto cerebrale e l'attuale protocollo può essere adattato per quantificare le macchie immunochimiche Aβ-positive nelle sezioni del tessuto cerebrale come descritto in precedenza⁸ . In terzo luogo, l'accuratezza dei risultati per la quantificazione del carico Aβ dipenderà dalla selezione della soglia appropriata nel software di analisi, che dipende dal background del tessuto e dall'intensità del segnale. La selezione della soglia deve essere eseguita dall'utente finale in modo tale che solo le macchie Aβ-positive siano selezionate per la quantificazione. L'intervento dell'utente finale è necessario per ottimizzare la soglia specifica che può essere applicata a tutte le immagini per garantire l'accuratezza dell'impostazione della soglia. In quarto luogo, poiché l'analisi della sottoregione di interesse richiede la selezione di una piccola regione di interesse nella sezione tissue, per questa analisi sono stati utilizzati due lettori indipendenti. Per mantenere l'indipendenza e l'accecamento durante la raccolta dei dati, tutte le immagini sono state codificate numericamente; la sequenza di analisi delle immagini è stata randomizzata tra i lettori in modo tale che i diversi lettori analizzassero immagini diverse in un dato momento e i dati sono stati inviati alla fine di ogni settimana. A causa della maggiore probabilità di variabilità tra lettori nella selezione della regione di interesse nell'analisi della sottoregione di interesse, i lettori sono stati addestrati utilizzando diverse immagini campione per ottimizzare la selezione della regione nella corteccia e nell'ippocampo prima di iniziare la raccolta dei dati. Questa formazione è fondamentale per ridurre la variabilità tra lettori e, come si può vedere (Figura 5A, B), l'area 6E10-positiva riportata da entrambi i lettori mostra un forte accordo relativo nel presente studio.

L'attuale protocollo e i risultati forniscono preziose informazioni sull'impatto della dimensione della regione di interesse sulla quantificazione dell'area Aβ-positiva. Si prevede che una regione di interesse più ampia rappresenti il tessuto più di una regione di interesse più piccola. Pertanto, il campionamento di un tessuto più grande è auspicabile per quantificare con precisione il carico di Aβ nei tessuti. Tuttavia, nel caso di distribuzione omogenea del carico Aβ all'interno del tessuto, una regione di campionamento più piccola è generalmente considerata una buona rappresentazione del tessuto più grande in analisi. Gli attuali risultati dello studio lo confermano, e il carico di Aβ nell'intera corteccia e nell'ippocampo era un forte correlato del carico di Aβ in una sottoregione selezionata della corteccia e dell'ippocampo (Figura 5C, D). Per confermare ulteriormente l'accordo tra le analisi complete e le sottoregioni di interesse, è stata confrontata l'area media 6E10-positiva nella corteccia e nell'ippocampo e non è stata trovata alcuna differenza tra i due metodi (Figura 5E). Ciò conferma che uno di questi metodi (analisi completa o sub-regione) produce misurazioni del carico Aβ comparabili.

Il protocollo attuale presenta alcune limitazioni. I due metodi (analisi dell'intera regione rispetto alla sottoregione) potrebbero non essere sempre utilizzati in modo intercambiabile. La scelta di utilizzare l'analisi completa o sub-regione dipenderà dalla distribuzione regionale di Aβ all'interno del tessuto, che è influenzata dall'età, dal sesso e dal ceppo del modello murino AD. A 13 mesi, il carico di Aβ è distribuito in tutta la corteccia e l'ippocampo dei topi APP/PS1. Tuttavia, a 6 mesi, i depositi di Aβ sono limitati alla corteccia e si osservano depositi minimi nell'ippocampo¹². In tali condizioni, l'analisi dell'intera regione di interesse può essere l'approccio desiderato per aumentare l'area di campionamento dei tessuti e quindi il segnale Aβ. D'altra parte, l'analisi della sottoregione può essere il metodo di scelta quando il carico di Aβ in una specifica regione del cervello è di interesse (ad esempio, la corteccia somatosensoriale). Inoltre, a 13 mesi, i topi maschi APP / PS1 mostrano intense macchie 6E10 positive e la colorazione immunofluorescente si traduce in un segnale eccellente con uno sfondo molto basso, rendendo l'attuale protocollo molto adatto per la quantificazione nelle condizioni date. Non è chiaro se questo metodo di quantificazione possa essere applicato con successo a colorazioni meno intense e sarà necessario un lavoro futuro per rispondere a questa domanda. Il metodo di quantificazione immunofluorescente e di immagine qui presentato rileva tutte le forme di Aβ, compresa la forma precursore¹³. Di conseguenza, se c'è un interesse per la rilevazione di una specifica specie di Aβ (ad esempio, Aβ1-40 o Aβ1-42), possono essere utilizzati anticorpi specifici per queste isoforme Aβ. Pertanto, sebbene il metodo di colorazione e rilevamento immunofluorescente 6E10 fosse correlato alle misurazioni delle misurazioni di Aβ1-42 in omogeneizzati dell'intero cervello utilizzando ELISA (Figura 5F, G), la correlazione era solo modesta. Ciò può essere attribuito alla misurazione di solo Aβ1-42 utilizzando l'ELISA e al rilevamento di tutte le specie Aβ utilizzando l'immunocolorazione 6E10. Il presente studio utilizza tre lettori per valutare l'accordo e la correlazione tra le analisi complete e sub-regionali. Avere lettori aggiuntivi può migliorare la robustezza dello studio e può convalidare ulteriormente gli accordi tra i due metodi qui presentati. Inoltre, usiamo la correlazione di Pearson come misura dell'accordo, che è ampiamente utilizzata tra gli altri metodi per descrivere l'accordo tra variabili continue¹⁹. Tuttavia, una limitazione dell'utilizzo della correlazione di Pearson per determinare l'accordo è che i due metodi utilizzati nel presente documento possono fornire risultati correlati, ma un metodo può comportare valori complessivamente più elevati rispetto all'altro a causa di distorsioni sistematiche. Pertanto, la correlazione di Pearson è una buona misura dell'accordo relativo¹⁹. Per aumentare la robustezza del protocollo, è possibile utilizzare metodi aggiuntivi per confermare l'accordo assoluto, come il confronto dell'area media 6E10-positiva con i due metodi (Figura 5E)¹⁹. Nel complesso, l'attuale protocollo confronta il carico di Aβ rilevato dalla colorazione immunofluorescente e analizza le regioni complete e secondarie di interesse nelle sezioni del tessuto cerebrale. I risultati mostrano una forte correlazione tra questi due metodi per le sezioni di tessuto cerebrale derivate da topi maschi APP / PS1 di 13 mesi che mostrano abbondanti depositi di Aβ.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette coniche da 15 mL	ThermoFisher Scientific, MA, USA	339650
Piastre a 24 pozzetti	Fisher Scientific, NH, USA	FB012929
Kit ELISA umano per beta amiloide 42	ThermoFisher Scientific, MA, USA	KHB3441
Terreni di montaggio acquosi	Vector laboratories, CA, USA	H-5501-60
Albumina	sierica bovinaSigmaaldrich, MO, USA	A2153-50G
BZ-X710 Microscopio a fluorescenza all-in-one	Keyence Keyence, IL, USA	BZ-X710
Chiodo chiaro poilsh	Preferenza dell'utente	NA
Cryostat	Leica Biosystems, IL, USA	Leica CM1860 Cryostat
Acido formico	Sigmaaldrich, MO, USA	F0507-500ML
Vetrini coprioggetti	VWR, PA, USA	48393-081
GraphPad Prism	GraphPad Software, CA, USA	Versione 8
ImageJ 1.51k	National Institutes of Health, MD, USA	Versione 1.53e
Topi	Jackson Laboratories, ME, USA	034829-JAX
Paraformaldeide	Sigmaaldrich, MO, USA	P6148-500G
Fenitoina/ anestetico a base di pentobarbital (Euthasol)	Patterson Veterinary, MA, USA	07-805-9296
Soluzione salina tamponata con fosfato	Fisher Scientific,  NH, USA	BP661-50
Plus (+) vetrini per microscopio	Ted Pella, Inc., CA, USA	260100
Anticorpo primario (6E10)	Biolegend, CA, USA	803013
Saccarosio	Sigmaaldrich, MO, USA	47289
Triton X 100	Sigmaaldrich, MO, USA	T8787-100ML