Microscopia subcellulare intravitale della ghiandola mammaria

Yeap Ng; Andrius Masedunskas; Marco Heydecker; Seham Ebrahim; Roberto Weigert; Ian H. Mather

doi:10.3791/63674

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Articolo metodologico

Microscopia subcellulare intravitale della ghiandola mammaria

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DOI:

10.3791/63674

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24 giugno 2022

Yeap Ng¹ , Andrius Masedunskas¹^,² , Marco Heydecker¹ , Seham Ebrahim¹^,³ , Roberto Weigert¹ , Ian H. Mather¹

¹Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, ²Charles Perkins Centre, Central Clinical School, Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, ³Department of Molecular Physiology and Biological Physics, School of Medicine, University of Virginia

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive una tecnica semplice per l'imaging intravitale della ghiandola mammaria del topo in allattamento mediante microscopia confocale e multifotonica a scansione laser.

Abstract

La ghiandola mammaria costituisce un modello per eccellenza per lo studio delle funzioni epiteliali, tra cui il rimodellamento dei tessuti, la polarità cellulare e i meccanismi secretori. Durante la gravidanza, la ghiandola si espande da un albero duttale primitivo incorporato in un cuscinetto adiposo a una rete alveolare altamente ramificata innescata per la formazione e la secrezione di colostro e latte. Dopo il parto, la ghiandola fornisce tutti i nutrienti necessari per la sopravvivenza neonatale, comprese le goccioline lipidiche rivestite di membrana (LD), le proteine, i carboidrati, gli ioni e l'acqua. Vari componenti del latte, tra cui il lattosio, le micelle di caseina e le proteine del latte scremato, sono sintetizzati all'interno delle cellule alveolari e secreti dalle vescicole per esocitosi sulla superficie apicale. Le LD vengono trasportate dai siti di sintesi nel reticolo endoplasmatico ruvido all'apice cellulare, rivestite di membrane cellulari e secrete da un meccanismo apocrino unico. Altri costituenti preformati, inclusi anticorpi e ormoni, vengono trasportati dal lato sieroso dell'epitelio nel latte mediante transcitosi. Questi processi sono suscettibili di microscopia intravitale perché la ghiandola mammaria è una ghiandola cutanea e, quindi, direttamente accessibile alla manipolazione sperimentale. In questo articolo, viene descritta una procedura semplice per studiare la cinetica della secrezione di LD in situ, in tempo reale, in topi vivi anestetizzati. Il boro-dipirrometene (BODIPY)_665/676 o il monodansilpentano sono utilizzati per marcare la frazione lipidica neutra dei topi transgenici, che esprimono EGFP solubile (proteina fluorescente verde potenziata) nel citoplasma o un peptide mirato alla membrana fuso con EGFP o tdTomato. Le proteine di fusione marcate con membrana fungono da marcatori delle superfici cellulari e i coloranti lipidici risolvono le LD ≥ 0,7 μm. Le immagini time-lapse possono essere registrate con la microscopia confocale a scansione laser standard fino a una profondità di 15-25 μm o con la microscopia multifotone per l'imaging più profondo nel tessuto. La ghiandola mammaria può essere bagnata con agenti farmacologici o coloranti fluorescenti durante l'intervento chirurgico, fornendo una piattaforma per manipolazioni sperimentali acute secondo necessità.

Introduzione

La microscopia intravitale della ghiandola mammaria di topo sta attirando sempre più attenzione come metodo potente per analizzare un'intera gamma di fenomeni biologici, tra cui l'origine e la differenziazione delle cellule staminali ^1,2, la progressione dei tumori metastatici ^3,4,5 e il ruolo dei macrofagi duttali durante lo sviluppo e l'involuzione mammaria⁶. Attraverso lo sviluppo della microscopia subcellulare intravitale (ISMic)⁷, l....