Valutazione della funzione mitocondriale nel nervo sciatico mediante respirometria ad alta risoluzione

Summary

La respirometria ad alta risoluzione accoppiata a sensori di fluorescenza determina il consumo di ossigeno mitocondriale e la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Il presente protocollo descrive una tecnica per valutare le frequenze respiratorie mitocondriali e la produzione di ROS nel nervo sciatico permeabilizzato.

Abstract

La disfunzione mitocondriale nei nervi periferici accompagna diverse malattie associate alla neuropatia periferica, che può essere innescata da molteplici cause, tra cui malattie autoimmuni, diabete, infezioni, disturbi ereditari e tumori. Valutare la funzione mitocondriale nei nervi periferici del topo può essere difficile a causa delle piccole dimensioni del campione, di un numero limitato di mitocondri presenti nel tessuto e della presenza di una guaina mielinica. La tecnica descritta in questo lavoro minimizza queste sfide utilizzando un protocollo di permeabilizzazione unico adattato da quello utilizzato per le fibre muscolari, per valutare la funzione mitocondriale del nervo sciatico invece di isolare i mitocondri dal tessuto. Misurando la produzione di specie reattive fluorimetriche con Amplex Red/Peroxidase e confrontando diversi substrati e inibitori mitocondriali nei nervi permeabilizzati alla saponina, è stato possibile rilevare contemporaneamente gli stati respiratori mitocondriali, le specie reattive dell'ossigeno (ROS) e l'attività dei complessi mitocondriali. Pertanto, il metodo qui presentato offre vantaggi rispetto alla valutazione della funzione mitocondriale con altre tecniche.

Introduction

I mitocondri sono essenziali per mantenere la vitalità cellulare e svolgono numerose funzioni cellulari come il metabolismo energetico (vie metaboliche di glucosio, amminoacidi, lipidi e nucleotidi). Come sito primario della produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), i mitocondri sono centrali in diversi processi di segnalazione cellulare come l'apoptosi e partecipano alla sintesi di cluster ferro-zolfo (Fe-S), all'importazione e alla maturazione delle proteine mitocondriali e al mantenimento del loro genoma e dei ribosomi ^1,2,3. La rete dinamica della membrana mitoco....

Protocol

Il presente protocollo è approvato dal Comitato etico sull'uso degli animali nella ricerca, CCS / UFRJ (CEUA-101/19) e dalle linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso di animali da esperimento. Il nervo sciatico è isolato da topi maschi C57BL/6 di quattro mesi, eutanasia per lussazione cervicale secondo le linee guida istituzionali. I passaggi del protocollo sono ottimizzati per evitare il deterioramento mitocondriale. Pertanto, in questo protocollo, la calibrazione dei sensori polarografici di ossigeno è stata eseguita prima della dissezione e permeabilizzazione del tessuto nervoso sciatico del topo.

1. Prepar....

Results

Il consumo di ossigeno mitocondriale da parte del nervo sciatico permeabilizzato è rappresentato nella Figura 2. La traccia rossa rappresenta il flusso di O₂ per unità di massa in pmol/s.mg. Dopo aver registrato un consumo basale di ossigeno con substrati endogeni (respirazione di routine), il succinato (SUCC) viene iniettato per registrare la respirazione guidata dal complesso II (succinato deidrogenasi), con conseguente aumento del tasso di consumo di ossigeno. In sequenza, vien.......

Discussion

Diverse malattie o condizioni che accompagnano le neuropatie hanno la disfunzione mitocondriale come fattore di rischio. La valutazione della funzione mitocondriale nei nervi periferici è essenziale per chiarire come agiscono i mitocondri in queste condizioni neurodegenerative. La valutazione della funzione mitocondriale è laboriosa a causa della difficoltà del metodo di isolamento e della scarsità di materiale. Pertanto, lo sviluppo di tecniche di permeabilizzazione dei tessuti che non richiedono l'isolamento dei mitoco.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosina 5' trifosfato sale disodico idrato	Sigma-Aldrich	A26209
Adenosina 5′-difosfato sale sodico	Sigma-Aldrich	A2754
Amplex Red Reagente	Thermo Fisher scientific	A12222	Amplex Red è preparato in DMSO in conformità con la scheda tecnica del prodotto
Antimicina A (da Streptomyces sp.)	Sigma-Aldrich	A8674
albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A7030	frazione di shock termico, priva di proteasi, priva di acidi grassi, essenzialmente priva di globuline, pH 7, ≥ 98%
Carbonato di calcio	Sigma-Aldrich	C6763
Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)fenilidrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Citocromo c	Sigma-Aldrich	C7752	(da cuore equino; piccola emeproteina)
DataLab versione 5.1.1.91	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria		Copyright (c) 2002 - 13 del Dr. Erich Gnaiger
Agitatore orbitale digitale per micropiastre 120V	Thermo Fisher scientific	88882005
DL-Ditiotreitolo	Sigma-Aldrich	43819
EGTA sale sodico	Sigma-Aldrich	E8145
Siringa Hamilton	Sigma-Aldrich	HAM80075	10 uL, 25 uL e 50 uL
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Idrogeno soluzione di perossido 30% p/p	Merck	H1009
Imidazolo	Sigma-Aldrich	I2399
L-(−)-Acido malico	Sigma-Aldrich	M7397
Cloruro di magnesio esaidrato	Sigma-Aldrich	M2393
MES sale sodico	Sigma-Aldrich	M3885
Pinza per microdissezione, curva	Sigma-Aldrich	F4142
Pinza per microdissezione, diritta	Sigma-Aldrich	F4017
O2K - Set di filtri Amplex Red	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44321-01	Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometria: produzione di HRR e H2O2 nei mitocondri cerebrali di topo. Rete fisiologica mitocondrale 17.17.
O2K - Fluorescenza LED2 - componente del modulo Sensore di fluorescenza Verde	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44210-01
Oligomicina	Sigma-Aldrich	O4876	(da Streptomyces diastatochromogenes; miscela di oligomicine A, B e C
OROBOROS Oxygraph-2k	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)	Sigma-Aldrich	P4509
Perossidasi da rafano	Sigma-Aldrich	P8375
Piastre di Petri, polistirene	MERCK	P5606
Fosfocreatina sale disodico idrato	Sigma-Aldrich	P7936
Diidrogeno fosfato di potassio monobasico	Sigma-Aldrich	PHR1330
Idrossido di	potassioSigma-Aldrich	221473
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Saponina	Sigma-Aldrich	SAE0073
Piruvato di sodio	Sigma-Aldrich	P5280
Succinato di sodio bibasico esaidrato	Sigma-Aldrich	S2378
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S9378
Taurina	Sigma-Aldrich	T0625