Metodologia per testare agenti di controllo e insetticidi contro la bacca di caffè Borer Hypothenemus hampei

La piralide delle bacche di caffè (CBB), Hypothenemus hampei, è stata rilevata per la prima volta nel 1988 in Colombia e da allora è diventata la specie di parassiti più importante del raccolto di caffè. Le femmine di CBB lasciano il frutto natale già fecondato, cercando nuovi frutti guidati dalle sostanze chimiche volatili che emettono ^1,2. Un ciclo completo viene eseguito entro 23 giorni³ ad una temperatura di 25 °C. Il ciclo inizia con la femmina fondatrice che penetra nel seme e depone le uova nell'endosperma del frutto. Le larve eclosed mangiano il seme. Se i frutti vengono sezionati a questo punto, sarebbe possibile osservare sia la femmina fondatrice che la sua prole. Dopo 14 giorni, le larve diventano pupe-generalmente, lo stadio delle pupe dura 5 giorni. Nella fase adulta, le femmine copulano con i loro fratelli e le femmine appena fecondate volano via dai frutti danneggiati alla ricerca di nuovi frutti di caffè per iniziare un nuovo ciclo⁴.

Sia il processo di penetrazione che il risultato dell'alimentazione larvale danneggiano il seme del caffè, diminuendo la qualità della bevanda a base di caffè e riducendo significativamente le entrate; un'infestazione superiore al 5% nelle piantagioni di caffè è generalmente considerata la soglia economica.

Il controllo CBB si basa su una strategia di gestione integrata dei parassiti (IPM), che comprende il controllo culturale e le pratiche agronomiche, gli agenti biologici naturali e l'uso di insetticidi chimici, che richiede condizioni di sicurezza e un'applicazione tempestiva⁴.

Per valutare nuovi insetticidi per il controllo della CBB, sono necessarie metodologie a basso costo che consentano di ottenere risultati rapidi. Attualmente sono in uso sia procedure di laboratorio che sul campo, comprese diete artificiali contenenti caffè in cui gli insetticidi sono incorporati ^5,6 o spruzzare gli insetticidi sul caffè secco di pergamena ^7,8,9. Inoltre, sono stati riportati esperimenti effettuati sul campo utilizzando rami di alberi di caffè ricoperti di manicotti entomologici^10,11; tuttavia, questi metodi richiedono un lavoro intenso e lunghi periodi di valutazione.

Una condizione che assomiglia alle condizioni naturali del campo, che è anche veloce e poco costosa, è l'uso di frutta di caffè verde o matura. Tuttavia, questi frutti devono essere mantenuti in condizioni idonee allo sviluppo della CBB, evitando alterazioni e contaminanti da parte di microrganismi per mantenerne la qualità e le proprietà. A tal fine, sono stati utilizzati diversi disinfettanti, nonché procedure che coinvolgono calore e radiazioni 7,9,12,13,14,15,16.

Inoltre, i metodi per la valutazione degli insetticidi contro la CBB richiedono simulazioni di femmine adulte che volano alla ricerca di frutti o penetrano in quei frutti^17,18. Per questo, sono state effettuate infestazioni artificiali da frutta nel campo ^8,11,19, sebbene questo processo sia laborioso e dipenda dalle condizioni ambientali.

Qui, descriviamo una metodologia standardizzata per la valutazione di prodotti che possono avere effetti diversi sul CBB in condizioni ambientali controllate che assomigliano a condizioni di campo.

NOTA: Questo protocollo affronta diversi metodi per identificare diversi effetti sul CBB in condizioni di laboratorio.

1. Raccolta della frutta

1. Scegli GF con un'età evolutiva di ~ 120-150 giorni dopo la fioritura dagli alberi in una piantagione di caffè al mattino presto.

2. Disinfezione della frutta²⁰

1. Porta circa 300 GF in laboratorio. Seleziona GF di dimensioni uniformi e sane e ritira i peduncoli.
2. Immergere i GF in una soluzione di sapone (2 ml di sapone liquido per piatti in 998 ml di acqua di rubinetto), seguito da sfregamento per lavare i GF. Quindi, sciacquare i frutti con acqua, cambiando l'acqua tre volte.
3. Immergere i GF in una soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,5% (100 ml in 900 ml di acqua di rubinetto) e mescolare in uno shaker a 110 giri / min per 15 minuti. Quindi, sciacquare i GF con acqua mescolando in uno shaker e cambiando l'acqua tre volte, ogni 10 minuti.
4. Asciugare i GF con carta assorbente sterile.
5. Posizionare i GF in vassoi (33 cm x 25 cm x 2 cm) e irradiarli per 15 minuti, posizionando i GF a una distanza di 55 cm dalla sorgente UV all'interno di una stazione a flusso laminare orizzontale abilitata ai raggi UV.
6. Durante il periodo di 15 min, ogni 5 min, spostare i GF per garantire l'irradiazione dell'intero frutto.

3. Disinfezione degli insetti²¹

1. Utilizzare insetti CBB appena emersi (nello stesso giorno) per impostare i test biologici.
2. Immergere i CBB in una soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,5%, agitandoli lentamente con un pennello per 10 minuti.
3. Filtrare i CBB attraverso un panno di mussola e lavarli tre volte con acqua distillata sterile.
4. Rimuovere l'acqua in eccesso con asciugamani di carta sterili.

4. Valutazione di un prodotto con effetto protettivo sui frutti (preinfestazione) (Figura 1)

1. Utilizzare un gruppo di GF per unità sperimentale. Generalmente, viene utilizzato un gruppo di 30 GF per unità sperimentale.
2. Posizionare i GF in scatole di plastica (unità sperimentale).
3. Applicare il prodotto di prova alle diverse concentrazioni per la valutazione. Eseguire l'applicazione con un'unità spruzzatrice portatile. Qui è stata testata un'emulsione alcaloide al 5% e al 6%.
4. Come controllo, spruzzare un gruppo di GF con acqua.
5. Utilizzare almeno tre ripetizioni (unità sperimentale) per trattamento, spruzzando una dopo l'altra.
6. In un cappuccio sterile, rilasciare due adulti CBB per GF (un totale di 60 CBB vengono introdotti nelle scatole di plastica). Dopo 30 minuti, coprire le scatole.
7. Lasciare le scatole di plastica con i GF infestati in una stanza o in un'incubatrice in condizioni controllate (buio, 25 ± 2 °C e umidità relativa 71% ± 5%).
8. Dopo 1, 7, 15 e 21 giorni, conta il numero di frutti di trivellazione e insetti vivi e morti al di fuori dei frutti in ogni scatola.
9. A 20 giorni dopo la post-stazione, sezionare ogni GF sotto uno stereomicroscopio, ingrandimento 10x.
10. Conta il numero di semi sani o semi danneggiati dagli insetti in ogni frutto.
11. Contare i diversi stadi biologici CBB²² osservati e contare il numero di insetti morti in ciascun seme per determinare la mortalità degli insetti per unità sperimentale.

5. Valutazione dell'effetto di un prodotto dopo infestazione da CBB (post-stazione) (Figura 3)

1. Utilizzare gruppi di 200 frutti per trattamento.
2. In cappuccio asterile, rilasciare gli adulti CBB (rapporto 2:1 tra adulti CBB e GF) ai GF precedentemente disinfettati, consentendo l'infestazione di procedere per 3 ore a 21 °C.
3. Esaminare i GF. Dopo 3 ore, la maggior parte dovrebbe essere infestata, con l'addome dei CBB ancora esposto (posizione A²⁰), come mostrato nella Figura 2.
4. Selezionare 46 GF infestati (posizione A) e posizionarli in rack di plastica a 96 pozzetti (unità sperimentale). I frutti devono rimanere in questa posizione in modo che il trattamento possa essere spruzzato direttamente sul CBB perforando il frutto.
5. Spruzzare almeno tre volte (tre rack) per trattamento, uno dopo l'altro, coprendo i rack dopo 30 min.
6. Lasciare i rack con i GF infestati in una stanza o in un'incubatrice in condizioni controllate (buio, 25 ± 2 °C e umidità relativa 71% ± 5%).
7. Dopo 20 giorni, sezionare i GF sotto uno stereomicroscopio con ingrandimento 10x.
8. Conta il numero di semi sani o semi danneggiati dagli insetti in ogni frutto.
9. Contare i diversi stadi biologici CBB²² e il numero di insetti morti in ciascun seme per determinare la mortalità degli insetti per unità sperimentale.

6. Valutazione di un prodotto con effetto deterrente sulla CBB

1. Seguire i passaggi 4.1-4.6 delineati per valutare un prodotto con un effetto protettivo sui frutti.
2. Dopo aver rilasciato gli adulti CBB nelle scatole di plastica, conta il numero di CBB che volano via dalle scatole e il numero che infestano i GF. Quindi, seguire i passaggi 4.7-4.11.
3. Seguire i passaggi 5.1-5.5 delineati per valutare il prodotto dopo l'infestazione da CBB.
4. Dopo aver spruzzato ogni trattamento sugli insetti in posizione A, contare il numero di CBB che sono usciti dal GF e / o sono volati via dal GF. Quindi, seguire i passaggi 5.6-5.9.

7. Analisi statistica

NOTA: Le variabili di risposta sono le percentuali di mortalità nel tempo e la percentuale di semi di caffè sani non infestati.

1. Stimare la deviazione media e standard di ciascuna variabile di risposta per ciascun trattamento.
2. Esegui l'analisi della varianza per ogni variabile di risposta con un modello per un design completamente randomizzato.
   NOTA: Il test di confronto del 5% di Dunnett viene eseguito per confrontare i trattamenti con il controllo assoluto (controllo dell'acqua).
3. Quando i trattamenti sono significativamente diversi dal controllo assoluto, utilizzare un test del 5% della differenza meno significativa (LSD) per confrontare i trattamenti.
4. Valutare la potenza del test; se superiore all'85%, le ipotesi di normalità e omogeneità delle varianze sono soddisfatte.

Figura 1: Procedura per la valutazione degli effetti preinfestanti degli insetticidi sulla CBB. Passi per valutare gli effetti preinfestazione degli insetticidi su Hypothenemus hampei (CBB) usando frutti verdi (GF). (A) Selezione della frutta. B) Irrorazione degli insetticidi sui frutti del caffè. (C) Infestazione da CBB di frutti di caffè in un rapporto di 2:1 CBB per GF. (D) Frutti infestati. E) Incubazione dei frutti in condizioni controllate. F) Dissezione della frutta. (G) Conteggio della popolazione CBB all'interno dei semi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Elaborare l'infestazione da CBB di frutta del caffè. I frutti infestati contengono adulti CBB con i loro addominali parzialmente esposti (posizione A). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Procedura per la valutazione degli effetti posinfestanti degli insetticidi sulla CBB. Passi per valutare gli effetti post-stazione degli insetticidi sulla CBB utilizzando GF. (A) Selezione della frutta. (B) Infestazione dei frutti con CBB in un rapporto di 2:1 CBB per GF. (C) Selezione di frutti infestati. D) Irrorazione dell'insetticida sui frutti. (E) Incubazione dei frutti. F) Dissezione della frutta. (G) Conteggio della popolazione CBB. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I risultati hanno mostrato che le femmine CBB hanno riconosciuto i frutti e, a seconda delle caratteristiche della superficie del frutto e degli odori emessi, le femmine CBB hanno iniziato a penetrare o a portare i frutti entro 3 ore a 21 ° C.

L'effetto di un insetticida sul CBB quando applicato ai frutti del caffè (procedura di preinfestazione) dopo 24 ore e nel tempo è mostrato nella Figura 4. I due insetticidi (emulsione alcaloide al 5% e al 6%) hanno causato un'elevata mortalità degli insetti il giorno 20 (Tabella 1) e hanno mostrato differenze significative rispetto al controllo assoluto dell'acqua (P < 0,001), secondo il test LSD. Per quanto riguarda le percentuali di semi sani non infestati (Tabella 1), c'erano anche differenze tra i gruppi di controllo e gli insetticidi secondo il test di Dunnett al 5% (P < 0,001). Nel gruppo di controllo, il 37% dei semi non era infestato, mentre l'applicazione di insetticidi proteggeva i semi, con il 94% dei semi che rimanevano sani quando si usava insetticida 2 e l'89% con insetticida 1.

Figura 4: Effetti preinfestanti degli insetticidi sotto controllo rispetto a due gruppi di insetticidi. Effetti preinfestazione degli insetticidi. Percentuale di mortalitàdi H. hampei adulto valutata nei giorni 1, 7, 15 e 21 dopo l'infestazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Effetto del trattamento preinfestante sulla CBB. Percentuale di mortalità e percentuale di semi sani dopo 20 giorni. * Per ogni variabile, differenze rispetto al controllo (acqua) secondo il test di Dunnett al 5%.

I risultati della preinfestazione dopo 21 giorni sono mostrati nella Tabella 1 e i risultati nel tempo corrispondono alla Figura 4. In questo caso, i frutti del caffè sono stati coperti con una sostanza tossica che causa la mortalità degli insetti. Gli insetti si impregnano quando camminano sui frutti, assaggiano i frutti con i loro palpi o iniziano a masticare l'epidermide dei frutti. Inoltre, le sostanze applicate sulla superficie del frutto possono alterare o modificare l'odore naturale del frutto, quindi gli individui CBB possono interrompere il processo di infestazione, volando via o preferendo essere separati dal frutto senza toccarlo o infestarlo. A seconda del tempo di azione del prodotto, la mortalità degli insetti o l'evitare comportamenti di infestazione possono persistere per 24 ore o più.

D'altra parte, se i prodotti vengono applicati dopo che gli insetti iniziano a forare i frutti (post-stazione), i prodotti possono penetrare nella cuticola degli insetti, causando mortalità degli insetti (Tabella 2 e Figura 5). La più alta mortalità si è verificata con insetticida 2 (P < 0,01). Se la mortalità si verifica rapidamente, l'insetto morirà prima di entrare nel seme e non si troveranno uova o popolazioni di insetti all'interno dei semi.

Figura 5: Effetti post-stazione degli insetticidi. Percentuale di mortalità di H. hampei adulto valutata nei giorni 1, 7, 15 e 21 dopo l'infestazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 2: Effetti del trattamento post-stazione sulla CBB. Percentuale di mortalità e percentuale di semi sani dopo 20 giorni. * Per ogni variabile, differenze rispetto al controllo (acqua) secondo il test di Dunnett al 5%. Per ogni variabile, lettere diverse indicano differenze in base all'LSD 5%.

Gli effetti degli insetticidi si riflettono come percentuale di semi sani non infestati al giorno 20 della valutazione (Tabella 2). A causa dell'elevata mortalità degli insetti, l'insetto non è penetrato nei semi di caffè e li ha danneggiati. Applicazione dei prodotti protetti tra il 79%-90% dei semi di caffè, mostrando differenze rispetto al controllo, in cui il 57% dei semi è risultato sano (P < 0,01). Differenze significative sono state osservate anche tra i due insetticidi (P < 0,01).

In alcuni casi, gli insetti sono morti molto rapidamente, anche prima di causare danni al seme. Tuttavia, se la morte dell'insetto ha richiesto più tempo, l'insetto potrebbe raggiungere il seme e depositare alcune uova, e in seguito, l'adulto morirà. In questo caso, una ridotta popolazione di insetti è stata trovata all'interno dei semi di caffè rispetto alla popolazione di insetti trovata nel gruppo di controllo spruzzato con acqua (Tabella 3).

Tabella 3: Effetti postinfestazionali dopo trattamento con un fungo entomopatogeno e una sostanza repellente. Popolazione di insetti all'interno dei semi. I GF sono stati sezionati a 15 giorni. * Per ogni variabile, differenze rispetto al controllo (acqua) secondo il test di Dunnett al 5%. Per ogni variabile, lettere diverse indicano differenze in base all'LSD 5%.

La Figura 6 mostra l'effetto di un prodotto con effetti post-stazione, un entomopatogeno e quello di una sostanza repellente, nonché la loro azione combinata.

Figura 6: Effetti post-stazione di un fungo entomopatogeno e di una sostanza repellente. Percentuale di mortalità di H. hampei adulto e danni ai semi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Queste metodologie consentono la rapida determinazione dei diversi effetti dei prodotti tossici sulla CBB.

Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare.