Trattamento antiretrovirale combinato orale in topi umanizzati infetti da HIV-1

L'aspettativa di vita degli individui con infezione da virus dell'immunodeficienza umana cronica (HIV) è significativamente migliorata con il trattamento antiretrovirale combinato (cART)^1,2. cART riduce con successo la replicazione dell'HIV-1 e aumenta la conta delle cellule T CD4+ alla normalità nella maggior parte dei partecipanti con infezione cronica da HIV-1³, con conseguente miglioramento della salute generale e drastica riduzione della progressione della malattia⁴. Tuttavia, il serbatoio latente di HIV-1 si stabilisce anche quando l'ART viene iniziata durante l'infezione acuta ^5,6,7. I serbatoi persistono negli anni durante l'ART e il rapido rimbalzo virale dopo l'interruzione dell'ART è ben documentato ^8,9. Le persone che vivono con l'HIV in ART sono anche predisposte a un rischio più elevato di comorbidità come malattie cardiovascolari, cancro e disturbi neurologici^10,11,12. Pertanto, è necessaria una cura funzionale per l'HIV. I modelli animali per l'infezione da HIV-1 offrono evidenti vantaggi nello sviluppo e nella convalida di nuove strategie di cura dell'HIV^13,14,15. I topi umanizzati, come un piccolo modello animale, possono fornire la ricostituzione multilineare delle cellule immunitarie umane in diversi tessuti, che consente lo studio ravvicinato dell'infezione da HIV^16,17,18,19. Tra i modelli umanizzati, il modello umanizzato midollo osseo-fegato-timo (BLT) ricapitola con successo l'infezione cronica da HIV-1 e le risposte immunitarie umane funzionali all'infezione da HIV-1 20,21,22,23,24. Pertanto, il modello murino BLT umanizzato è stato ampiamente utilizzato per indagare vari aspetti nel campo della ricerca sull'HIV. I topi BLT umanizzati non sono solo modelli consolidati per la ricapitolazione dell'infezione persistente da HIV-1 e della patogenesi, ma anche strumenti consequenziali per la valutazione delle strategie di intervento basate sulla terapia cellulare. Gli autori attuali e altri hanno dimostrato che il modello umanizzato di topi BLT ricapitola l'infezione persistente da HIV-1 e la patogenesi 25,26,27 e fornisce strumenti per valutare le strategie di intervento basate sulla terapia cellulare 28,29,30,31,32,33.

I regimi di cART costituiti da combinazioni di farmaci antiretrovirali assunti quotidianamente sopprimono la replicazione dell'HIV-1 al punto che la carica virale negli individui trattati con successo rimane non rilevabile a lungo termine³⁴. I risultati del trattamento di topi umanizzati con infezione da HIV con regimi di cART clinicamente rilevanti assomigliano a quelli osservati negli individui trattati con ART infetti da HIV-1²²: i livelli di HIV-1 sono soppressi al di sotto dei limiti di rilevazione e l'interruzione di cART provoca un rimbalzo della replicazione dell'HIV dal serbatoio latente³⁵. L'iniezione sottocutanea (SC)27,36,37 o intraperitoneale (IP)^37,38,39 è la via comunemente usata per il trattamento cART nei topi umanizzati. Tuttavia, l'iniezione giornaliera intensiva induce stress agli animali per contenzione fisica⁴⁰. È anche laborioso e potenzialmente pericoloso per i ricercatori a causa della maggiore esposizione all'HIV durante l'utilizzo di oggetti taglienti. La somministrazione orale è ideale per imitare l'assorbimento, la distribuzione e l'escrezione dei farmaci cART assunti da individui con infezione da HIV-1. La somministrazione orale comporta tipicamente procedure personalizzate e spesso laboriose per mettere i farmaci antiretrovirali in alimenti sterilizzati (necessari a causa dell'immunodeficienza dei topi) 24,37,41 o acqua 42,43,44,45,46 , che può o non può essere chimicamente compatibile con molti farmaci antiretrovirali, o provocare qualcosa che i topi non mangerebbero o berrebbero prontamente (il che influenzerebbe i livelli di dose e farmaco nel corpo). Il nuovo metodo di somministrazione perorale di cART qui proposto supera i precedenti tentativi di somministrazione grazie alla sua compatibilità con diversi tipi di farmaci antiretrovirali, alla sicurezza e alla facilità di preparazione e somministrazione e alla riduzione dello stress e dell'ansia degli animali derivanti dall'iniezione giornaliera.

Tenofovir disoproxil fumarato (TDF), Elvitegravir (ELV) e Raltegravir (RAL) sono farmaci scarsamente solubili in acqua. È interessante notare che si osserva una maggiore biodisponibilità di TDF con cibi grassi, suggerendo che l'inibizione competitiva delle lipasi da parte del cibo grasso può fornire una certa protezione per TDF⁴⁷. Pertanto, le coppette DietGel Boost sono state selezionate per sostituire il normale chow di roditori come metodo di consegna basato sul loro modesto contenuto di grassi (20,3 g per 100 g) rispetto al normale roditore (10 g per 100 g) e una tipica dieta ricca di grassi per topi (40-60 g per 100 g)⁴⁸. Il peso totale di una tazza è di 75 g; Pertanto, ogni tazza conterrà la quantità di cibo, e quindi di droga, sufficiente per cinque topi in 3 giorni.

Il tessuto fetale umano anonimizzato è stato acquisito commercialmente. La ricerca sugli animali è stata condotta secondo i protocolli approvati dall'Università della California, Los Angeles, e (UCLA) Animal Research Committee (ARC) in conformità con tutte le linee guida federali, statali e locali. In particolare, tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le raccomandazioni e le linee guida per l'alloggio e la cura degli animali da laboratorio del National Institutes of Health (NIH) e dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio (AALAC) International ai sensi del numero di protocollo ARC UCLA 2010-038-02B. Tutti gli interventi chirurgici sono stati eseguiti con ketamina (100 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) e anestesia isoflurana (2-3 vol%) e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il dolore e il disagio degli animali.

1. Topi umanizzati infettati da HIV-1

NOTA: I topi umanizzati sono stati costruiti come precedentemente descritto in^30,31,49. Il protocollo è brevemente descritto di seguito.

1. Purificare le cellule progenitrici ematopoietiche CD34+ dal fegato fetale umano tramite microsfere anti-CD34 secondo il protocollo del produttore.
2. Anestetizzare topi maschi e femmine di 6-8 settimane NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) e irradiare sub-letalmente (2,7 Gy) prima dell'intervento.
3. Impianto di timo, derivato dallo stesso donatore del fegato fetale, sotto la capsula renale insieme al fegato.
4. Dopo l'impianto, iniettare topi con 0,5 milioni a un milione di cellule CD34+, per via endovenosa.
5. Dopo 8-10 settimane, raccogliere 100 μL di sangue di topo tramite sanguinamento retroorbitale⁵⁰ in provette da microcentrifuga contenenti 5 μL di EDTA e centrifugare a 350 x g per 3 minuti.
6. Conservare il plasma a -80 °C per monitorare la carica virale dopo che il topo è stato infettato da HIV-1. Aggiungere 2 ml di soluzione di NH4C all'83% e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per lisare i globuli rossi.
7. Aggiungere 10 ml di RPMI con siero bovino fetale al 10% (FBS) per fermare la lisi. Girare a 300 x g per 5 min.
8. Aspirare il surnatante. Colorare le cellule con pannello anticorpale (vedi Tabella dei materiali) e analizzarle mediante citometria a flusso per controllare l'attecchimento delle cellule immunitarie umane.
9. Infettare topi che presentano più del 50% di cellule CD45+ circolanti mediante iniezione venosa retroorbitaria^51,52 con almeno 200 ng di p24 di un ceppo HIV-1 (cioè NFNSXSL9 30,53,54) usando una siringa da insulina. Raccogliere il sangue bisettimanalmente per l'analisi della citometria a flusso e per misurare la carica virale.

2. Preparazione di farmaci ART

1. Pesare i singoli farmaci; ad esempio, per realizzare 10 bicchieri alimentari con cART, utilizzare raschietti cellulari sterili per pesare 250 mg di FTC (Emtricitabina), 375 mg di TDF e 500 mg di RAL o ELV in singole provette sterili da centrifuga da 15 ml in un armadio di biosicurezza.
2. Aggiungere 1 mL di DMSO in un tubo FTC da 250 mg (concentrazione finale di 250 mg/ml), aggiungere 1,5 mL di DMSO in un tubo TDF da 375 mg (concentrazione finale di 250 mg/ml) e aggiungere 1mL di DMSO in un tubo RAL o ELV da 500 mg (concentrazione finale di 500 mg/ml). Mescolare o pipetare la miscela di droga fino a completa dissoluzione e si ottiene una soluzione chiara.
3. Utilizzare un filtro a membrana idrofilo PVDF da 0,22 μM per sterilizzare le soluzioni con una siringa sterile. Le singole soluzioni farmacologiche possono essere conservate a -20 °C per 12 settimane.
4. Quando è pronto per l'uso, scongelare appena un'aliquota di ciascuna soluzione di farmaco a 37 °C fino a quando la soluzione diventa limpida. Mescolare bene usando un pipet.
5. Combinare i farmaci e mescolare bene per formare il master mix: 1 mL di FTC in DMSO, 1,5 mL di TDF in DMSO e 1 mL di ELV o RAL in DMSO.
   NOTA: Questa quantità farà 10 tazze di cibo.
6. Aggiungere 350 μL di soluzione master mix cART in una tazza per creare una tazza DietGel Boost cART.
7. Aggiungere 0,75 mL di Trimetoprim-Sulfametossazolo (0,48 mg/mL concentrazione finale) nella tazza.
8. Mescolare accuratamente con 1 mL di punte sterili per pipette.
9. Aliquotare la tazza contenente cART dalla tazza originale con una micro spatola su una piastra di Petri da 60 mm secondo necessità. Pesare il cibo su una bilancia per calcolare la quantità di tazza di cibo contenente cART per ogni gabbia in base al numero di topi.

3. Somministrazione di farmaci ART a topi infetti da HIV-1

1. Rimuovere il chow normale dalla gabbia e sostituirlo con una tazza di cibo contenente cART.
   NOTA: In media, un topo mangerà fino a 5 g di cibo al giorno. Circa una tazza di cibo può essere somministrata a cinque topi per 2 giorni.
2. Rinfrescare il cibo cART tre volte a settimana.
3. Pesare le tazze usate per monitorare l'assunzione. Pesare i topi settimanalmente per confermare il consumo.

4. Monitorare la carica virale mediante PCR in tempo reale

1. Valutare le cellule immunitarie umane (livelli di cellule T CD4 e CD8) e la replicazione dell'HIV-1 nei topi BLT ogni 2 settimane mediante sanguinamento retroorbitale. Raccogliere il plasma seguendo le istruzioni nei passaggi 1.5-1.8.
2. Monitorare le cariche virali plasmatiche di topi infettati da HIV-1 prima e durante la somministrazione orale di cART per 8 settimane. Estrarre l'RNA virale plasmatico dal plasma utilizzando un kit di estrazione dell'RNA virale e quantificarlo mediante PCR in tempo reale utilizzando i primer e le sonde (vedi Tabella dei materiali) come precedentemente descritto 27,30,31. Utilizzare il seguente protocollo di ciclismo: 48 °C (15 min), 95 °C (10 min), quindi ciclismo 95 °C (15 s), 60 °C (1 min) per 45 cicli.

5. Valutare i rapporti CD4/CD8 mediante citometria a flusso

1. Preparare sospensioni monocellulari da sangue periferico di sanguinamenti bisettimanali seguendo i passaggi 1.5-1.8.
2. Colorare le cellule con marcatori superficiali e analizzare mediante citometria a flusso. Utilizzare i seguenti anticorpi marcatori di superficie 27,30,43,49 nella citometria a flusso: CD45 (clone HI30), CD8 (clone SK1), CD3 (clone OKT3), CD4 (clone RPA-T4)^27,30,42,49.

Supponendo che un topo medio del peso di 25 g consumi 4 g di cibo al giorno, la dose giornaliera di farmaco attraverso l'assunzione orale corrisponde a 2,88 mg/kg TFV, 83 mg/kg FTC e 768 mg/kg RAL. Per verificare se il regime alimentare ottimizzato è tossico e influenza la salute generale rispetto all'iniezione giornaliera di cART, il peso dei topi è stato monitorato settimanalmente prima e durante la cART attraverso l'iniezione orale o sottocutanea. Non ci sono state differenze di peso significative prima della somministrazione di cART in ciascun gruppo (Figura 1). Tuttavia, il peso del topo diminuiva continuamente durante l'iniezione giornaliera di cART SC. Al contrario, FTC/TDF/ELV o FTC/TDF/RAL in DietGel ha ripristinato il peso del topo ai livelli pre-inizio dell'ART dopo 5 settimane di somministrazione orale di cART. Inoltre, non sono state osservate variazioni significative di peso tra i gruppi Raltegravir o Elvitegravir.

Per verificare se la somministrazione orale di cART sopprime la carica virale con la stessa efficacia di un'iniezione giornaliera, sono state valutate le cariche virali plasmatiche bisettimanali utilizzando la RT-PCR. La figura 2 mostra che il regime alimentare FTC/TDF/ELV ART ha soppresso efficacemente al 100% la replicazione virale a livelli non rilevabili entro 4 settimane; Il regime alimentare FTC / TDF / RAL ART può sopprimere l'80% dei topi a livelli non rilevabili entro 4 settimane, mentre solo il 70% dei topi che hanno ricevuto l'iniezione SC ha raggiunto livelli non rilevabili dopo 4 settimane di trattamento. I risultati hanno dimostrato che la somministrazione orale sopprime la replicazione virale più velocemente e in modo più efficiente rispetto all'iniezione SC. Inoltre, il regime alimentare cART ha impedito l'ulteriore declino dei rapporti CD4/CD8 nel sangue periferico prima dell'iniezione giornaliera SC (Figura 3). Questi risultati hanno suggerito che il regime cART orale proposto può sopprimere con successo la viremia plasmatica al di sotto del livello di rilevamento, ripristinare rapidamente i livelli delle cellule T CD4 e migliorare la salute generale degli animali nei topi umanizzati infetti da HIV-1.

Figura 1: Variazioni del peso corporeo del topo prima e durante il trattamento con cART dopo l'infezione da HIV-1 in diversi gruppi. I topi umanizzati sono stati infettati con HIVNFNSXSL9 dopo ricostituzione immunitaria. Dopo 4 settimane di infezione da HIV-1, i topi sono stati trattati per altre 7,5 settimane con regime FTC / TDF / RAL tramite iniezione sottocutanea (SC) o mediante somministrazione orale di FTC / TDF / RAL o FTC / TDF / ELV. Il peso corporeo del topo è stato misurato a partire da 1 settimana prima dell'infezione da HIV. Tutti i confronti statistici sono stati condotti utilizzando il test di Mann-Whitney, media del gruppo di segnalazione (± S.E.). Le stelle asterisco verdi mostrano differenze statistiche tra il gruppo orale alimentare FTC/TDF/ELV e il gruppo di iniezione FTC/TDF/RAL SC. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. n=6-7 in ogni gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: La somministrazione orale di cART negli alimenti mostra una soppressione virale più rapida. Come descritto nella Figura 1, i topi non sono stati trattati o trattati con regime FTC/TDF/RAL attraverso iniezione sottocutanea e attraverso somministrazione orale di regimi alimentari mock, FTC/TDF/RAL, o FTC/TDF/ELV per altre 7,5 settimane. (A) Carica virale plasmatica nel tempo dopo l'infezione da HIV-1 in diversi gruppi. (B) Riassunto della carica virale nel tempo dopo l'infezione da HIV-1 in diversi gruppi, riportando la media geometrica del gruppo con intervallo di confidenza (IC) del 95%. Le frecce nere indicano l'ora di inizio della cART per i gruppi trattati con cART. (C) Analisi della sopravvivenza del tempo dopo il trattamento con cART a carica virale non rilevabile per ciascun gruppo. n= 6-7 in ciascun gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Le somministrazioni orali di alimenti ART mostrano un ripristino più rapido del rapporto CD4/CD8. Rapporto CD4/CD8 nel sangue periferico nel tempo dopo l'infezione da HIV-1 per ciascun gruppo. Tutti i confronti statistici sono stati effettuati utilizzando il test di Mann-Whitney, media del gruppo di segnalazione (± S.E.). Le stelle asterisco rosse mostrano differenze statistiche tra il gruppo orale alimentare FTC/TDF/RAL e il gruppo di iniezione FTC/TDF/RAL SC. *P < 0,05. n=6-7 in ogni gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

SK è uno dei fondatori di CDR3 Inc. I restanti autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.