Articolo metodologico

Indagine sugli effetti attenuanti della somministrazione di Bacillus cereus sulla colite attraverso la modulazione del microbiota intestinale

DOI:

10.3791/63707

⸱

27 luglio 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Anhui University, 2Key Laboratory of Human Microenvironment and Precision Medicine of Anhui Higher Education Institutes, Anhui University, 3Anhui Key Laboratory of Modern Biomanufacturing, 4Institute of Physical Science and Information Technology, Anhui University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire il modello murino di colite indotta da sodio con destrano solfato pseudo-germe indotto da antibiotici per studiare il ruolo del microbiota intestinale nella regolazione degli effetti positivi del Bacillus cereus sulla colite.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Si ritiene che la disbiosi del microbiota intestinale eserciti un ruolo nella progressione della colite. Tuttavia, gli standard precisi per la somministrazione di probiotici nell'alleviare la colite rimangono indefiniti. La maggior parte dei metodi di analisi si basa su una limitata diversità e abbondanza di microrganismi intestinali. Pertanto, gli studi osservazionali non possono stabilire la causalità. In questo studio, abbiamo applicato topi pseudo-germ-free indotti da antibiotici per studiare il ruolo del microbiota intestinale nella regolazione degli effetti probiotici del Bacillus cereus (B. cereus) sulla colite indotta da destrano solfato di sodio (DSS) nei topi. Questo processo consente di valutare l'effetto regolatore bidirezionale dell'integrazione di B. cereus sulla salute e fornisce risultati stabili e riproducibili. Qui vengono forniti i protocolli dettagliati per la coltivazione di B. cereus , l'operazione con sonda gastrica, la raccolta delle feci e il trattamento di eliminazione degli antibiotici sui topi con colite. I metodi di ottimizzazione sono applicabili anche per altri disturbi cronici associati all'infiammazione. I risultati hanno mostrato che la somministrazione di B. cereus ha ridotto la perdita di peso corporeo, l'accorciamento della lunghezza del colon, l'indice di attività della malattia e i punteggi istopatologici. Tuttavia, il trattamento con antibiotici ha soppresso l'effetto positivo di B. cereus sulla colite. Questi risultati indicano che il microbiota intestinale è necessario per gli effetti allevianti di B. cereus sulla colite. Pertanto, esplorare gli effetti benefici dei probiotici in questa ricerca è un approccio promettente per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento per alleviare i sintomi dei disturbi cronici associati all'infiammazione.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le malattie infiammatorie intestinali (IBD) sono comuni disturbi infiammatori gastrointestinali cronici, tra cui il morbo di Crohn e la colite ulcerosa (UC)1. Le attuali vie terapeutiche per la colite infiammatoria sono i 5-aminosalicilati, i corticosteroidi, l'azatioprina e gli antibiotici2. Inoltre, questi farmaci hanno notevoli effetti collaterali3. Pertanto, dovremmo prestare maggiore attenzione all'effetto dei probiotici sul trattamento della colite.

Gli approcci terapeutici alternativi includono la somministrazione di probiotici, che è stata utilizzata in modelli animali e studi clinici. Studi precedenti hanno indicato che diverse somministrazioni di probiotici, come il Bacillus cereus o il Bifidobacterium infantis, potrebbero alleviare la colite 4,5. Negli studi preclinici, l'efficacia e la sicurezza dei probiotici devono essere studiate in modelli animali.

I modelli murini di colite con destrano solfato di sodio (DSS) possono aiutare a esplorare i meccanismi della colite e valutare gli effetti positivi dei probiotici. L'incentivo DSS provoca erosione della mucosa intestinale, disfunzione della barriera intestinale e un aumento della permeabilità epiteliale intestinale6. La maggior parte dei modelli murini per probiotici ha evidenziato principalmente gli effetti biologici. Tuttavia, il meccanismo alla base della somministrazione di questo probiotico è difficile da esplorare, data la limitazione nel verificare ulteriormente la relazione causale tra probiotici e l'alleviamento della colite. Pertanto, è necessario sviluppare un metodo standardizzato per studiare il meccanismo dei probiotici.

Tradizionalmente, questi studi richiedono l'inoculazione di alcuni probiotici in topi privi di germi7. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni di laboratorio nell'utilizzo di topi privi di germi come recettori per i probiotici, come la bassa capacità immunitaria e le costose strutture prive di germi8. Al fine di evitare queste limitazioni, è stato stabilito un modello alternativo di colite indotta da DSS utilizzando topi pseudo-privi di germi. Il modello murino pseudo-germ-free è stato stabilito mediante l'applicazione di antibiotici come precedentemente descritto 9,10.

In questo articolo, stabiliamo topi pseudo-privi di germi con un cocktail di antibiotici. Descriviamo anche in dettaglio la metodologia per stabilire e valutare i modelli di colite murina e studiamo gli effetti dei probiotici sull'alleviamento dei sintomi della colite. Il protocollo seguente fornisce anche i metodi di somministrazione dei probiotici tramite gavage.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Università di Anhui, in Cina, e tutte le procedure sono state approvate dal Comitato etico per gli animali dell'Università di Anhui, in Cina (n. IACUC(AHU)-2020-014).

1. Somministrazione di antibiotici

  1. Preparare un cocktail di antibiotici sciogliendo l'ampicillina (1 g/L), il neomicina solfato (1 g/L), il metronidazolo (0,5 g/L) e la vancomicina (0,5 g/L) in 1 L di acqua potabile5.
  2. Dopo la completa dissoluzione, conservare le soluzioni a 4 °C.
  3. Metti le soluzioni del cocktail antibiotico in una bottiglia d'acqua. Posiziona la bottiglia sopra la gabbia del topo.
    NOTA: Assicurati di utilizzare bottiglie marroni o avvolgere le bottiglie con un foglio di alluminio per proteggere le soluzioni antibiotiche dalla luce.
  4. Sostituire il cocktail antibiotico con soluzioni fresche 2 volte a settimana.
  5. Lasciare che i topi bevano liberamente le soluzioni del cocktail antibiotico per 4 settimane.

2. Preparazione dell'acqua potabile DSS e induzione della colite

  1. Per preparare una soluzione di destrano solfato di sodio (DSS) al 2,5%, sciogliere 2,5 g di DSS in 100 ml di acqua distillata11.
  2. Sostituire l'acqua potabile con la soluzione DSS al 2,5% nel gruppo di topi modello di colite. Assicurarsi che i topi del gruppo della colite non abbiano accesso ad altra acqua potabile. Nel frattempo, trattare i topi di controllo con acqua distillata senza DSS.
  3. Ospita topi maschi C57BL/6J (peso corporeo medio, 20 g ± 2 g; età 7 settimane) in condizioni prive di agenti patogeni con libero accesso a cibo e acqua standard.
    NOTA: Ospita un totale di cinque topi per gabbia in condizioni prive di agenti patogeni.
  4. Progettazione sperimentale
    NOTA: Gli esperimenti sugli animali sono stati progettati in due fasi. Sono stati inclusi cinque topi per ogni gruppo.
    1. Prima fase: per valutare l'effetto positivo di B. cereus sull'alleviamento della colite, assegnare in modo casuale i topi ai seguenti tre gruppi: gruppo di controllo (controllo), modello di colite indotta da DSS (DSS), integrazione probiotica di B. cereus per topi indotti da DSS (B. cereus).
    2. Seconda fase: esplorare il ruolo del microbiota intestinale nella regolazione degli effetti probiotici di B. cereus sulla colite indotta da DSS, assegnare casualmente i topi ai seguenti tre gruppi: ABX (controllo), ABX (DSS) e ABX (B. cereus + DSS).
      1. Trattare i topi del gruppo ABX (controllo) con soluzione fisiologica.
      2. Dopo il trattamento con soluzioni di cocktail antibiotici per 4 settimane, lasciare che i topi del gruppo ABX (DSS) ricevano acqua contenente il 2,5% di DSS per 1 settimana e soluzione fisiologica normale per 2 settimane.
      3. Dopo il trattamento con soluzioni di cocktail antibiotici e acqua DSS, trattare quotidianamente i topi del gruppo ABX (B. cereus + DSS) con B. cereus (2 x 108 cellule) in 200 μL di soluzione fisiologica utilizzando una cannula intragastrica per 2 settimane.
  5. Dopo la somministrazione del cocktail antibiotico, trattare immediatamente i topi maschi C57BL/6 con una soluzione di DSS al 2,5% in acqua potabile per 7 giorni.
  6. Registrare il peso corporeo dei topi prima dell'intervento DSS come peso basale.

3. Quantificazione di B. cereus

  1. Preparare otto provette per microcentrifuga da 1,5 mL riempite con 900 μL di soluzione fisiologica sterile.
  2. Pipettare 100 μL di B . cereus di crescita logaritmica e sciogliere in 900 μL di soluzione fisiologica normale sterile.
  3. Diluire in serie B. cereus utilizzando tubi.
  4. Piastra 40 μl di ciascuna diluizione sulla rispettiva piastra di agar LB etichettata con il rapporto di diluizione. Ripetere 3 volte per ogni rapporto di diluizione.
  5. Fermentare le piastre in un incubatore a temperatura costante a 37 °C per 16 ore.
  6. Seleziona le piastre con ~20-70 colonie per il conteggio. Calcolare la concentrazione batterica media in base al multiplo di diluizione delle piastre selezionate.

4. Preparazione di B. cereus per la sonda gastrica

  1. Dopo la quantificazione di B. cereus, raccogliere 1 mL di terreno di B. cereus contenente 1 x 109 CFU e centrifugare a 8.000 x g per 10 min. Quindi, lavare le cellule batteriche 2 volte con acqua sterile mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 minuti e rimuovere il surnatante.
  2. Diluire il B. cereus concentrato con soluzione fisiologica sterile fino a una concentrazione finale di 2 x 108 CFU/200 μL4.
  3. Pipettare ripetutamente la diluizione su e giù per ottenere una sospensione dispersa di B. cereus .
  4. Effettuare la quantificazione della concentrazione di B. cereus con la tecnica del conteggio su piastra prima di completare il metodo della sonda gastrica.

5. Applicazione di integratori di B. cereus mediante sonda gastrica

  1. Somministrare gli interventi (2 x 10,8 CFU probiotici in 200 μL di soluzione fisiologica normale) nei topi attraverso la sonda orale a un tempo prestabilito.
  2. Per somministrare B. cereus, collegare un ago per sonda gastrica (misura dell'ago di alimentazione: 20 G, 38 mm) a una siringa da 1 mL. Pulire l'esterno dell'ago della sonda con etanolo al 70% tra i topi e mantenere la corretta applicazione della dose.
  3. Per trattenere i topi, prendili per la coda e afferra saldamente la pelle flaccida della schiena con l'estremità della coda fissata tra le ultime due dita del conduttore.
  4. Mantieni i mouse in posizione verticale. Quindi, inserire l'ago della sonda gastrica con cautela e delicatamente attraverso la bocca nell'esofago. Se non si incontra resistenza in questo passaggio, spingere delicatamente l'ago nello stomaco.
    NOTA: Confermare la respirazione regolare e senza ostacoli dei topi prima della somministrazione del farmaco.
  5. Far avanzare lentamente l'ago e somministrare la soluzione di B. cereus . Estrarre delicatamente l'ago dopo il completamento del gavagage. Rilascia il mouse e rimettilo nella sua gabbia.

6. Determinazione dell'indice di attività della malattia

NOTA: L'indice di attività della malattia (DAI) è stato calcolato quotidianamente in base alla perdita di peso corporeo dei topi, al sangue occulto nelle feci e alla consistenza delle feci.

  1. Misura il peso corporeo dei topi ogni giorno. Assegna un punteggio da 0 a 4 a ciascun topo in base alla percentuale di perdita di peso corporeo (0: 0%, 1: 1% -5%, 2: 6% -10%, 3: 11% -18% e 4: >18%).
  2. Raccogli campioni di feci fresche da ogni topo. Usa un batuffolo di cotone per stimolare la contrazione dell'ano per favorire la defecazione. Quindi, raccogliere i campioni di feci subito dopo la defecazione in una provetta da centrifuga sterilizzata.
  3. Determinare il sangue occulto fecale con la carta del test del sangue occulto nelle feci. Raccogliere 10 mg di campione di feci su un bastoncino applicatore.
  4. Metti il campione sulla scheda di prova e applica una sottile sbavatura sulla carta. Aprire il lembo posteriore e applicare lo sviluppatore sulla sbavatura.
  5. Quindi, segnare per il sangue occulto utilizzando la carta del test del sangue occulto nelle feci entro 120 s.
    NOTA: Qualsiasi traccia di blu sopra o sul bordo dello striscio è positiva per il sangue occulto. I punteggi dell'occulto fecale erano i seguenti: 0: Nessuno, 1: Emoocculto positivo, 2: Lieve, 3: Tracce di sangue nelle feci e 4: Sanguinamento grossolano.
  6. Identificare la consistenza delle feci rilevando il campione di feci11. Assegna un punteggio da 0 a 4 (0: normale, 1: feci molli, 2: feci semiformate, 3: feci liquide e 4: diarrea).

7. Raccolta dei tessuti

  1. Anestetizzare i topi iniettando il 10% di idrato di cloralio (10 mg/kg) alla fine della prima e della seconda fase dell'esperimento. Valutare la profondità dell'anestesia nei topi in base al riflesso di astinenza con pizzico.
  2. Quindi, sopprimere i topi mediante lussazione cervicale.
  3. Fissare i topi in posizione supina sul tavolo operatorio e aprire la cavità peritoneale.
  4. Separare chirurgicamente l'intero colon e misurare la lunghezza con un righello.
  5. Quindi, lavare delicatamente il colon con una siringa da 5 ml riempita con PBS preraffreddato.

8. Valutazione del danno istologico

  1. Tagliare il tessuto del colon in piccoli frammenti, fissarli in paraformaldeide al 4% e incorporarli in paraffina utilizzando una macchina per l'inclusione dei tessuti.
  2. Quindi, sezionare i tessuti inclusi in paraffina con un microtomo per preparare sezioni di tessuto del colon spesse 4 μm. Decerare e disidratare le sezioni del colon. Quindi, colorare le sezioni del colon con ematossilina ed eosina (H&E).
    NOTA: I campioni di colon colorati vengono valutati dallo sperimentatore con un sistema per le seguenti misure: grado di infiltrazione delle cellule infiammatorie (Nessuno: 0, Lieve: 1, Moderata: 2, Grave: 3), Danno alla mucosa (Nessuno: 0, Strato mucoso: 1, Sottomucosa: 2, Muscolare e sierosa: 3), Danno alla cripta (Nessuno: 0, 1/3: 1, 2/3: 2, intero: 3, intero + perdita di epitelio: 4), intervallo di lesioni (%) (0%: 0, 1%-25%: 1, 26%-50%: 2, 51%-75%: 3, 76%-100%: 4). Il punteggio totale del danno istologico è calcolato per ogni singolo punteggio delle misure di cui sopra5.
  3. Lascia che due sperimentatori indipendenti valutino (in cieco) i punteggi istologici del campione al microscopio ottico.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Integrazione di B. cereus e colite
Il modello sperimentale di colite acuta è stato indotto dall'intervento DSS nell'acqua potabile. La Figura 1A mostra il protocollo sperimentale per la somministrazione di B. cereus al modello murino di colite. L'incentivo DSS ha ovviamente diminuito il peso corporeo (Figura 1B) e la lunghezza del colon. L'effetto attenuante di B. cereus attraverso la sonda gastrica orale è stato st...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per utilizzare i probiotici negli studi clinici, è necessario valutare l'efficacia e la sicurezza dei probiotici nei modelli animali. I protocolli forniti sono stati precedentemente ottimizzati per valutare la gravità della colite. I topi trattati con DSS sono un modello di infiammazione intestinale, che imita le caratteristiche cliniche e istologiche caratteristiche della colite ulcerosa12. I topi modello per la colite acuta sono caratterizzati da perdita di peso...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è stato sostenuto almeno in parte dalla National Natural Science Foundation of China (K.S., sovvenzione n. 32000081), dalla Natural Science Foundation della provincia di Anhui (K.S., sovvenzione n. 1908085QC120), dall'Open Project Program dello State Key Laboratory of Food Science and Technology, dall'Università di Jiangnan (K.S., sovvenzione n. SKLF-KF-201920), dalla Natural Science Foundation of Anhui Higher Education Institutions of China (K.S., sovvenzione No. KJ2019A0040), la Fondazione per la Ricerca Scientifica di Dottorato dell'Università di Anhui (K.S., sovvenzione n. J01003316), la Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina (Y.W., sovvenzione n. 31770066, 31470218), il Fondo aperto per la costruzione delle discipline, Istituto di Scienze Fisiche e Tecnologia dell'Informazione dell'Università di Anhui (Y.W.) e l'Outstanding Talents Program dell'Università di Anhui, Cina (Y.W.).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,01 M PBS (polvere, pH7,2– 7.4)Distretto di SolarbioP1010-2L
Alcool etilico assolutoHushi64-17-5
Soluzione di differenziazione dell'alcol acido fsatBeyotimeNo.C0163S
AgarSangon Biotech9002-18-0
AmpicillinaDistretto di Solarbio69-53-4Negozio su 2– 8 ° C
Incubatore anaerobicoLong YueLA1-3T
Destrano solfato sale sodico grado coliteMP Biomedicali160110
Incubatore elettrotermicoSANFAHP-050A
Fissatore tissutale per uso generaleBiosharpBL539A
GlicerinaHushi56-81-5
Kit per la colorazione dell'ematossilina e dell'eosinaBeyotimeNo.C0105
Supporto di montaggio di KisserBeyotimeNo.C0181
MetronidazoleDistretto di Solarbio443-48-1Negozio su 2– 8 ° C
Neomieina solfatoDistretto di Solarbio1405-10-3Negozio su 2– 8 ° C
Incubatrice oscillanteShanghai ZhichuZQLY-180S
Cloruro di sodioSangon Biotech7647-14-5
Carta per il test del sangue occulto nelle feciBasoBA2020B
TriptoneOSSOIDE2285856
VancomycinDistretto di Solarbio1404-93-9Negozio su 2– 8 ° C
XileneHushi1330-20-7
Estratto di lievitoSangon Biotech8013-01-2

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pittayanon, R., et al. Differences in gut microbiota in patients with vs without inflammatory bowel diseases: A systematic review. Gastroenterology. 158 (4), 960-946 (2020).
  2. Kuehn, F., Hodin, R. A. Impact of modern drug therapy on surgery: Ulcerative colitis. Visceral Medicine. 34 (6), 426-431 (2018).
  3. Harmand, P. -O., Solassol, J. Thiopurine drugs in the treatment of ulcerative colitis: Identification of a novel deleterious mutation in TPMT. Genes. 11 (10), 1212(2020).
  4. Sheng, K., et al. Synbiotic supplementation containing Bifidobacterium infantis and xylooligosaccharides alleviates dextran sulfate sodium-induced ulcerative colitis. Food & Function. 11 (5), 3964-3974 (2020).
  5. Sheng, K., et al. Probiotic Bacillus cereus alleviates dextran sulfate sodium-induced colitis in mice through improvement of the intestinal barrier function, anti-inflammation, and gut microbiota modulation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (49), 14810-14823 (2021).
  6. Wei, L., et al. PRKAR2A deficiency protects mice from experimental colitis by increasing IFN-stimulated gene expression and modulating the intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 14 (6), 1282-1294 (2021).
  7. Souza, E. L. S., et al. Beneficial effects resulting from oral administration of Escherichia coli Nissle 1917 on a chronic colitis model. Beneficial Microbes. 11 (8), 779-790 (2020).
  8. Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. Drosophila melanogaster as a high-throughput model for host-microbiota interactions. Frontiers in Microbiology. 8, 751(2017).
  9. Liang, W., et al. Colonization potential to reconstitute a microbe community in pseudo germ-free mice after fecal microbe transplant from equol producer. Frontiers in Microbiology. 11, 1221(2020).
  10. Hernandez-Chirlaque, C., et al. Germ-free and antibiotic-treated mice are highly susceptible to epithelial injury in DSS colitis. Journal of Crohns & Colitis. 10 (11), 1324-1335 (2016).
  11. Sheng, K., et al. Grape seed proanthocyanidin extract ameliorates dextran sulfate sodium-induced colitis through intestinal barrier improvement, oxidative stress reduction, and inflammatory cytokines and gut microbiota modulation. Food & Function. 11 (9), 7817-7829 (2020).
  12. Xu, X., et al. Histological and ultrastructural changes of the colon in dextran sodium sulfate-induced mouse colitis. Experimental and Therapeutic Medicine. 20 (3), 1987-1994 (2020).
  13. Zheng, L., et al. Jianpi Qingchang decoction alleviates ulcerative colitis by inhibiting nuclear factor-kappa B activation. World Journal of Gastroenterology. 23 (7), 1180-1188 (2017).
  14. Gao, X., et al. Symptoms of anxiety/depression is associated with more aggressive inflammatory bowel disease. Scientific Reports. 11, 1440(2021).
  15. Thippeswamy, B. S., et al. Protective effect of embelin against acetic acid induced ulcerative colitis in rats. European Journal of Pharmacology. 654 (1), 100-105 (2011).
  16. Sakai, S., et al. Astaxanthin, a xanthophyll carotenoid, prevents development of dextran sulphate sodium-induced murine colitis. Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition. 64 (1), 66-72 (2019).
  17. Li, S., et al. Role of gut microbiota in the anti-colitic effects of anthocyanin-containing potatoes. Molecular Nutrition & Food Research. 65 (24), 2100152(2021).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Modello di coliteintegrazione probioticacolite indotta da DSStrattamento antibioticosomministrazione per gavagesangue occulto nelle feciistopatologia del colondisturbi infiammatori

Articoli correlati