Questo protocollo descrive come ottenere immagini combinando l'ibridazione in situ e l'immunoistochimica delle sezioni embrionali di zebrafish. L'ibridazione in situ è stata eseguita prima della criosezione, seguita dalla colorazione anticorpale. È utile rilevare i modelli di espressione di due geni nel pesce zebra se c'è una scarsità di anticorpi.
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Articolo metodologico
Sul posto Ibridazione combinata con immunoistochimica in embrioni di zebrafish criosezionati
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Come vertebrato, il pesce zebra è stato ampiamente utilizzato negli studi biologici. Il pesce zebra e gli esseri umani condividono un'elevata omologia genetica, che ne consente l'uso come modello per le malattie umane. Lo studio della funzione genica si basa sulla rilevazione dei modelli di espressione genica. Sebbene l'immunoistochimica offra un modo potente per saggiare l'espressione proteica, il numero limitato di anticorpi disponibili in commercio nel pesce zebra limita l'applicazione del costaining. L'ibridazione in situ è ampiamente utilizzata negli embrioni di zebrafish per rilevare l'espressione di mRNA. Questo protocollo descrive come ottenere immagini combinando ibridazione in situ e immunoistochimica per sezioni di embrioni di zebrafish. L'ibridazione in situ è stata eseguita prima della criosezione, seguita dalla colorazione anticorpale. L'immunoistochimica e l'imaging di una singola criosezione sono stati eseguiti dopo l'ibridazione in situ . Il protocollo è utile per svelare il modello di espressione di due geni, prima mediante il rilevamento di trascritti in situ e poi mediante immunoistochimica contro una proteina nella stessa sezione.
Introduzione
Il pesce zebra è un potente modello di vertebrato per studi di sviluppo e genetica 1,2. Il pesce zebra e l'uomo condividono un'elevata omologia genetica (il 70% dei geni sono condivisi con il genoma umano), che ne consente l'uso come modello per le malattie umane3. Nel pesce zebra, è abbastanza comune rilevare i modelli di espressione di due geni e la loro relazione spaziale. L'immunoistochimica è stata utilizzata per la prima volta nel 1941 per rilevare agenti patogeni nei tessuti infetti applicando anticorpi marcati con FITC4. La proteina bersaglio nella sezion....
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Protocollo
Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Nantong (n. S20191210-402).
1. Raccolta di embrioni di zebrafish
- Sistemare una coppia di zebrafish in vasche di riproduzione la sera prima della raccolta delle uova, uno un pesce zebra transgenico e l'altro un pesce zebra selvatico AB (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB wild-type o Tg (hb9:egfp) X AB wild-type) (vedi la tabella dei materiali). Utilizzare un divisorio diagonale di plastica per separare il maschio e la femmina per precludere....
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Risultati
Questo protocollo può essere utilizzato per esaminare simultaneamente il modello di espressione di un mRNA e di una proteina. Nella Figura 1 viene illustrato il flusso di lavoro sperimentale. Il recettore 5-HT2C è un sottotipo del recettore 5-HT legato dal neurotrasmettitore serotonina (5-idrossitriptamina, 5-HT). È ampiamente distribuito nel sistema nervoso centrale (SNC) e può regolare significativamente una varietà di funzioni cerebrali, tra cui appetito, umore, ansia e comportamento ripr.......
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Discussione
Questo protocollo propone una combinazione di ibridazione in situ e immunoistochimica, un passo importante negli esperimenti di colocalizzazione su embrioni di zebrafish. Questo metodo serve come un modo semplice ed efficiente per analizzare simultaneamente un mRNA e una proteina. L'ibridazione in situ e la colorazione anticorpale sono state eseguite su embrioni di zebrafish. In contrasto con diversi protocolli pubblicati in precedenza14,15,16,<.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), dalla Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) e dalla Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 anticorpo secondario | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-digoxigenina AP Fab frammenti Roche | 11093274910 | ||
| Anticorpo anti-GFP | Millipore | MAB3580 | |
| Reagente bloccante | Roche | 11096176001 | |
| Soluzione bloccante-1 | prodotta in laboratorio | N/A | Sciogliere il reagente bloccante in 1X MAB a una concentrazione finale del 10% (wt/vol). Autoclave e stoccaggio a -20 ° C prima dell'uso. |
| Soluzione bloccante-2 | prodotta in laboratorio | N/A | 0,1% Triton X-100, 3% BSA, 10% siero di capra in 1x PBS |
| BM viola | Roche | 11442074001 | |
| Siero bovino Albumina (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Tampone citrato | Leagene | IH0305 | |
| Acido citrico | Sigma | C2404 | |
| Criopoldo per tessuti, testa 15 mm x 15 mm x 5 mm | Biotecnologia | H4566 | |
| Acqua trattata con DEPC | Sangon Biotech | B501005 | |
| Fotocamera digitale, microscopio a fluorescenza | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 terreno embrionale | prodotto in laboratorio | N/A | 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Siero di capra | Sigma | G9023 | |
| Eparina sale sodico | J& K Scientific | 542858 | |
| HYB | prodotto in laboratorio | N/A | preHYB plus 50 µ g/mL di sale sodico di eparina, 100 µ g/mL di sale di dietilamenoetanolo dell'acido ribonucleico |
| Scatola bagnata immunoistochimica | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Lame leica a basso profilo | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0,1 M acido maleico, 0,15 M NaCl, 0,02% Tween-20, pH 7,5 |
| Acido maleico | Sigma | M0375 | |
| Metanolo | J& K Scientific | 116481 | |
| Blu di metilene | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | prodotto in laboratorio | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Scienze della vita | ADI-950-233 | |
| Paraformaldeide, 4% | Abbexa | abx082483 | prodotto in laboratorio in 1x PBS |
| PBST (1x) | prodotto in laboratorio | N/A | 1x PBS più 0,1% Tween-20 |
| Feniltiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | prodotto in laboratorio | N/A | 50% formammide, 5x SSC, 9,2 mM di acido citrico (pH 6,0), 0,1% Tween-20 |
| Proteinasi K | Roche | 1092766 | |
| Acido ribonucleico dietilamminoetanolo sale | Sigma | R3629 | |
| Provette da 1,5 mL prive di RNasi | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0,2x) | prodotto in laboratorio | N/A | 0,2x SSC più 0,1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | fatto in laboratorio | N/A | 1x SSC più 0,1% Tween-20 |
| Saccarosio | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center dell'Università di Nantong | N/A |
Riferimenti
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology
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Ristampe e permessi
