Qui viene presentata una descrizione dell'isolamento semplice e relativamente rapido del DNA genomico di Caenorhabditis elegans da uno o pochi animali utilizzando un kit di tessuti disponibile in commercio. La preparazione del gDNA risultante è un modello adatto per la PCR.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Estrazione su piccola scala di Caenorhabditis elegans DNA genomico
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'estrazione del DNA genomico da una o poche Caenorhabditis elegans ha molte applicazioni a valle, tra cui la PCR per linee di genotipizzazione, clonazione e sequenziamento. I metodi tradizionali a base di proteinasi K per l'estrazione del DNA genomico da C. elegans richiedono diverse ore. I kit di estrazione commerciali che rompono efficacemente la cuticola di C. elegans ed estraggono il DNA genomico sono limitati. Un metodo facile, più veloce (~ 15 minuti) ed economico per estrarre il DNA genomico di C. elegans che funziona bene per le applicazioni in classe e di ricerca è riportato qui. Questo metodo di estrazione del DNA è ottimizzato per utilizzare singoli o pochi nematodi tardo-larvali (L4) o adulti come materiale di partenza per ottenere un modello affidabile per eseguire la PCR. I risultati indicano che la qualità del DNA è adatta per amplificare bersagli genici di diverse dimensioni mediante PCR, consentendo la genotipizzazione di uno o pochi animali anche a diluizioni a un cinquantesimo del DNA genomico da un singolo adulto per reazione. I protocolli riportati possono essere utilizzati in modo affidabile per produrre rapidamente un modello di DNA da un singolo o un piccolo campione di C. elegans per applicazioni basate su PCR.
Introduzione
Qui, vengono presentati due protocolli correlati per la lisi di Caenorhabditis elegans per rendere il DNA accessibile per le applicazioni basate sulla PCR. La PCR è una tecnica molecolare comunemente usata per molte applicazioni, tra cui la genotipizzazione e l'amplificazione di frammenti di DNA per la clonazione e il sequenziamento, tra gli altri. Il piccolo (1 mm), nematode a vita libera C. elegans è un sistema animale popolare per la ricerca biologica. Ottenere DNA genomico adeguato da un singolo animale o da pochi animali è sufficiente per amplificare la sequenza mediante PCR. Le larve tardive di L4 e gli adulti contengono s....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Manutenzione di C. elegans
NOTA: I ceppi N2 (wild type) e blmp-1(tm548) C. elegans sono stati mantenuti su piastre standard di nematodi (NGM) a 20 °C.
- Preparare le piastre NGM sciogliendo 23,005 g di polvere NGM in 973 ml di acqua in un pallone da 2 L. Coprire l'apertura del pallone con un foglio di alluminio (o tappo autoclavabile che consente lo sfiato) e fissare il rivestimento con nastro adesivo. Autoclave per sciogliere la polvere e sterilizzare il contenuto con un ciclo di sterilizzazione di almeno 30 min.
- Raffreddare il mezzo a 60 °C a bagnomaria.
- Al mezzo raffreddat....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Il DNA genomico di uno o pochi adulti wild-type è stato estratto utilizzando il kit commerciale o il protocollo di lisi tradizionale per confrontare l'efficacia di questi due metodi. Questi lisati sono stati poi utilizzati come modelli per la PCR per amplificare un target più grande di ~ 2.100 bp (codifica blmp-1) o un target più piccolo di ~ 500 bp (codificando una parte di sma-10). Entrambi i metodi hanno prodotto con successo prodotti PCR appropriati (Figura 1A).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Determinare i genotipi di C. elegans è un passo importante durante l'esecuzione di incroci genetici per creare nuovi ceppi di C. elegans . L'estrazione del DNA genomico utilizzando una o poche C. elegans è un passo cruciale nella genotipizzazione di C. elegans. Questo protocollo descrive l'estrazione del DNA genomico da C. elegans utilizzando un kit commerciale. Questo metodo è veloce e funziona in modo robusto. Il DNA genomico estratto con questo metodo può essere utilizzato .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Il ceppo N2 e i batteri E. coli OP50 sono stati ottenuti dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Il ceppo blmp-1(tm548) è stato ottenuto dal National Bioresource Project, Giappone. Gli autori ringraziano WormBase. Questo lavoro è stato supportato da NIH R01GM097591 a T.L.G., finanziamenti interni dalla Texas Woman's University a T.L.G e dal Center for Student Research di TWU a M.F.L.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| nastro per autoclave | Defend | 43237-2 | |
| foglio di alluminio, resistente | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| cloruro di calcio | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Kit Extract-N-Amp (include soluzione per la preparazione dei tessuti, soluzione di estrazione e soluzione di neutralizzazione) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Piastra riscaldante/agitatore Isotemp | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsule | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| solfato di magnesio, puro al 97%, anidro | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuga | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Avvio a caldo DNA polimerasi ad alta fedeltà | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" utilizzato nella Figura Supplementare S1, una polimerasi ad alta velocità e ad alta fedeltà (20– 30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion PCR ad alta fedeltà Master Mix con tampone HF New | England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" nella Figura 1B, una polimerasi ad alta velocità e ad alta fedeltà (15– 30 s/kb) |
| primer Integrated | DNA Technologies | DNA | |
| PrimeSTAR GXL polimerasi | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" nella Figura 1B, una polimerasi ad alta fedeltà (1 min/kb) per modelli ricchi di GC e modelli fino a 30 kb |
| Scala di DNA a 2 log viola a caricamento rapido (0,1– 10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" nella Figura 1B, polimerasi utilizzata nella Figura 1A, C, D, una polimerasi ad alta velocità (10 s/kb) per bersagli fino a 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR miscela di reazione | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" nella Figura 1B, una polimerasi (1 min/kb) per bersagli fino a 7 kb |
| Termociclatore SimpliAmp | Applied Biosystems | A24812 | |
| ancor | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| miscelatore a vortice | Fisher Scientific | 2215365 | |
| piccone a vite senza fine | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
Riferimenti
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
