Estrazione su piccola scala di Caenorhabditis elegans DNA genomico

Qui, vengono presentati due protocolli correlati per la lisi di Caenorhabditis elegans per rendere il DNA accessibile per le applicazioni basate sulla PCR. La PCR è una tecnica molecolare comunemente usata per molte applicazioni, tra cui la genotipizzazione e l'amplificazione di frammenti di DNA per la clonazione e il sequenziamento, tra gli altri. Il piccolo (1 mm), nematode a vita libera C. elegans è un sistema animale popolare per la ricerca biologica. Ottenere DNA genomico adeguato da un singolo animale o da pochi animali è sufficiente per amplificare la sequenza mediante PCR. Le larve tardive di L4 e gli adulti contengono solo ~ 1.000 cellule somatiche (comprese alcune cellule poliploidi multi-nucleari), cellule germinali e (se l'animale è un ermafrodita gravido) prole in utero¹. Tuttavia, questi animali sono protetti da una cuticola che deve essere interrotta per estrarre il DNA genomico². I metodi standard per preparare il modello di DNA genomico dei nematodi per la PCR comportano più passaggi e richiedono diverse ore. Gli animali vengono prima congelati in un tampone di lisi worm contenente proteinasi K (-70 °C o inferiore) per almeno 15-45 minuti (più a lungo è raccomandato da alcuni protocolli)3,4,5,6. Questo passaggio apre gli animali.

Dopo il congelamento, gli animali vengono incubati per 1 ora a 60-65 °C affinché la proteinasi K funzioni, quindi l'enzima viene inattivato per 15-30 minuti a 95 °C. La proteinasi K distrugge le nucleasi che degradano il DNA. L'inattivazione della proteinasi K prima della PCR è importante per evitare che la proteinasi K degradi la DNA polimerasi. I due protocolli basati su kit qui descritti sono metodi rapidi, affidabili ed economici per estrarre il DNA genomico da un singolo animale o da alcuni nematodi per la ricerca quotidiana e l'insegnamento delle applicazioni di laboratorio. Il kit utilizzato è stato originariamente ottimizzato dal produttore per estrarre il DNA da tessuti animali, saliva e capelli⁷. Utilizza una soluzione proprietaria di preparazione dei tessuti e una soluzione di estrazione per lisare le cellule e rendere accessibile il DNA genomico. Una soluzione di neutralizzazione proprietaria neutralizza quindi i componenti che possono inibire la PCR (ad esempio, sali, ioni e molecole leganti Mg²+).

Durante la genotipizzazione, un singolo animale può essere testato. Quando si determina se un ceppo è omozigote, testare sei o più figli di un singolo animale dà un'alta sicurezza che una linea sia omozigote o meno (c'è una probabilità dello 0,02% di scegliere casualmente sei progenie mutanti omozigoti da un genitore eterozigote [(1/4)⁶ × 100% = 0,02%]). Questo metodo 1) è semplice, con meno passaggi rispetto al metodo della proteinasi K, e 2) riduce il tempo di preparazione del modello a 15 minuti. I risultati di questo lavoro dimostrano che il protocollo sviluppato funziona in modo robusto nell'estrazione del DNA genomico da uno o pochi vermi, che possono essere utilizzati in modo affidabile per applicazioni a valle che non richiedono DNA altamente purificato, inclusa la PCR.

1. Manutenzione di C. elegans

NOTA: I ceppi N2 (wild type) e blmp-1(tm548) C. elegans sono stati mantenuti su piastre standard di nematodi (NGM) a 20 °C.

1. Preparare le piastre NGM sciogliendo 23,005 g di polvere NGM in 973 ml di acqua in un pallone da 2 L. Coprire l'apertura del pallone con un foglio di alluminio (o tappo autoclavabile che consente lo sfiato) e fissare il rivestimento con nastro adesivo. Autoclave per sciogliere la polvere e sterilizzare il contenuto con un ciclo di sterilizzazione di almeno 30 min.
2. Raffreddare il mezzo a 60 °C a bagnomaria.
3. Al mezzo raffreddato, aggiungere 25 mL di tampone sterile fosfato 1 M (KH₂PO₄), pH 6,0; 1 mL di soluzione di cloruro di calcio 1 M; e 1 mL di 1 M di soluzione di solfato di magnesio.
4. Mescolare il mezzo su una piastra magnetica per ottenere una miscela omogenea e per evitare raffreddamenti e solidificazioni irregolari (~ 5 min). Assicurarsi che la barra di agitazione giri abbastanza velocemente da creare un vortice ma non così velocemente da introdurre bolle (~ 250-300 giri / min).
5. Versare ~ 25 ml del mezzo in ogni piastra di Petri da 10 cm (~ 40 piastre in totale). Asciugare le piastre a temperatura ambiente durante la notte (tipicamente 16-25 °C).
6. Coltivare una colonia di Escherichia coli OP50 in 30-50 ml di brodo LB durante la notte a 37 °C.
7. Seminare ogni piastra con 500 μL di coltura di E. coli OP50 e lasciarli asciugare a temperatura ambiente prima dell'uso (tipicamente 16-25 °C)⁸. Conservare i piatti a 4 °C per un massimo di 3 settimane.
8. Trasferire C. elegans in piastre seminate utilizzando un raccoglitore di filo o un altro metodo e lasciarli crescere fino allo stadio L4 o adulto alla temperatura richiesta per il ceppo (in genere 16-25 °C, 1-2 giorni se gli animali sono stati placcati affamati come dauers, 3-4 giorni se gli animali sono stati placcati come embrioni)⁸.

2. Estrazione del DNA a verme singolo

NOTA: Questo metodo è utile per estrarre il DNA da un singolo verme (un verme in 1,8 μL di volume totale). Un master mix può essere fatto se più worm saranno lisati contemporaneamente.

1. Programmare un termociclatore per un ciclo a 55 °C per 10 minuti seguito da 95 °C per 3 minuti (programma di lisi).
2. Aliquota 0,8 μL della soluzione di estrazione dal kit sulla parete interna di un tubo PCR da 0,2 mL su ghiaccio. Aggiungere 0,2 μL della soluzione di preparazione del tessuto dal kit alla goccia della soluzione di estrazione. Mescolare per pipettaggio.
3. Identificare un animale L4 o adulto sotto un microscopio di dissezione⁹. Per identificare gli ermafroditi L4, cerca una vulva caratteristica che è visibile come un semicerchio pallido nel mezzo dell'animale. Identifica gli ermafroditi adulti cercando gli animali più grandi sulla piastra che possono avere embrioni ovali visibili nel loro utero.
4. Utilizzando un plettro in filo di platino, trasferire l'animale selezionato nella soluzione¹⁰.
5. Centrifugare brevemente il tubo (2-3 s, ≤6.000 giri/min/2.000 × g) a temperatura ambiente per raccogliere il contenuto sul fondo del tubo.
6. Posizionare il tubo nel termociclatore ed eseguire il programma di lisi impostato al punto 2.1.
7. Quando il programma è completo, centrifugare brevemente il tubo e metterlo sul ghiaccio. Aggiungere 0,8 μL della soluzione di neutralizzazione dal kit alla miscela. Mescolare per pipettaggio.
8. Centrifugare brevemente il tubo a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 giri/min/2.000 × g).
9. Utilizzare direttamente il lisato per la PCR o conservarlo a 4 °C o -20 °C per un uso futuro.
   NOTA: Il DNA estratto è stabile a 4 °C o -20 °C per almeno 6 mesi⁷.

3. Estrazione del DNA di alcuni individui

NOTA: Questo metodo è utile per estrarre il DNA da alcuni vermi. Un mix master può essere preparato se più ceppi verranno lisati contemporaneamente.

1. Programmare il termociclatore per un ciclo a 55 °C per 10 min seguito da 95 °C per 3 min (programma di lisi).
2. Aliquota 2,0 μL della soluzione di estrazione dal kit sulla parete interna di un tubo PCR da 0,2 mL su ghiaccio. Aggiungere 0,5 μL della soluzione di preparazione del tessuto dal kit alla goccia di soluzione di estrazione. Mescolare per pipettaggio.
3. Identificare L4 o animali adulti sotto un microscopio di dissezione⁹. Gli ermafroditi L4 hanno una caratteristica vulva che è visibile come un semicerchio pallido nel mezzo dell'animale. Gli ermafroditi adulti sono gli animali più grandi sul piatto e possono avere embrioni ovali visibili nel loro utero.
4. Usando un plettro di platino, trasferisci alcuni animali nella soluzione: 9 animali producono 1 equivalente animale di DNA genomico per 0,5 μL di lisato e 16 animali producono ~ 1 equivalente animale di DNA genomico in 0,25 μL (3,5 nematodi / μL) ¹⁰.
   NOTA: è difficile trasferire più di 16 animali in questo volume.
5. Centrifugare brevemente il tubo a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 giri/min/2.000 × g).
6. Posizionare il tubo nel termociclatore ed eseguire il programma di lisi impostato al punto 3.1.
7. Quando il programma è completo, centrifugare brevemente il tubo e metterlo sul ghiaccio. Aggiungere 2 μL della soluzione di neutralizzazione dal kit alla miscela. Mescolare per pipettaggio.
8. Centrifugare brevemente il tubo a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 giri/min/2.000 × g).
9. Utilizzare direttamente la lisi per la PCR o conservarla a 4 °C o -20 °C per un uso futuro.
   NOTA: Il DNA estratto è stabile a 4 °C o -20 °C per almeno 6 mesi⁷.

4. Reazione PCR

NOTA: viene descritta un'applicazione a valle di questa tecnica di lisi del verme, che rileva una mutazione di delezione utilizzando una polimerasi veloce. Viene anche dimostrata l'efficacia dei due protocolli di lisi dei vermi nella produzione di DNA modello genomico per una PCR di successo a diluizioni a 1/^{50 di} un verme per reazione.

1. Estrarre il DNA da un singolo verme e 16 vermi utilizzando N2 wild-type e ceppi mutanti, come descritto sopra nella fase 2 e nella fase 3.
2. Preparare diluizioni di 2, 10, 20 e 50 volte del DNA di un singolo verme da animali N2 selvatici.
3. Impostare le reazioni PCR seguendo il protocollo del produttore utilizzando primer specifici per la sequenza di interesse e la miscela master PCR a caldo (Tabella 1 e Tabella 2). Utilizzare 1 μL di DNA non diluito o 2 μL di DNA diluito come modello in ogni reazione.
4. Confermare i prodotti PCR mediante elettroforesi su gel e imaging¹¹.

Il DNA genomico di uno o pochi adulti wild-type è stato estratto utilizzando il kit commerciale o il protocollo di lisi tradizionale per confrontare l'efficacia di questi due metodi. Questi lisati sono stati poi utilizzati come modelli per la PCR per amplificare un target più grande di ~ 2.100 bp (codifica blmp-1) o un target più piccolo di ~ 500 bp (codificando una parte di sma-10). Entrambi i metodi hanno prodotto con successo prodotti PCR appropriati (Figura 1A).

Successivamente, è stata dimostrata la capacità del DNA genomico estratto da kit di fungere da modello per una varietà di DNA polimerasi. Il DNA genomico estratto è stato utilizzato come modello per amplificare un prodotto da 0,5 kb utilizzando quattro polimerasi che possiedono diverse capacità (tra cui velocità, fedeltà e dimensioni del prodotto). I prodotti di dimensioni previste sono stati generati da queste polimerasi utilizzando il modello di una lisi di un singolo adulto o di una lisi di nove adulti (Figura 1B). La sequenza del modello e la fedeltà delle polimerasi PCR per amplificare correttamente la sequenza del modello possono essere confermate dal sequenziamento (Figura supplementare S1). Questo risultato dimostra che il DNA genomico estratto dai protocolli del kit fornisce un modello adatto per una gamma di polimerasi.

L'efficacia della PCR è stata testata utilizzando diverse concentrazioni del DNA genomico estratto da un singolo animale utilizzando il kit commerciale. Il DNA è stato diluito di 2, 10, 20 o 50 volte, e l'equivalente di circa la metà, un decimo, un ventesimo e un cinquantesimo di un verme per reazione è stato utilizzato per le PCR. Queste concentrazioni di modelli di DNA supportavano l'amplificazione di un target più grande di ~2,1 kb o di un target più piccolo di ~0,5 kb (Figura 1C)12. Mentre è stata osservata una resa dipendente dalla concentrazione di DNA del prodotto PCR da 0,5 kb, la resa del prodotto PCR da 2,1 kb è apparsa equivalente in tutte le reazioni.

Per dimostrare che questi protocolli producono DNA genomico da C. elegans che è adatto per la genotipizzazione PCR, il DNA genomico è stato estratto da mutanti singoli e 16 wild-type e blmp-1 loss-of-function (blmp-1(tm548)). Il gene blmp-1 codifica per un fattore di trascrizione con ruoli importanti nella migrazione delle cellule della punta distale, nelle dimensioni corporee e nello sviluppo 12,13,14,15,16. Il mutante blmp-1 ha una delezione di 810 bp che rimuove parti dell'esone 3 e dell'introne 315. Sono stati progettati primer che si traducono in un prodotto da 2.134 bp quando viene utilizzato il modello di DNA wild-type e un prodotto da 1.324 bp se viene utilizzato il DNA blmp-1 (-). I prodotti PCR delle dimensioni appropriate sono stati rilevati utilizzando 1 μL di singolo verme (circa 0,5 vermi per reazione) o lisi a 16 vermi da animali in stadio L4 (3,5 vermi per reazione) (Figura 1D). Questo risultato mostra che il DNA genomico estratto da kit utilizzando entrambi i protocolli fornisce modelli altrettanto efficaci per la PCR alle linee di genotipo.

Questi risultati mostrano che i preparati di DNA genomico di C. elegans che utilizzano un kit commerciale di estrazione del DNA tissutale da animali singoli e multipli possono essere utilizzati in modo affidabile come modelli per la PCR.

Figura 1: I preparati di DNA che utilizzano un kit commerciale da singoli nematodi e più nematodi consentono una robusta amplificazione mediante PCR. I prodotti PCR sono stati caricati su gel di agarosio all'1% in 1x tampone TAE (5 μL (A, B) o 10 μL (C, D) e funzionano a 90-100 V per 30 minuti a 2 ore. Una scala del DNA a 2 tronchi è stata utilizzata per tutti i gel. (A) Confronto della lisi del DNA mediante kit con i metodi tradizionali della proteinasi K per creare un modello utilizzando due set di primer. Gli adulti selvatici sono stati lisati e l'equivalente di un animale è stato usato come modello per tutte le reazioni. Corsie 1-4, prodotto 2.1 kb. Corsia 1, PCR da lisi a singolo verme da proteinasi K. Lane 2, PCR da lisi a singolo verme con il metodo kit. Lane 3, PCR da lisi del verme a nove vermi dalla proteinasi K. Lane 4, PCR dalla lisi del verme a nove vermi con il metodo kit. Corsie 5-8, prodotto 0.5 kb. Lane 5, PCR da lisi a singolo verme da proteinasi K. Lane 6, PCR da lisi a verme singolo con il metodo kit. Lane 7, PCR da lisi del verme a nove vermi dalla proteinasi K. Lane 8, PCR dalla lisi del verme a nove vermi con il metodo kit. (B) Il metodo kit per la lisi del DNA fornisce un modello adatto per la PCR da più polimerasi. Gli adulti selvatici sono stati lisati usando il metodo del kit e l'equivalente della metà di un animale è stato usato come modello PCR per un prodotto da 0,5 kb. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli della polimerasi. Corsia 1, PCR da una lisi a verme singolo con una polimerasi ad alta velocità. Corsia 2, PCR da una lisi a nove vermi con una polimerasi ad alta velocità. Corsia 3, PCR da una lisi a verme singolo con una polimerasi Taq . Corsia 4, PCR da una lisi a nove vermi con una Taq polimerasi. Lane 5, PCR da una lisi a verme singolo con una polimerasi ad alta fedeltà. Lane 6, PCR da una lisi a nove vermi con una polimerasi ad alta fedeltà. Corsia 7, PCR da una lisi a verme singolo con una polimerasi ad alta velocità e ad alta fedeltà. Lane 8, PCR da una lisi a nove vermi con una polimerasi ad alta velocità e ad alta fedeltà. (C) Le diluizioni di una lisi del verme L4 wild-type forniscono un modello per la PCR. Corsie 1-5, prodotto 2.1 kb. Corsie 6-10, target 0.5 kb. Corsia 1 e corsia 6, DNA non diluito. Corsia 2 e corsia 7, DNA diluito 2 volte. Corsia 3 e corsia 8, DNA diluito 10 volte. Corsia 4 e corsia 9, DNA diluito 20 volte. Corsia 5 e corsia 10, DNA diluito 50 volte. (D) Genotipizzazione del locus blmp-1 mediante PCR utilizzando 1 μL di preparati di DNA a singolo e 16 vermi come modello. Corsia 1, PCR da lisi a verme singolo wild-type. Corsia 2, PCR da lisi a verme singolo blmp-1(- ). Corsia 3, PCR da lisi a 16 vermi wild-type. Corsia 4, PCR da lisi blmp-1(-) 16-worm. Abbreviazioni: prep = metodo di preparazione; kb = kilobase; st. = stadio di nematode; = diluizione del DNA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Elenco dei primer.

Tabella 2: Componenti di reazione PCR.

Figura supplementare S1: Sequenziamento per la conferma della qualità del DNA genomico preparato con un kit commerciale. I risultati di due reazioni di sequenziamento corrispondono completamente alla sequenza attesa di oltre 1.600 nucleotidi di DNA amplificati da una polimerasi ad alta velocità e ad alta fedeltà (Pol E) da una lisi a 16 vermi (Tabella 1, Tabella 2A e Tabella 2D). Le estremità di lettura di sequenziamento sono state tagliate per rimuovere le letture di base di bassa qualità. L'allineamento è stato eseguito utilizzando lo strumento di allineamento a sequenza multipla EMBL-EBI MUSCLE (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)17. Fare clic qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.