Le modifiche post-traduzionali (PTM) modificano le strutture e le funzioni delle proteine. I metodi per l'arricchimento simultaneo di più tipi di PTM possono massimizzare la copertura nelle analisi. Presentiamo un protocollo che utilizza cromatografia di affinità metallica immobilizzata Ti(IV) a doppia funzionalità seguita da spettrometria di massa per l'arricchimento e l'analisi simultanei della proteina N-glicosilazione e fosforilazione nei tessuti pancreatici.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Una strategia di arricchimento spin-tip per l'analisi simultanea di N-glicopeptidi e fosfopeptidi da tessuti pancreatici umani
In questo articolo
Sommario
Abstract
La spettrometria di massa può fornire una copertura approfondita delle modifiche post-traduzionali (PTM), sebbene l'arricchimento di queste modifiche da matrici biologiche complesse sia spesso necessario a causa della loro bassa stechiometria rispetto agli analiti non modificati. La maggior parte dei flussi di lavoro di arricchimento dei PTM sui peptidi nei flussi di lavoro di proteomica bottom-up, in cui le proteine vengono digerite enzimaticamente prima che i peptidi risultanti vengano analizzati, arricchiscono solo un tipo di modifica. È l'intero complemento di PTM, tuttavia, che porta a funzioni biologiche, e l'arricchimento di un singolo tipo di PTM può perdere tale diafonia di PTM. PTM crosstalk è stato osservato tra glicosilazione proteica e fosforilazione, i due PTM più comuni nelle proteine umane e anche i due PTM più studiati utilizzando flussi di lavoro di spettrometria di massa. Utilizzando la strategia di arricchimento simultaneo qui descritta, entrambi i PTM sono arricchiti da tessuto pancreatico umano post-mortem, una matrice biologica complessa. La cromatografia a simmetria metallica immobilizzata Ti(IV) a doppia funzionalità viene utilizzata per separare contemporaneamente varie forme di glicosilazione e fosforilazione in frazioni multiple in un comodo metodo basato sulla punta di spin, consentendo analisi a valle delle potenziali interazioni crosstalk PTM. Questo flusso di lavoro di arricchimento per glico- e fosfopeptidi può essere applicato a vari tipi di campioni per ottenere una profilazione profonda di più PTM e identificare potenziali molecole bersaglio per studi futuri.
Introduzione
Le modificazioni post-traduzionali delle proteine (PTM) svolgono un ruolo importante nella modulazione delle strutture proteiche e di conseguenza delle loro funzioni e dei processi biologici a valle. La diversità del proteoma umano aumenta esponenzialmente a causa della variabilità combinatoria offerta da vari PTM. Diverse varianti di proteine dalle loro sequenze canoniche come previsto dal genoma sono conosciute come proteoforme e molte proteoforme derivano da PTM1. Lo studio della diversità proteoforme nella salute e nella malattia è diventato un'area di ricerca di grande interesse negli ultimi anni 2,3
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
È stato ottenuto il consenso per l'uso dei tessuti pancreatici per la ricerca dai parenti più prossimi del defunto ed è stata ottenuta un'autorizzazione da parte dell'Università del Wisconsin-Madison Health Sciences Institutional Review Board. La supervisione dell'IRB non è richiesta perché non coinvolge soggetti umani come riconosciuto da 45 CFR 46.102(f).
ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si maneggiano i reagenti utilizzati in questo protocollo, che includono acidi (formico, acetico, trifluoroacetico), basi (idrossido di ammonio) e criogeni (azoto liquido). Leggere le schede di dati di sicurezza dei reagenti utilizzati per acquisire ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
I dati rappresentativi della spettrometria di massa, inclusi i file raw e i risultati della ricerca, sono stati depositati presso il Consorzio ProteomeXchange tramite il repository partner PRIDE con l'identificatore del set di dati PXD03306522.
In questo lavoro, sono state analizzate le repliche di iniezione duplicate per ogni eluizione di arricchimento. Le identificazioni effettuate da entrambe le repliche tecniche sono state raccolte in ultima analisi. A caus.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La strategia Ti(IV)-IMAC dual-funzionale è utile per l'analisi simultanea di N-glicopeptidi e fosfopeptidi dallo stesso campione in un unico flusso di lavoro di preparazione del campione. I metodi basati su ERLIC hanno anche dimostrato di eseguire l'arricchimento simultaneo dei PTM. Entrambe le strategie sono state utilizzate in precedenza per una copertura profonda nelle analisi PTM14,18. Adattando il metodo dual Ti per ridurre il tempo di incubazione del campio.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata in parte da sovvenzioni del NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 e R21AG065728) e della Juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B e SRA-2016-168-S-B). I dati qui presentati sono stati anche in parte ottenuti grazie al supporto di un premio NIH/NCATS UL1TR002373 attraverso l'Istituto per la ricerca clinica e traslazionale dell'Università del Wisconsin. Gli strumenti Orbitrap sono stati acquistati attraverso il supporto di una sovvenzione per strumenti condivisi NIH (NIH-NCRR S10RR029531) e dell'Ufficio del Vice Cancelliere per la ricerca e l'istruzione universitaria presso l'Università del Wisconsin-Madison. Vorre....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido acetico, glaciale (ACS certificato) | Fisher Scientific | A38S-500 | |
| Acetone (ACS certificato) | Fisher Scientific | A18-1 | |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Acetato di ammonio (cristallino/certificato ACS) | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Idrossido di ammonio (certificato ACS Plus) | Fisher Scientific | A669-212 | |
| Software Byonic | Protein Metrics | n/a | Software commerciale utilizzato per l'analisi glicoproteomica (https://proteinmetrics.com/byos/) |
| C18 Materiale BEH | Acque | 186002353 | Materiale rimosso dalla colonna e utilizzato per impacchettare nano capillari (tirato per integrare la punta utilizzata direttamente in linea con l'ingresso dello strumento) |
| CAE-Ti-IMAC, 100% | J& K Scientific | 2749380-1G | Materiale utilizzato per il Ti(IV)-IMAC a doppia funzione; può essere utilizzato anche per l'arricchimento convenzionale di IMAC/fosfopeptide |
| convenzionale Kit Cellcrusher Cellcrusher | n/a | Utilizzato per macinare campioni di tessuto in polvere prima dell'estrazione | |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuga | Fisher Scientific | 05-401-205 | Per centrifugazione |
| a temperatura controllataCompresse da cocktail con inibitore della proteasi | Sigma | 11697498001 | |
| DTT, grado molecolare (DL-ditiotreitolo) | Promega | V3151 | Agente riducente delle proteine |
| Etanolo, 200 proof (100%), USP | Fisher | 22-032-601 | |
| Fisherbrand Miscelatore a vortice analogico | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Fisherbrand Provette per microcentrifuga a bassa ritenzione (1,5 mL) | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Fisherbrand Provette per microcentrifuga a bassa ritenzione (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Fisherbrand Modello 120 Dismembratore sonico | Fisher Scientific | FB120110 | Per la lisi dei campioni utilizzando |
| l'acido formico ad ultrasuoni, 99,0+%, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Capillare in silice fusa (75 μ m diametro interno, 360 μ Polymicro | Technologies LLC | 100 m TSP075375 | Per colonne tirate e impaccate interne con emettitore integrato |
| Acido fluoridrico (48 % in peso in H2O) | Sigma-Aldrich | 339261-100ML | Utilizzato per l'apertura dell'emettitore della colonna capillare tirata |
| Iodoacetammide, BioUltra | Sigma | I1149-5G | Reagente riducente delle proteine |
| MaxQuant | n/a | n/a | Software gratuito utilizzato per l'analisi fosfoproteomica (https://www.maxquant.org/) |
| Agitatore multi-termico con riscaldamento e raffreddamento | Benchmark Scientific | H5000-HC | Blocco riscaldante |
| Oasis HLB 1 cc Vac Cartuccia, 10 mg di assorbente per cartuccia, 30 &; m, 100/pk | Waters | 186000383 | Desalinizzazione di cartucce su larga scala per digestati triptici (capacità di carico fino a circa 1 mg ciascuna) |
| Puntali per pipette OMIX C18, 100 &; Punta a L, 10 - 100 μ Volume di eluizione L, 1 x 96 puntali | Agilent | A57003100 | Puntale per pipette confezionate su scala ridotta per la desalinizzazione per eluizioni di arricchimento |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000/F | Per l'estrazione di colonne nano-capillari per compresse di inibitori della |
| fosfatasi | PhosSTOP Sigma | 4906845001 | |
| Pierce Kit per il dosaggio delle proteine BCA | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| PolySAX LP (12 μ m, dimensione dei pori 300 Å) | PolyLC | BMSX1203 | Materiale per cromatografia a scambio anionico forte utilizzato per l'arricchimento di glicopeptidi ERLIC/convenzionali |
| Fosfato di potassio monobasico (cristallino/certificato ACS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Cella di iniezione a pressione con piastra di agitazione magnetica integrata | Next Advance | PC77-MAG | Per l'imballaggio di colonne nano-capillari con fase stazionaria fino al limite |
| di 2500 psiSoftware Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | n/a | Software commerciale per l'analisi proteomica (con database integrato, ricerca di nodi) e la visualizzazione dei dati (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) |
| Concentratore sottovuoto SpeedVac SC110 Modello SC110-120 | Savant | n/a | Concentratore centrifugo sottovuoto per l'essiccazione di campioni (sotto calore) |
| Soluzione SDS, Soluzione di dodecil solfato di sodio al 10%, Biologia molecolare/Elettroforesi | Fisher Scientific | BP2436200 | |
| Grado di sequenziamento Tripsina modificata | Promega | V5111 | |
| Cloruro di sodio (cristallino/certificato ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| TopTip, Vuoto, 10-200 & micro; L, Confezione da 96 | Glygen Corporation | TT2EMT.96 | Puntale per pipetta vuoto con foro di dimensioni micron utilizzato che può essere utilizzato per confezionare materiali cromatografici per arricchimenti, in bundle con adattatori per provette Tampone |
| bicarbonato di trietilammonio (TEAB, 1 M, pH 8,5 (volatile)) | Sigma | 90360-100ML | |
| grado di reagente, 99% | Fisher Scientific | 60-017-61 | |
| Tris Base (cristalli bianchi o polvere cristallina/biologia molecolare) | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tripsina/Lys-C Mix, grado di massa | Promega | V5071 | |
| urea (certificato ACS) | Fisher Scientific | U15-500 | |
| acqua, Optima LC/MS grado | Fisher Scientific | W64 |
Riferimenti
- Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
- Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
