Il presente protocollo descrive il metodo di allevamento degli insetti nocivi tortricidi nei laboratori. Le procedure per distinguere il sesso degli insetti ed estrarre gli acidi nucleici per il sequenziamento ad alto rendimento sono stabilite utilizzando due parassiti tortricidi.
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Articolo metodologico
Allevamento di massa e studi molecolari negli insetti parassiti Tortricidae
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tortricidae (Lepidoptera), comunemente noti come tortrix o falene leafroller, comprende molti parassiti agricoli e forestali, che causano gravi perdite agricole. Per comprendere la biologia di tali falene nocive, le tecniche fondamentali sono state molto richieste. Qui, i metodi per l'allevamento di massa, le osservazioni e gli studi molecolari sono sviluppati utilizzando due tortrix del tè, Homona magnanima e Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Gli insetti sono stati allevati in massa con una dieta artificiale affettata e mantenuti dalla consanguineità per oltre 100 generazioni considerando le loro caratteristiche biologiche. Gli insetti hanno vari dimorfismi sessuali; quindi è difficile distinguere il sesso durante le fasi di sviluppo, che hanno impedito i test successivi. Il presente lavoro ha evidenziato che il sesso delle larve di tortricidi potrebbe essere determinato osservando testicoli o colorazione di orceina lattico-acetica per visualizzare il cromosoma W specifico della femmina. Inoltre, utilizzando i metodi di determinazione del sesso, il presente studio ha permesso l'estrazione di acido nucleico da embrioni determinati dal sesso e l'applicazione verso il sequenziamento ad alto rendimento. Questi suggerimenti sono applicabili ad altri insetti parassiti e faciliteranno ulteriori studi morfologici e genetici.
Introduzione
Gli insetti lepidotteri rappresentano oltre il 10% di tutte le specie viventi descritte1 e alcune specie di taxa causano gravi danni alle piante e gravi perdite agricole 2,3. Sebbene siano stati sviluppati studi molecolari e genetici utilizzando insetti modello come il baco da seta Bombyx mori 4,5, gli insetti parassiti rimangono non indagati, in parte a causa delle difficoltà di allevamento e manipolazione 6,7. Pertanto, sono necessari studi e tecniche fondamen....
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Protocollo
1. Raccolta e allevamento di massa degli insetti
- Raccogli gli insetti tortricidi dai campi seguendo i riferimenti 8,12 precedentemente pubblicati.
NOTA: le larve di H. magnanima e A. honmai sono raccolte da foglie di tè danneggiate (Figura 1A); gli adulti sono attratti utilizzando la luce UV portatile da 4 W (lunghezza d'onda di 365 nm, vedi Tabella dei materiali, Figura 1B). - Allevare le larve raccolte (Figura 1C, D) individualment....
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Risultati
Creazione di linee host e loro manutenzione
La vitalità delle larve raccolte sul campo è attribuita in modo diverso alla posizione del campo, alle stagioni e alle condizioni di allevamento (ad esempio, il 90% della vitalità a Taiwan, Taoyuan, come mostrato in Arai et al.12). Circa il 30%-50% delle coppie genererà la prossima generazione come al solito. Per H. magnanima e A. honmai, le matriline sono state mantenute dalla consanguineità per oltre 100 generazion.......
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Discussione
Tortricid comprende diversi parassiti agricoli e forestali; il presente studio ha presentato metodi per allevare tortrix nel corso delle generazioni, osservare l'embriogenesi e il sesso degli insetti e condurre analisi molecolari utilizzando embrioni maturi.
Uno degli ostacoli per lo studio degli insetti nocivi è quello di stabilire metodi di allevamento. Soprattutto, la consanguineità a volte influisce negativamente sulla forma fisica della specie. La riduzione della forma fisica da parte deg.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano riconoscere il sostegno della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Research Fellowships for Young Scientists [Numero di sovvenzione 19J13123 e 21J00895].
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1/2 oncia tazza | FP CHUPA | CP070009 | l'allevamento di insetti; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 oncia coperchio tazza | FP CHUPA | CP070011 | l'allevamento di insetti; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| acido acetico al 99,7% | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Giappone | 36289 | fissazione; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | non mostrato | Quantificazione degli acidi nucleici; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Quantificazione degli acidi nucleici; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| soluzione di cloruro di benzalconio | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilizzazione; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | allevamento di insetti; |
| https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 soluzione DAPI | Dojindo, Tokyo, Giappone | 340-07971 | macchie; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Idrogenofosfato disodico | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS kit di quantificazione | Invitrogen | Q33231 | Quantificazione degli acidi nucleici; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II colonna | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | Estrazione dell'RNA; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Etanolo | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Giappone | 4.98748E+12 | fissazione; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Etilendiammina-N,N,N',N'-tetraacetico Acido tetrasodico Tetraidrato (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tampone per lisi cellulare (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Carta pernisoliera | HEIKO | 2100010 | l'allevamento di insetti; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc& utm_source= Blocco termico Adw |
| WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Giappone | 4002620 | incubazione; https://www.attoeng.site/ |
| eptano | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Giappone | 4.98748E+12 | fissazione; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | non mostrato | Dieta artificiale; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | Estrazione dell'RNA; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanolo | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | estrazione di acidi nucleici; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| acido lattico | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Coloranti; |
| metanolo | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Giappone | 4.98748E+12 | fissaggio; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Miscelatore Voltex; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano fotometro NP 80 | Implen | non mostrato | Quantificazione degli acidi nucleici; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Confezione naturale ampia | Inomata chimica | 1859 | allevamento di insetti; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3% 82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II Kit di preparazione della libreria di RNA per Illumina | New England BioLabs | E7770S | Preparazione della libreria; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orceina | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Coloranti; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldeide | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fissaggio; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Poliossietilene(20) Monolaurato di sorbitano | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Luce nera UV portatile (4W, lunghezza d'onda 365nm) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Giappone | non mostrato | Collezione di insetti; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Cloruro di potassio | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Diidrogeno fosfato di potassio | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Soluzione di proteinasi K | Merck | 71049-4CN | Estrazione del DNA; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| soluzione di precipitazione delle proteine | Qiagen | 158912 | estrazione del DNA; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Quantificazione degli acidi nucleici; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicina | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Giappone | 4.98748E+12 | Sterilizzazione; |
| https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html Kit di quantificazione dell'RNA HS | Invitrogen | Q32855 | Quantificazione degli acidi nucleici; soluzione di |
| https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 RNasi | Nippon Gene | 313-01461 | Estrazione dell'RNA; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | non mostrato | Dieta artificiale; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Cloruro di sodio | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodio Dodecil Solfato | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tampone di lisi cellulare (SDS); |
| https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html soluzione acquosa di ipoclorito di sodio | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Giappone | 4.98748E+12 | separazione di uova; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetraciclina cloridrato | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Giappone | 4.98748E+12 | Sterilizzazione; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tampone per lisi cellulare; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| acqua distillata ultrapura | Invitrogen | 10977023 | estrazione di RNA; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
Riferimenti
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society<....
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Ristampe e permessi
