Articolo metodologico

Spettroscopia Ensemble Force mediante Shear Forces

DOI:

10.3791/63741

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26 luglio 2022

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1Department of Chemistry & Biochemistry, Kent State University

In questo articolo

Sommario

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La spettroscopia di forza d'insieme (EFS) è una tecnica robusta per lo sviluppo meccanico e il rilevamento in tempo reale di un insieme di strutture biomolecolari in campi biofisici e biosensibili.

Abstract

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Le tecniche a singola molecola basate sulla fluorescenza e sui principi meccanochimici forniscono una sensibilità superiore nel rilevamento biologico. Tuttavia, a causa della mancanza di elevate capacità di produttività, l'applicazione di queste tecniche è limitata in biofisica. La spettroscopia di forza d'insieme (EFS) ha dimostrato un elevato rendimento nello studio di un massiccio insieme di strutture molecolari convertendo gli studi meccanochimici delle singole molecole in quelli degli insiemi molecolari. In questo protocollo, le strutture secondarie del DNA (i-motivi) sono state spiegate nel flusso di taglio tra il rotore e lo statore di una punta omogeneizzatore a velocità di taglio fino a 77796/s. Sono stati dimostrati gli effetti delle portate e delle dimensioni molecolari sulle forze di taglio sperimentate dall'i-motif. La tecnica EFS ha anche rivelato l'affinità di legame tra i motivi del DNA e i ligandi. Inoltre, abbiamo dimostrato una reazione chimica del clic che può essere azionata dalla forza di taglio (cioè la chimica meccano-clic). Questi risultati stabiliscono l'efficacia dell'uso della forza di taglio per controllare la conformazione delle strutture molecolari.

Introduzione

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Nella spettroscopia di forza a singola molecola1 (SMFS), le proprietà meccaniche delle singole strutture molecolari sono state studiate da strumenti sofisticati come il microscopio a forza atomica, le pinzette ottiche e le pinzette magnetiche 2,3,4. Limitato dallo stesso requisito di direzionalità delle molecole nelle configurazioni di generazione/rilevamento della forza o dal piccolo campo visivo nelle pinzette magnetiche e nel microscopio a forza centrifuga miniaturizzato (MCF)5,6,7,8

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Protocollo

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NOTA: Tutti i tamponi e i reagenti chimici utilizzati in questo protocollo sono elencati nella tabella Materiali.

1. Preparazione del microscopio a forza di taglio

NOTA: Il microscopio a forza di taglio contiene due parti, un'unità di reazione (omogeneizzatore) e un'unità di rilevamento (microscopio a fluorescenza). L'ingrandimento dell'oculare è 10x e l'ingrandimento della lente dell'obiettivo (aria) è 4x.

  1. Assemblare l'omogeneizzatore e il microscopio su un tavolo di montaggio. Indossare occhiali e accendere il microscopio a fluorescenza, quindi regolare l'omogeneizzat....

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Risultati

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La Figura 1 illustra lo sviluppo meccanico e il rilevamento in tempo reale delle molecole dell'insieme in EFS. Nella Figura 1B, è stato osservato che l'intensità di fluorescenza del DNA i-motif aumenta con la velocità di taglio che varia da 9.724 s-1 a 97.245 s-1 in un tampone MES a pH 5,5. Come controllo, l'intensità della fluorescenza non è aumentata quando lo stesso DNA i-motif è stato tagliato ad una velocità di 63.209 .......

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Discussione

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Il protocollo descritto in questo manoscritto consente di studiare in tempo reale lo sviluppo di un insieme di strutture biomolecolari mediante forza di taglio. I risultati qui presentati sottolineano che le strutture del DNA i-motif possono essere spiegate dalla forza di taglio. Lo sviluppo del motivo i-legato al ligando e le reazioni a scatto azionate dalla forza di taglio sono state applicazioni proof-of-concept per questo metodo di spettroscopia a forza d'insieme.

La F.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro di ricerca è stato sostenuto dalla National Science Foundation [CBET-1904921] e dal National Institutes of Health [NIH R01CA236350] a H. M.

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3K MWCO AmiconMillipore Sigmaufc900324
Acido ascorbicoVWRVWRC0143-100G
Calfluor 488 azideClick Chemistry Tools1369-1
CuClThermo 
Punta di dispersioneSvizzeraPT-DA07/2EC-B101
DNA oligoIDT Colorante IDT
/5Cy5/
Microscopio a fluorescenzaJanpanNikon TE2000-U
OmogeneizzatoreSvizzeraPT 3100D
HPGSanta Cruz Biotechnologycs-295271
KClVWRVWRC26760.295
MESVWRVWRCE169-500G
EstintoreIDT/3IAbRQSp/
TBTATokyo Chemical IndustryT2993
TrisVWRVWRCE133-100G
ACRO270525000

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  2. Woodside, M. T., et al.

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Tag

Forza di taglioI motif del DNAmicroscopia a fluorescenzabiofisica ad alta produttivitlegame del ligandoclick chemistrysrotolamento molecolareflusso di taglioripiegamento dei polimeri

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