Spettroscopia Ensemble Force mediante Shear Forces

Summary

La spettroscopia di forza d'insieme (EFS) è una tecnica robusta per lo sviluppo meccanico e il rilevamento in tempo reale di un insieme di strutture biomolecolari in campi biofisici e biosensibili.

Abstract

Le tecniche a singola molecola basate sulla fluorescenza e sui principi meccanochimici forniscono una sensibilità superiore nel rilevamento biologico. Tuttavia, a causa della mancanza di elevate capacità di produttività, l'applicazione di queste tecniche è limitata in biofisica. La spettroscopia di forza d'insieme (EFS) ha dimostrato un elevato rendimento nello studio di un massiccio insieme di strutture molecolari convertendo gli studi meccanochimici delle singole molecole in quelli degli insiemi molecolari. In questo protocollo, le strutture secondarie del DNA (i-motivi) sono state spiegate nel flusso di taglio tra il rotore e lo statore di una punta omogeneizzatore a velocità di taglio fino a 77796/s. Sono stati dimostrati gli effetti delle portate e delle dimensioni molecolari sulle forze di taglio sperimentate dall'i-motif. La tecnica EFS ha anche rivelato l'affinità di legame tra i motivi del DNA e i ligandi. Inoltre, abbiamo dimostrato una reazione chimica del clic che può essere azionata dalla forza di taglio (cioè la chimica meccano-clic). Questi risultati stabiliscono l'efficacia dell'uso della forza di taglio per controllare la conformazione delle strutture molecolari.

Introduction

Nella spettroscopia di forza a singola molecola¹ (SMFS), le proprietà meccaniche delle singole strutture molecolari sono state studiate da strumenti sofisticati come il microscopio a forza atomica, le pinzette ottiche e le pinzette magnetiche ^2,3,4. Limitato dallo stesso requisito di direzionalità delle molecole nelle configurazioni di generazione/rilevamento della forza o dal piccolo campo visivo nelle pinzette magnetiche e nel microscopio a forza centrifuga miniaturizzato (MCF)5,6,7,8

Protocol

NOTA: Tutti i tamponi e i reagenti chimici utilizzati in questo protocollo sono elencati nella tabella Materiali.

1. Preparazione del microscopio a forza di taglio

NOTA: Il microscopio a forza di taglio contiene due parti, un'unità di reazione (omogeneizzatore) e un'unità di rilevamento (microscopio a fluorescenza). L'ingrandimento dell'oculare è 10x e l'ingrandimento della lente dell'obiettivo (aria) è 4x.

1. Assemblare l'omogeneizzatore e il microscopio su un tavolo di montaggio. Indossare occhiali e accendere il microscopio a fluorescenza, quindi regolare l'omogeneizzat....

Results

La Figura 1 illustra lo sviluppo meccanico e il rilevamento in tempo reale delle molecole dell'insieme in EFS. Nella Figura 1B, è stato osservato che l'intensità di fluorescenza del DNA i-motif aumenta con la velocità di taglio che varia da 9.724 s-1 a 97.245 ^s-1 in un tampone MES a pH 5,5. Come controllo, l'intensità della fluorescenza non è aumentata quando lo stesso DNA i-motif è stato tagliato ad una velocità di 63.209 .......

Discussion

Il protocollo descritto in questo manoscritto consente di studiare in tempo reale lo sviluppo di un insieme di strutture biomolecolari mediante forza di taglio. I risultati qui presentati sottolineano che le strutture del DNA i-motif possono essere spiegate dalla forza di taglio. Lo sviluppo del motivo i-legato al ligando e le reazioni a scatto azionate dalla forza di taglio sono state applicazioni proof-of-concept per questo metodo di spettroscopia a forza d'insieme.

La F.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3K MWCO Amicon	Millipore Sigma	ufc900324
Acido ascorbico	VWR	VWRC0143-100G
Calfluor 488 azide	Click Chemistry Tools	1369-1
CuCl	Thermo
Punta di dispersione	Svizzera	PT-DA07/2EC-B101
DNA oligo	IDT Colorante IDT
		/5Cy5/
Microscopio a fluorescenza	Janpan	Nikon TE2000-U
Omogeneizzatore	Svizzera	PT 3100D
HPG	Santa Cruz Biotechnology	cs-295271
KCl	VWR	VWRC26760.295
MES	VWR	VWRCE169-500G
Estintore	IDT	/3IAbRQSp/
TBTA	Tokyo Chemical Industry	T2993
Tris	VWR	VWRCE133-100G