Questo protocollo descrive un metodo per stabilire ed eseguire un test di ferita da graffio su monostrati bidimensionali (2D) derivati da enteroidi tridimensionali (3D) isolati da ileo di primati non umani.
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Articolo metodologico
Effetto dell'acido ialuronico 35 kDa su un modello in vitro di danno intestinale pretermine e guarigione mediante monostrati di derivazione enteroide
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I saggi in vitro delle ferite da graffio sono comunemente usati per studiare i meccanismi e le caratteristiche della guarigione epiteliale in una varietà di tipi di tessuto. Qui, descriviamo un protocollo per generare un monostrato bidimensionale (2D) da enteroidi primati non umani tridimensionali (3D) derivati da cripte intestinali dell'ileo terminale. Questi monostrati derivati da enteroidi sono stati poi utilizzati in un test in vitro per testare la capacità dell'acido ialuronico 35 kDa (HA35), un imitatore di HA del latte umano, di promuovere la migrazione e la proliferazione cellulare lungo il bordo della ferita epiteliale. Dopo che i monostrati sono cresciuti fino alla confluenza, sono stati graffiati manualmente e trattati con HA35 (50 μg / mL, 100 μg / mL, 200 μg / mL) o controllo (PBS). La migrazione cellulare e la proliferazione nel gap sono state riprese utilizzando un microscopio a luce trasmessa attrezzato per l'imaging di cellule vive. La chiusura della ferita è stata quantificata come percentuale di guarigione delle ferite utilizzando il plug-in Wound Healing Size in ImageJ. L'area del graffio e il tasso di migrazione cellulare e la percentuale di chiusura della ferita sono stati misurati nell'arco di 24 ore. HA35 in vitro accelera la guarigione delle ferite nei piccoli monostrati enteroidi intestinali, probabilmente attraverso una combinazione di proliferazione cellulare sul bordo della ferita e migrazione verso l'area della ferita. Questi metodi possono potenzialmente essere utilizzati come modello per esplorare la rigenerazione intestinale nell'intestino tenue umano pretermine.
Introduzione
L'enterocolite necrotizzante (NEC) è una delle emergenze gastrointestinali più comuni nei neonati pretermine1. La malattia è caratterizzata da una grave infiammazione intestinale che può rapidamente deteriorarsi in necrosi intestinale, sepsi e potenzialmente morte. Sebbene l'eziologia non sia chiara, l'evidenza suggerisce che la NEC è multifattoriale ed è il risultato di una complessa interazione di alimentazione, colonizzazione batterica anormale e epitelio intestinale immaturo 2,3. I neonati pretermine hanno aumentato la permeabilità intestinale, la colonizzazione batterica anormale e....
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Protocollo
Tutte le procedure animali in questo studio sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Centro di scienze della salute dell'Università dell'Oklahoma. A seguito dell'approvazione istituzionale, campioni fetali di convenienza dell'intestino tenue da un primate non umano pretermine (NHP, gestazione al 90%, babbuino olivastro, Papio anubis) sono stati ottenuti dopo l'eutanasia per uno studio separato (Protocollo # 101523-16-039-I) 20.
1. Istituzione di enteroidi intestinali 3D di primati pretermine non umani
- Preparazione dei supporti
NOTA: I....
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Risultati
Gli effetti dell'HA sulla riparazione dei tessuti e sulla guarigione delle ferite in vari tessuti e organi sono ben documentati; tuttavia, gli effetti specifici dell'HA con un peso molecolare di 35 kDa sulla guarigione e rigenerazione dell'intestino tenue fetale o neonatale sono attualmente sconosciuti. Per testare la capacità di HA35 di promuovere la guarigione delle ferite in un modello dell'intestino tenue fetale o neonatale, abbiamo generato enteroidi intestinali 3D dal tessuto ileale NHP e ulteriormente dissociato q.......
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Discussione
Il tratto gastrointestinale di un neonato pretermine è sottoposto a continua pressione rigenerativa da ripetute esposizioni a insulti ambientali associati a disbiosi, metaboliti batterici infiammatori e tossine e ipossia intermittente23,24. Sfortunatamente, l'epitelio intestinale del neonato pretermine non è in grado di stabilire rapidamente l'integrità funzionale23, con conseguente disfunzione della barriera, aumento della permeabilità in.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare e nessun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. HC è supportato dalla sovvenzione P20GM134973 del National Institutes of Health. KB è supportato da una sovvenzione della Children's Hospital Foundation (CHF) e della Presbyterian Health Foundation (PHF). I servizi di imaging delle cellule vive forniti dal nucleo di genomica funzionale del cancro sono stati supportati in parte dal National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 e dal National Cancer Institute Grant P30CA225520 del National Institutes of Health, assegnato al Centro di scienze della....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pipetta sierologica da 10 mL | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Piatto, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific 172931 | ||
| 15 mL Tubo conico | VWR | 89039-666 | |
| 24 pozzetti, trattato TC, piastra a fondo piatto | Corning | 3524 | |
| 37 &; M Filtro cellulare reversibile | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL tubo conico | VWR | 89039-658 | |
| 70 &; m Filtri cellulari sterili | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumina, bovina (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) con 15 mM di tampone HEPES | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Reagente di dissociazione | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | Questo è HOGMY, ma senza l'Y-27632 o antibiotici. Usato anche come base per l'HOGM, ma poi mancano solo gli antibiotici. |
| Lipopolisaccaridi da Escherichia coli O111:B4, purificati mediante cromatografia di filtrazione su gel | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Baseline Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treatated, Micropiastra a fondo piatto | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (soluzione salina tamponata con fosfato), 1X [-] calcio, magnesio, pH 7,4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Si tratta di antibiotici ad ampio spettro |
| Ialuronato di sodio, grado di ricerca, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Contatore di cellule automatizzato | Azienda: Bio-Rad | 1450102 | |
| Tripsina-EDTA 1X, 0,25% tripsina | Fisher Scientific MT25053CI | ||
| Y-27632 | Tecnologie STEMCELL | 72302 |
Riferimenti
- Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1(2001).
- Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H.
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Ristampe e permessi
