Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule primarie di Schwann, cheratinociti e fibroblasti dal prepuzio umano

Sommario

Lo studio della guarigione delle ferite associata a lesioni muscoloscheletriche richiede spesso la valutazione delle interazioni in vitro tra cellule di Schwann (SC), cheratinociti e fibroblasti. Questo protocollo descrive l'isolamento, la coltura e la caratterizzazione di queste cellule primarie dal prepuzio umano.

Abstract

Questo protocollo descrive i metodi di isolamento, le condizioni di coltura e la caratterizzazione delle cellule primarie umane con alta resa e vitalità utilizzando una rapida dissociazione enzimatica della pelle. I cheratinociti primari, i fibroblasti e le cellule di Schwann sono tutti raccolti dal prepuzio neonato umano, che è disponibile seguendo le procedure standard di cura. La pelle rimossa viene disinfettata e il grasso sottocutaneo e il muscolo vengono rimossi usando un bisturi. Il metodo consiste nella separazione enzimatica e meccanica degli strati epidermico e dermico, seguita da un'ulteriore digestione enzimatica per ottenere sospensioni unicellulari da ciascuno di questi strati cutanei. Infine, le singole cellule vengono coltivate in terreni di coltura cellulare appropriati seguendo protocolli di coltura cellulare standard per mantenere la crescita e la vitalità per settimane. Insieme, questo semplice protocollo consente l'isolamento, la coltivazione e la caratterizzazione di tutti e tre i tipi di cellule da un singolo pezzo di pelle per la valutazione in vitro di modelli pelle-nervo. Inoltre, queste cellule possono essere utilizzate insieme in co-colture per valutare i loro effetti l'una sull'altra e le loro risposte al trauma in vitro sotto forma di graffi eseguiti roboticamente nella coltura associata alla guarigione delle ferite.

Introduzione

Le cellule primarie derivate da tessuto vivente e coltivate in condizioni in vitro assomigliano molto allo stato fisiologico¹, rendendole un modello ideale per indagare i processi fisiologici e fisiopatologici. La pelle contiene più tipi di cellule, tra cui cheratinociti, fibroblasti, sebociti, melanociti e cellule di Schwann (SC), che possono essere isolate e coltivate per esperimenti in vitro . Non sono stati descritti metodi per isolare e coltivare cheratinociti, fibroblasti e SC, da un singolo pezzo di pelle. L'obiettivo di questo protocollo è duplice: 1) stabilire un metodo affidabile e riproducibile per l'isolamento e la....

Protocollo

L'acquisizione e l'uso di tessuto del prepuzio umano de-identificato a fini di ricerca è stato esaminato e ha ricevuto la determinazione di "ricerca non umana" dal Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB # 17574).

NOTA: Seguendo il protocollo riportato di seguito, 2,4 x 10⁶ cheratinociti, 4,4 x 10⁶ fibroblasti e 1,1 x 10⁶ SC sono ottenuti da un singolo prepuzio. In generale, queste cellule primarie possono essere utilizzate per 3 passaggi, a seconda delle condizioni sperimentali.

1. Isolamento delle cellule primarie e condizioni di coltura

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Risultati

Il prepuzio neonatale normale è stato utilizzato per l'isolamento dei cheratinociti epidermici primari e delle SC e dei fibroblasti dermici. Le cellule primarie isolate sono state coltivate in rispettivi terreni di coltura cellulare contenenti fattori di crescita. Dopo la semina di SC e fibroblasti in palloni di coltura, la maggior parte delle cellule ha aderito al fondo del pallone entro 2 ore. Nel caso dei cheratinociti, la maggior parte dei cheratinociti ha aderito entro 24 ore. I cheratinociti primari epidermici isol.......

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo per isolare tre distinte popolazioni cellulari da un singolo pezzo del prepuzio, vale a dire cheratinociti, fibroblasti e cellule di Schwann. Sono disponibili alcuni protocolli di isolamento per isolare cheratinociti e fibroblasti 2,3,5,6, ma nessuno descrive l'isolamento SC. Oltre alle cellule strutturali chiave della pelle, dei cheratinociti e dei fibrobla.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,22 µ Filtri sterili M (Millex-GP Syringe Filter Unit, polietersulfone)	MilliporeSigma	SLGPR33RS
70 &; Filtri cellulari M	CELLTREAT	229483
100 µ Filtri cellulari M	CELLTREAT	229485
siringhe monouso da 1 mL	BD Luer-Lok	BD-309659
siringhe monouso da 5 mL (siringa sterile, monouso)	Siringhe monouso BD Luer-Lok	BD309646
10 mL BD	Luer-Lok	BD305462
1% TritonX-100	Sigma	X100-1L	Preparato al momento dell'uso
4% soluzione di paraformaldeide	ThermoFisher Scientific	J19943. K2	Pronto all'uso e per la conservazione a 4 gradi C
5% BSA	Sigma	A7906-100G	Preparato al momento dell'uso
70% etanolo	Pharmco	111000200
Antibiotic	ScienCell Research	503
Chemometec Fial1-Cassetta	Fisher Scientific	NC1420193
Collagenase	Gibco	17018-029
Vetrino coprioggetti	Fisherbrand	12544D 22*50-1.5
Dispase I	Sigma-Aldrich	D46693
DMEM medium basale	ScienCell Research	9221
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco priva di Ca2+ e Mg2+ (DPBS)	Corning	21-031-CV)
Nunc 15 mL Provette da centrifuga sterili coniche in polipropilene	ThermoFisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Provette da centrifuga sterili coniche in polipropilene	ThermoFisher Scientific	339653
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL	Fisherbrand	02-681-5
Siero fetale bovino (FBS)	ThermoFisher Scientific	10082147
Terreno completo per fibroblasti	ScienCell Research	2331
Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-topo di capra (H+L), Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11032	Diluizione (1:500)
Anticorpo secondario anti-coniglio di capra IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	Diluizione (1:500)
Soluzione salina tamponata di Hanks (tampone HBSS)	Lonza	CC-5022
Prepuzio			Tessuto del prepuzio umano de-identificato per scopi di ricerca (Institutional Review Board- IRB #17574).
Terreno cheratinocita KGM-GOLD (oro KGM e integratori)	Lonza	00192151 e 00192152
Anticorpo di actina del muscolo alfa liscio di topo	ThermoFisher Scientific	14-9760-82	Diluizione (1:200)
Anticorpo di topo Citocheratina14	Abcam	ab7800	Diluizione (1:100)
Anticorpo di topo S100	ThermoFisher Scientific	MA5-12969	Diluizione (1:200)
Multicamera (vetrino a 4 pozzetti)	Tab-Tek	154526
NucleoCounter -Via1-Cassette	Chemometec	941-0012
Poli-L-Lisina (PLL)	ScienCell Research	32503
ProLong Gold Anti-fade Mountant con DAPI	Invitrogen	P36935
Anticorpo di coniglio K10	Sigma-Aldrich	SAB4501656	Diluizione (1:100)
Anticorpo p75-NTR di coniglio	Millipore	AB1554	Diluizione (1:500)
Vimentina di coniglio	ProteinTech	10366-1-AP	Diluizione (1:200)
Terreno di coltura cellulare Schwann	ScienCell Research	1701
Pinzetta di precisione DUMONT dritta con punte extra fini Dumostar, 5	ROTH	LH75.1	Sterilizzare con alcool al 70% prima dell'uso
Forbici IRIS, affilate/affilate. Lunghezza 4– 3/8" (111 mm)	Codman	54-6500	Sterilizzare con il 70% di alcol prima dell'uso
Lama chirurgica - affilata sterilizzata (lame Duro Edge Economy Single Edge)	Azienda di lame di rasoio	94-0120	Sterilizzare con il 70% di alcol prima dell'uso
Pallone di coltura T25	Corning	353109
Tampone di neutralizzazione della tripsina (TNS)	Lonza	CC-5002
Tripsina/EDTA	Lonza	CC-5012
Microscopio invertito	ZEISS	Axio Observer 7- Axiocam 506 mono Microscopio Apotome.2	Per l'immunofluorescenza di vetrini da camera contenenti cellule colorate
Microscopio invertito	ZEISS	Primovert	Per la visulazione/osservazione dell'adesione o del distacco delle cellule

umano