Tecniche di microscopia per l'interpretazione della colonizzazione fungina nei tessuti delle piante micoeterotrofiche e della germinazione simbiotica dei semi

Sommario

Questo protocollo mira a fornire procedure dettagliate per la raccolta, la fissazione e il mantenimento di campioni di piante micoeterotrofiche, applicando diverse tecniche di microscopia come la microscopia elettronica a scansione e trasmissione, la microscopia ottica, confocale e a fluorescenza per studiare la colonizzazione fungina nei tessuti delle piante e nei semi germinati con funghi micorrizici.

Abstract

La botanica strutturale è una prospettiva indispensabile per comprendere appieno l'ecologia, la fisiologia, lo sviluppo e l'evoluzione delle piante. Quando si studiano piante micoeterotrofiche (cioè piante che ottengono carbonio dai funghi), aspetti notevoli dei loro adattamenti strutturali, i modelli di colonizzazione dei tessuti da parte dei funghi e la morfoanatomia degli organi sotterranei possono illuminare le loro strategie di sviluppo e le loro relazioni con le ife, la fonte di nutrienti. Un altro ruolo importante dei funghi simbionti è legato alla germinazione dei semi di orchidea; tutte le specie di Orchidaceae sono micoeterotrofiche durante la germinazione e la fase di semina (micoeterotrofia iniziale), anche quelle che fotosintetizzano negli stadi adulti. A causa della mancanza di riserve nutrizionali nei semi di orchidee, i simbionti fungini sono essenziali per fornire substrati e consentire la germinazione. L'analisi delle fasi di germinazione da prospettive strutturali può anche rispondere a domande importanti riguardanti l'interazione dei funghi con i semi. Diverse tecniche di imaging possono essere applicate per svelare gli endofiti dei funghi nei tessuti vegetali, come proposto in questo articolo. Le sezioni a mano libera e sottili degli organi vegetali possono essere colorate e quindi osservate con microscopia ottica. Un fluorocromo coniugato all'agglutinina del germe di grano può essere applicato ai funghi e co-incubato con Calcofluor White per evidenziare le pareti cellulari delle piante in microscopia confocale. Inoltre, le metodologie di scansione e microscopia elettronica a trasmissione sono dettagliate per orchidee micoeterotrofe e vengono esplorate le possibilità di applicare tali protocolli in piante correlate. La germinazione simbiotica dei semi di orchidea (cioè in presenza di funghi micorrizici) è descritta nel protocollo in dettaglio, insieme alle possibilità di preparare le strutture ottenute da diversi stadi di germinazione per analisi con microscopia ottica, confocale ed elettronica.

Introduzione

La ricerca strutturale in botanica, che copre la morfologia e l'anatomia delle piante, è fondamentale per comprendere l'intero organismo^1,2 e fornisce prospettive indispensabili per integrare e contribuire alla conoscenza riguardante l'ecologia, la fisiologia^, lo sviluppo e l'evoluzione delle piante³. I metodi in morfologia e anatomia vegetale comprendono attualmente protocolli, attrezzature e conoscenze sviluppate di recente e più di un secolo fa². L'esecuzione e l'adattamento continui di metodi classici (ad esempio, microscopia ottica) insieme a tecniche più re....

Protocollo

1. Raccolta, fissaggio e conservazione dei campioni

NOTA: Le piante completamente MH si trovano di solito nel sottobosco della foresta oscura 12,13, principalmente in aree umide e abbondanti di rifiuti, mentre le piante parzialmente MH possono essere trovate nelle foreste più aperte^12,13. Le piante MH di solito hanno organi sotterranei ben sviluppati in una varietà di forme e dimensioni.

1. Quando raccogli le specie MH, esplora il terreno intorno alla base vegetale, facendo attenzione a non danneggiar....

Risultati

Seguendo le fasi essenziali di fissaggio del tessuto vegetale si ottengono strutture cellulari il più possibile simili allo stato vivente, considerando la morfologia, il volume e l'organizzazione spaziale dei componenti cellulari e dei tessuti¹⁶. Osservare tali tratti nei campioni dopo la fissazione chimica (Figura 4). La figura 4C-F rappresenta campioni adeguatamente fissati al microscopio ottico. Seguir.......

Discussione

Le analisi delle immagini nell'anatomia e morfologia delle piante hanno un importante potenziale per raggiungere gli obiettivi e aiutare a comprendere le relazioni tra le piante micoeterotrofe e i loro indispensabili endofiti fungini, come dimostrato dagli studi sugli organi sotterranei^6,40, dalle analisi strutturali della germinazione simbiotica dei semi³⁹ e dalle strutture aeree e riproduttive ⁴¹ . La botanica str.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acetone	Sigma-Aldrich	179124	(per montaggio su tronchi SEM)
Agar-agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(per test di germinazione dei semi)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	colorante fluorescente (rileva la cellulosa)
Soluzione tampone citrato, 0,09 M pH 4,8	Sigma-Aldrich	C2488	(per colorazione con blu di toluidina O)
Nastro biadesivo conduttivo in carbonio	Fisher Scientific	50-285-81	(per SEM)
Microscopio confocale	Zeiss		(qualsiasi modello)
Griglie in rame	Sigma-Aldrich	G4776	(per TEM)
Essiccatore a punto critico	Balzer		(qualsiasi modello)
Criostato	Leica Biosystems		(qualsiasi modello)
Microscopio da dissezione	Leica Biosystems		(= stereomicroscopio, qualsiasi modello)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	terreno di montaggio rapido per microscopia
Alcool etilico, puro (≥ 99,5%)	Sigma-Aldrich	459836	(= etanolo, per processi di disidratazione)
Soluzione di formaldeide, 37%	Sigma-Aldrich	252549	(per la preparazione della soluzione NBF)
Soluzione di formalina, tamponata neutra, 10%	Fissativo tissutale istologico	Sigma-Aldrich	HT501128 10
Capsule di gelatina per TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(per la polimerizzazione della resina in TEM)
Soluzione di gelatina, 2% in H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(diluito per la preparazione di vetrini - adesione OCT)
Soluzione di glutaraldeide, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(per Karnovsky' HistoResin
	inclusione del metacrilato di glicole (GMA)	Biosystems	14702231731
Iodio	Sigma-Aldrich	207772	(per la preparazione della soluzione Lugol)
Nitrato di piombo (II)	Sigma-Aldrich	228621	Pb(NO3)2 (per colorazione con contrasto TEM)
Microscopio ottico	Olympus		(qualsiasi modello)
LR Resina acrilica bianca	Sigma-Aldrich	L9774	resina acrilica idrofila per TEM
Soluzione Lugol	Sigma-Aldrich	62650	(per la colorazione)
Tronchetti metallici per montature per campioni	Rave Scientific		(per SEM, diversi modelli)
Microtomo	Leica Biosystems		manuale rotativo microtomo o altro modello
Farina d'avena agar (OMA)	Millipore	O3506	(per test di germinazione dei semi)
OCT Compound, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	terreno di inclusione per tessuti congelati
Tetrossido di osmio	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (per postfissazione TEM)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	film
termoplastico sigillanteParaformaldeide	Sigma-Aldrich	158127	(per Karnovsky' Soluzione di
poli-L-lisina, 0,1% in H2O	Sigma-Aldrich	P8920	(per la preparazione di vetrini - aderenza OCT)
Vetrini Poly-Prep	Sigma-Aldrich	P0425	vetrini rivestiti in poli-L-lisina
Vassoi per tazze per stampaggio in polietilene	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, per l'inclusione di campioni in resina GMA)
Stampaggio in polietilene Vassoi per tazze	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, per l'inclusione di campioni in resina GMA)
Ioduro di potassio	Sigma-Aldrich	221945	(per la preparazione della soluzione Lugol)
Destrosio di patata agar (PDA)	Millipore	70139	(per test di germinazione dei semi)
Microscopio elettronico a scansione	Jeol		(qualsiasi modello)
Silano [(3-Aminopropil)trietossisilano]	Sigma-Aldrich	A3648	per la preparazione dei vetrini - aderenza OCT)
Silane-Prep Slides:	Vetrini in vetro Sigma-Aldrich	S4651	rivestiti con silano
, gel di silice, arancione, granulare,	Supelco	10087	(per processi di essiccazione)
Cacodilato di sodio triidrato	Sigma-Aldrich	C0250	(per tampone glutaraldeide-cacodilato di sodio)
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (per Karnovsky' Preparazione della soluzione e colorazione con mezzo di contrasto TEM)
Soluzione di ipoclorito di sodio	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (per la disinfezione della superficie dei semi)
Fosfato di sodio bibasico, anidro	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (per soluzione NBF e preparazione PB)
Fosfato di sodio monobasico monoidrato	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4· H2O (per NBF e PB)
Sputter coater	Balzers		(qualsiasi modello)
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (per crioprotezione e test di germinazione)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(per colorazione)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(per la colorazione)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	per la colorazione)
Siringa			(3 mL, qualsiasi marca, per colorazione con mezzo di contrasto TEM)
Unità filtro siringa, Millex-GV 0,22 e micro; m	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, sterilizzato a raggi gamma (per colorazione a contrasto TEM)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	adesivo cianoacrilato liquido, media viscosità
Toluidina Blue O	Sigma-Aldrich	T3260	(per colorazione)
Microscopio elettronico a trasmissione	Jeol		(qualsiasi modello)
Trifeniltetrazolo cloruro	Sigma-Aldrich	T8877	(per il test del tetrazolio nella germinazione dei semi)
Citrato trisodico diidrato	Sigma-Aldrich	S1804	Na3(C6H5O7)· 2H2O (per colorazione con contrasto TEM)
Ultramicrotomo	Leica Biosystems		(qualsiasi modello)
Acetato di uranile	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2 (per colorazione con contrasto TEM)
Pompa a			(qualsiasi modello)
Agglutinina del germe di grano, Alexa Fluor 488 Coniugato	TermoFisher Scientific	W11261	lectina coniugata con colorante fluorescente (rileva i residui di acido sialico e N-acetilglucosaminil)