Articolo metodologico

Estrazione di aminoacidi non proteici da cianobatteri per cromatografia liquida-analisi di spettrometria di massa tandem

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DOI:

10.3791/63779

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9 dicembre 2022

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1Hyphenated Mass Spectrometry Laboratory (HyMaS), University of Technology Sydney, 2School of Life Sciences, University of Technology Sydney

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive l'estrazione di amminoacidi non proteici da matrici biologiche tramite precipitazione proteica dell'acido tricloroacetico (TCA) e idrolisi acida prima dell'analisi mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem.

Abstract

Gli amminoacidi non proteici (NPAA) sono una grande classe di amminoacidi (AA) che non sono geneticamente codificati per la traduzione in proteine. L'analisi degli NPAA può fornire informazioni cruciali sull'assorbimento e/o la funzione cellulare, sulle vie metaboliche e sulla potenziale tossicità. β-metilammino-L-alanina (BMAA) è un NPAA neurotossico prodotto da varie specie di alghe ed è associato ad un aumentato rischio di malattie neurodegenerative, che ha portato a un significativo interesse di ricerca. Esistono numerosi modi per estrarre AA per l'analisi, con cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem che è la più comune, che richiede precipitazione proteica seguita da idrolisi acida del pellet proteico. Gli studi sulla presenza di BMAA nelle specie algali forniscono risultati contraddittori, con l'uso di preparazione / estrazione e analisi di campioni non convalidati come causa primaria. Come la maggior parte delle NPAA, la precipitazione proteica in TCA acquoso al 10% e l'idrolisi con HCl fumante sono la forma di estrazione più appropriata per BMAA e i suoi isomeri aminoetilglicina (AEG) e acido 2,4-diaminobutirrico (2,4-DAB). Il presente protocollo descrive le fasi di un metodo di estrazione NPAA validato comunemente usato nei laboratori di ricerca e di insegnamento.

Introduzione

Gli amminoacidi sono composti chimici che contengono almeno un gruppo funzionale amminico e carbossilico. Alcuni amminoacidi contengono anche un gruppo immino, un gruppo acido funzionale diverso da quello carbossilico; Altri aminoacidi hanno gruppi amminici che non sono attaccati al gruppo α-carbonio1. Ci sono oltre 500 aminoacidi2, 22 dei quali sono noti come aminoacidi proteici utilizzati per la codifica genetica nella sintesi proteica ribosomiale3. Questi 22 aminoacidi possono essere ulteriormente suddivisi in essenziali e non essenziali. Gli amminoacidi essenziali sono necessari per il corretto funzionamento di un organismo e possono essere acquisiti solo da fonti esterne. Gli amminoacidi non essenziali possono essere sintetizzati all'interno dell'organismo. La classificazione dei 22 aminoacidi in essenziali/non essenziali è unica per le singole specie. Tutti gli altri aminoacidi sono aminoacidi non proteici (NPAA) che non sono codificati per la sintesi proteica. Gli amminoacidi, siano essi proteine o non proteine, possono anche svolgere un ruolo di segnalazione all'interno di un organismo e agire come intermediari metabolici4. A causa dei loro ruoli importanti e variabili, i livelli di aminoacidi possono fornire una panoramica delle condizioni dell'organismo, della funzionalità e delle vie metaboliche, ecc. Esistono due meccanismi principali attraverso i quali gli amminoacidi possono essere incorporati in una catena polipeptidica: la sintesi proteica ribosomiale, che utilizza i 22 amminoacidi nella codifica, e la sintesi peptidica non ribosomiale, che, insieme agli amminoacidi proteici, consente l'uso di alcuni NPAA nella sintesi. Alcuni NPAA possono imitare gli amminoacidi proteici, portando potenzialmente alla loro errata incorporazione in peptidi e proteine. La misincorporazione provoca un misfolding delle proteine, che, a sua volta, ha effetti dannosi5, come la misincorporazione della NPAA L-3,4 diidrossifenilalanina (L-DOPA) al posto della tirosina, con un impatto negativo sulla funzione cellulare e sulla salute 6,7. Un'ulteriore fonte di NPAA incorporati è attraverso la modifica post-traduzionale (PTM) dei residui di amminoacidi. I residui di aminoacidi vengono modificati per vari motivi, tra cui cambiamenti nella conformazione, stabilità e funzionalità del peptide o della proteina. Dopo idrolisi di proteine o peptidi contenenti PTM, questi residui di aminoacidi modificati vengono rilasciati nella loro forma NPAA libera 8,9.

L'NPAA β-metilammino-L-alanina (BMAA) prodotta da cianobatteri, diatomee e dinoflagellati10 è una sospetta neurotossina implicata come fattore che contribuisce a varie malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica / complesso parkinsonismo-demenza (ALS-PDC)11,12, la sclerosi laterale amiotrofica e il morbo di Alzheimer 13 . Si suggerisce che BMAA sia erroneamente incorporato nella catena polipeptidica delle proteine al posto di L-serina14 e / o altri aminoacidi proteici. L'errata incorporazione di BMAA può portare al misfolding delle proteine, con conseguente deposizione di aggregati proteici nei neuroni14. Nell'ultimo decennio, l'interesse per BMAA è aumentato in modo significativo. Una vasta gamma di specie cianobatteriche provenienti da ambienti d'acqua dolce, marini e salmastri è stata scoperta per produrre BMAA15, portando alla loro distribuzione diffusa in vari ecosistemi16,17. Inoltre, BMAA ha dimostrato di bioingrandire attraverso la catena alimentare fino alla rete alimentare umana18,19. A causa dei potenziali effetti sulla salute, della mancanza di comprensione e delle incongruenze della tossicità BMAA, è imperativo continuare ulteriori ricerche fino a quando la tossicità del BMAA non sarà definitivamente compresa o la BMAA non sarà considerata sicura20,21.

L'analisi degli amminoacidi nei campioni biologici può essere suddivisa in quattro fasi principali: preparazione del campione, derivatizzazione degli amminoacidi, separazione e rilevamento, identificazione e quantificazione. La cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) è il metodo di analisi preferito in quanto fornisce una separazione e un'analisi mirate e riproducibili degli amminoacidi.

Le tecniche di preparazione dei campioni per l'analisi di campioni cianobatterici e di altri campioni di alghe coinvolgono prevalentemente un metodo di estrazione per gli amminoacidi nelle loro forme libere e legate alle proteine. Nel corso degli anni, i metodi di estrazione sono rimasti relativamente coerenti con elementi comuni, tra cui la desolvatazione del campione per separare gli amminoacidi liberi dalla loro forma legata, seguita dalla precipitazione proteica e dal rilascio degli amminoacidi legati attraverso l'idrolisi con acido cloridrico (HCl) a temperature elevate22 . Questa forma di estrazione è stata ottimizzata per gli amminoacidi proteici e impiegata per gli NPAA. Tuttavia, la rilevazione e la quantificazione di BMAA e dei suoi isomeri (Figura 1), aminoetilglicina (AEG) e acido 2,4-diaminobutirrico (2,4-DAB), nella stessa specie di cianobatteri hanno mostrato risultati incoerenti in letteratura, con una possibile spiegazione che risiede nelle differenze nelle condizioni di crescita e/o nel ceppo di alghe che producono quantità variabili o nulle di BMAA23 . È stato sostenuto che una spiegazione più probabile per le incongruenze nella rilevazione e quantificazione del BMAA e dei suoi isomeri è dovuta a protocolli sperimentali non convalidati, all'uso di un'ampia gamma di tecniche analitiche e a dettagli sperimentali insufficienti nei metodi riportati16,24 che portano a dati interlaboratorio irriproducibili. Tuttavia, Glover et al.25 e Banack26 hanno recentemente sviluppato e convalidato una tecnica analitica per la rilevazione e la quantificazione del BMAA e dei suoi isomeri utilizzando la cromatografia liquida ad ultra prestazioni (UPLC)-MS / MS in conformità con l'International Society of Analytical Chemists (AOAC), la farmacopea statunitense e le linee guida della FDA necessarie per la convalida di un singolo laboratorio.

Questi esperimenti di convalida si sono concentrati sulla separazione e la rilevazione di BMAA e dei suoi isomeri e non hanno affrontato le incongruenze nei protocolli di preparazione del campione. Lage et al.27 hanno confrontato le prestazioni di tre metodi di estrazione comuni per quantificare BMAA e i suoi isomeri in campioni cianobatterici tramite LC-MS/MS: estrazione in fase solida (SPE) di amminoacidi liberi28,29; un metodo di precipitazione proteica che comporta l'estrazione di metanolo e la precipitazione di acetone30; e il metodo di estrazione più comunemente usato per BMAA, precipitazione proteica con acido tricloroacetico (TCA)31. Hanno concluso che la precipitazione della proteina TCA era il protocollo ottimale, producendo concentrazioni di BMAA più elevate nei campioni di prova rispetto agli altri metodi di estrazione. Il loro studio ha convalidato l'estrazione TCA con derivatizzazione di BMAA utilizzando 6-aminochinolil-N-idrossisuccinimidil carbammato (AQC) in una matrice di cianobatteri, fornendo una guida consolidata per ottenere dati BMAA affidabili e riproducibili. L'estrazione degli aminoacidi TCA è una tecnica di preparazione del campione accettata e comune che può essere applicata anche ad altre matrici. Tuttavia, la stabilità dell'amminoacido durante l'idrolisi deve essere considerata per prevenire la degradazione o l'ossidazione, che può essere superata con l'uso di modificatori chimici e agenti riducenti32. L'estrazione TCA viene abitualmente utilizzata e insegnata ai nuovi studenti di ricerca e, sebbene il protocollo sia ampiamente riportato, un aiuto visivo nell'applicazione di questo metodo è una risorsa preziosa, garantendo un'esecuzione corretta e coerente.

La cromatografia a fase inversa è comunemente usata per separare gli amminoacidi, richiedendo una fase di derivatizzazione prima delle analisi. La derivatizzazione di amminoacidi come BMAA consente la ritenzione cromatografica e può aumentare la risoluzione tra gli isomeri. Aumenta anche la massa molecolare e migliora la ionizzazione nello spettrometro di massa. Diversi reagenti derivatizzanti sono stati utilizzati per l'analisi degli amminoacidi tramite LC-MS/MS, tra cui cloroformiato di propile (PCF)33, 6-amminochinolil-N-idrosysuccinimidil carbammato (AQC)27, 9-fluorenilmetil cloroformiato (FMOC)34 e cloruro di dansil (DC)35. Tuttavia, le uniche tecniche convalidate per l'analisi del BMAA hanno utilizzato PCF 36 o AQC24,26,37 come reagente derivatizzante.

Lo scopo di questo protocollo è focalizzato sull'estrazione TCA di NPAA da matrici cianobatteriche. È un metodo ad alta intensità di lavoro che viene abitualmente utilizzato e insegnato nei laboratori di ricerca accademici e industriali basati su manoscritti che possono essere a corto di dettagli; pertanto, questo protocollo fornisce dettagli sulla procedura e sulle tecniche coinvolte nella preparazione dei campioni per l'analisi del BMAA libero e legato come amminoacido modello.

Protocollo

La specie di cianobatteri Merismopedia è stata utilizzata per il presente studio38.

1. Preparazione del campione grezzo

  1. Raccogliere la schiuma di alghe dalla fonte acquatica di interesse o da un matraccio in coltura cianobatterica e metterlo in una provetta da centrifuga da 50 mL38.
    NOTA: Il campione deve essere congelato a -20 °C per estrazioni successive e scongelato prima della fase successiva.
  2. Centrifugare le provette contenenti il campione a 3.500 x g per 10 minuti a 25 °C. Decantare il surnatante in un contenitore di rifiuti e gettarlo in rifiuti biologici.
    NOTA: Il surnatante può essere riservato per future analisi dell'esosoma.
  3. Coprire saldamente il tubo contenente il pellet campione con una pellicola sigillante (vedere Tabella dei materiali) e forare alcuni fori nel film con una pinzetta affilata e lunga. Conservare il tubo in posizione verticale a -80 °C per 30 minuti.
  4. Accendere ed equilibrare il liofiliere a 0,1 mbar e -80 °C (~30 min).
    NOTA: I parametri (punto 1.4) sono ottimizzati per il liofilizzatore utilizzato per il presente studio (vedi Tabella dei materiali). Seguire le procedure operative standard in base al modello di liofilizzazione disponibile in laboratorio o impostare la temperatura più bassa possibile se il modello di liofilizzazione non scende fino a -80 °C.
    1. Posizionare i tubi della centrifuga in posizione verticale in un contenitore di vetro liofilizzato e posizionarlo all'interno del congelatore a -80 °C per 5 minuti per raffreddare il barattolo.
    2. Rimuovere il contenitore di vetro dal congelatore e attaccare il coperchio di gomma.
    3. Assicurarsi che la maniglia sull'uscita della valvola di gomma del liofiliere sia ventilata verso l'atmosfera (rivolta verso l'alto) e fissare saldamente il contenitore di vetro.
    4. Ruotare molto lentamente l'impugnatura dell'uscita della valvola in gomma verso la posizione rivolta verso il basso per esporre il barattolo al vuoto e consentire fino a 24 h di liofilizzazione per garantire la sublimazione di tutto il liquido.
    5. Per rilasciare il vuoto nel barattolo, ruotare la maniglia verso l'alto, staccare il contenitore di vetro e rimuovere i campioni liofilizzati.
  5. Utilizzare una bilancia analitica per pesare 15-50 mg di pellet campione essiccato in una provetta da centrifuga da 15 ml.
    NOTA: I campioni possono essere immagazzinati a -80 °C se non ulteriormente trattati in questa fase.

2. Lisi cellulare e frazionamento di NPAA liberi

  1. Aggiungere 100 μL di 100 ng/mL di D5-2,4-DAB (vedere la tabella dei materiali) utilizzando una micropipetta alla provetta del campione (opzionale).
  2. Aggiungere 300-600 μL di 10% p/v di tricloroacetico acquoso (TCA, vedi Tabella dei materiali) o 300-600 μL di TCA 11,7%-13,3%, rispettivamente, se si aggiunge lo standard D5-2,4-DAB.
    NOTA: Scegli un volume di TCA acquoso che copra completamente il pellet.
  3. Mettere le provette in un contenitore pieno di ghiaccio tritato.
  4. Utilizzare un sonicatore a sonda (vedere Tabella dei materiali) a potenza medio-alta (70%) e lisare il campione per 1 minuto seguendo i passaggi seguenti.
    ATTENZIONE: Garantire DPI adeguati con l'uso di cuffie con cancellazione del rumore.
    1. Seguire i protocolli di sicurezza appropriati in preparazione all'uso del sonicatore sonda posizionando la segnaletica in uso sulla porta, eseguendo la sonicazione nella cappa aspirante e utilizzando paraorecchie con cancellazione del rumore.
    2. Accendere il sonicatore e inserire i seguenti parametri: ampiezza, 70%; tempo, 1 min.
    3. Spruzzare etanolo al 70% su una salvietta di carta priva di lanugine (vedere la tabella dei materiali) e pulire la sonda.
    4. Immergere completamente l'estremità della sonda nel campione e premere start.
    5. Quando il sonicatore della sonda si ferma, posizionare la provetta da centrifuga contenente il campione su ghiaccio per 1 minuto.
    6. Per assicurarsi che le cellule siano lisate, ripetere ancora una volta i passaggi 2.4.3-2.4.5.
  5. Introdurre il campione in frigorifero a 4 °C per 12-24 ore per consentire la precipitazione delle proteine.
  6. Centrifugare il campione acquoso di TCA al 10% a 3.500 x g per 15 minuti a 8 °C.
  7. Utilizzare una micropipetta per trasferire il surnatante in una provetta da 2 ml etichettata "Frazione libera".
  8. Micropipettare 400 μL di TCA acquoso al 10% nella provetta da centrifuga contenente il pellet campione rimanente e rompere il pellet mediante agitazione del vortice o con la punta della micropipetta.
  9. Ripetere i passaggi 2,6-2,7, trasferendo il surnatante nella stessa provetta da 2 mL di "frazione libera".
  10. Micropipettare 400 μL di TCA/acetone al 10% nel tubo della centrifuga con il pellet rimanente e rompere il pellet con vortexing o la punta della micropipetta.
  11. Centrifugare il campione di TCA/acetone al 10% a 3.500 x g per 15 minuti a 8 °C. Utilizzare una micropipetta per trasferire il surnatante nel tubo da 2 mL etichettato "Frazione libera".
  12. Posizionare il tubo "Frazione libera" con il coperchio aperto in un evaporatore centrifugo (vedi Tabella dei materiali) fino a quando tutti i liquidi volatili non sono stati rimossi (almeno 1 ora).
  13. Una volta che il campione è privo di liquidi volatili, coprire saldamente il tubo con pellicola sigillante e forare il film con alcuni fori usando una pinzetta affilata e lunga. Introdurre il campione in un congelatore a -80 °C.
  14. Liofilizzare il campione "Frazione libera" ripetendo tutti i passaggi del passaggio 1.4.
  15. Micropipettare 200 μL di acido cloridrico (HCl) 20 mM nella provetta della "frazione libera" per ricostituire il campione liofilizzato e metterlo in congelatore a -80 °C.
    NOTA: La "frazione libera" del campione è pronta per la filtrazione nella fase 4. Il pellet rimanente verrà ulteriormente lavorato nelle fasi successive per il frazionamento delle proteine.

3. Frazionamento delle NPAA legate alle proteine

  1. Utilizzare un incisore di vetro per etichettare le fiale di guscio di vetro con i dettagli del campione per l'identificazione.
    NOTA: l'acido forte può dissipare l'etichettatura dell'inchiostro; Pertanto, si consiglia di incidere le etichette su vetro.
  2. Micropipetta 100 μL di 100 ng/mL D5-2,4-DAB standard sul pellet campione (opzionale).
  3. Micropipettare 400 μL di acetone al 100% sul pellet campione e rompere il pellet utilizzando l'agitazione del vortice o la punta della micropipetta.
  4. Utilizzare una micropipetta da 1 mL impostata a 1.000 μL per trasferire il pellet lavato e risospeso nel flaconcino di vetro corrispondente.
    NOTA: Altri 400 μL di acetone al 100% possono essere aggiunti al pellet agitato per aiutare nel trasferimento completo del pellet nel flaconcino del guscio di vetro. Questo può essere ripetuto una terza volta se necessario.
  5. Centrifugare a 8.000 x g per 5 minuti a 25 °C e decantare il liquido in rifiuti biologici.
  6. Mettere il pellet rimanente in un evaporatore centrifugo fino a quando tutto il liquido viene rimosso e il pellet è asciutto (~ 1 h).
  7. Preparare il flaconcino di idrolisi sotto vuoto aggiungendo 1 mL di 6 M HCl sul fondo del flaconcino di idrolisi.
  8. Utilizzare una pinzetta per inserire con cura i flaconcini di guscio etichettati contenenti i campioni essiccati nel flaconcino di idrolisi, garantendo una posizione eretta e stabile.
    NOTA: i flaconcini vuoti possono essere utilizzati per mantenere i flaconcini del campione in posizione verticale se il numero di campioni è inferiore alla capacità del flaconcino di idrolisi.
  9. Collegare il coperchio al flaconcino di idrolisi e spingere la manopola rossa sul coperchio per chiudere la valvola.
  10. Accendere la pompa per vuoto, collegare il tubo a vuoto alla testa del coperchio del flaconcino di idrolisi e premere la manopola verde sul coperchio per aprire la valvola.
  11. Lasciare che la pompa per vuoto (vedere la tabella dei materiali) rimuova l'aria dal flaconcino per 1 minuto.
  12. Chiudere il flaconcino premendo la manopola rossa sul coperchio del flaconcino di idrolisi, spegnere la pompa per vuoto e rimuovere il tubo a vuoto.
  13. Collegare un tubo di gomma al rubinetto del gas azoto sul banco del laboratorio e aprire leggermente il rubinetto. Posizionare il pollice all'estremità del tubo, sigillarlo e contare fino a quando il gas inizia a fuoriuscire mentre la pressione si accumula. Questo sarà il lasso di tempo per il prossimo passo. Regolare il flusso di gas in base a un intervallo di tempo adeguato.
  14. Attaccare l'altra estremità del tubo di gomma alla testa del coperchio del flaconcino di idrolisi e quindi spingere immediatamente la manopola verde del coperchio. Contare fino al tempo determinato al punto 3.13 e spingere rapidamente la manopola rossa sul coperchio e rimuovere il tubo di gomma.
  15. Ripetere due volte i passaggi 3.10-3.14 per assicurarsi che il flaconcino di idrolisi del vetro sia privo di aria e riempito con azoto gassoso.
  16. Introdurre il flaconcino di idrolisi in un forno preriscaldato impostato a 110 °C per 16-18 ore.
  17. Utilizzare guanti da forno per rimuovere la fiala di idrolisi di vetro dal forno e lasciarla raffreddare all'interno della cappa aspirante per 10 minuti. All'interno della cappa aspirante, mentre è rivolta verso di te, spingi la manopola verde per rilasciare pressione e gas.
  18. Utilizzare una pinzetta per rimuovere i flaconcini di guscio dal flaconcino di idrolisi.
  19. Ricostituire i pellet campione idrolizzati mediante micropipettaggio di 200 μL di 20 mM HCl nel flaconcino del guscio. Assicurarsi che il pellet sia risospeso mediante vortice o utilizzando una punta per pipetta.
  20. Centrifugare i flaconcini contenenti i pellet campione ricostituiti per 2 minuti a 5.300 x g e 25 °C.

4. Filtraggio dei campioni

  1. Etichettare i tubi filtranti da 2 mL (vedi Tabella dei materiali) contenenti filtri a membrana porosa da 0,2 μm come "Frazione libera" e "Frazione proteica".
  2. Trasferire i campioni ricostituiti dalla fase 2.15 (frazione libera) e dalla fase 3.20 (frazione proteica) nelle provette filtranti corrispondenti.
  3. Metterli nella centrifuga per 30 minuti a 5.000 x g e 25 °C.
  4. Rimuovere i filtri dai tubi filtranti e coprirli. I campioni sono ora pronti per la derivatizzazione degli amminoacidi nella fase 5.
    NOTA: I campioni possono essere collocati nel congelatore a -80 °C per la conservazione per la successiva derivatizzazione e analisi.

5. Derivatizzazione degli aminoacidi

  1. Derivatizzare i campioni utilizzando cloroformiato di propile (PCF)39 o 6-amminochinolil-N-idrosysuccinimidil carbammato (AQC)40 secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).

Risultati

Un'illustrazione del protocollo di estrazione è fornita nella Figura 2 come guida di riferimento riassuntiva. I risultati ottenuti da Violi et al.38 sono stati scelti per rappresentare un risultato positivo da questo protocollo di estrazione per l'analisi degli isomeri BMAA dai cianobatteri. Diciannove singole specie di cianobatteri sono state coltivate da 11 siti di acqua dolce dell'Australia orientale. Utilizzando lo stesso protocollo, gli isomeri BMAA sono stati estratti in frazioni libere e proteiche, derivatizzati con PCF e analizzati utilizzando LC-MS / MS. Diciassette degli isolati cianobatterici erano positivi per BMAA e tutti e 19 contenevano l'isomero 2,4-DAB. Un risultato positivo è confermato utilizzando un metodo LC-MS/MS validato e osservando almeno tre transizioni di monitoraggio delle reazioni multiple (MRM), una come ione quantificatore e due come ioni qualificatori al tempo di ritenzione previsto. Un cromatogramma MRM rappresentativo di uno standard contenente BMAA e i suoi isomeri, indicato dalle linee codificate a colori, è mostrato nella Figura 3. La presenza e la concentrazione di BMAA e isomeri in tutti i 19 campioni, sezionati per mostrare la BMAA e la concentrazione di isomeri nelle frazioni libera e legata, è riassunta nella Tabella 1. Una rilevazione positiva per tutti e tre gli isomeri è stata osservata nella frazione libera delle specie di Merismopedia raccolte dal lago Liddell (NSW, Australia), dove la frazione libera conteneva una concentrazione di BMAA di 68,38 μg/g di peso secco (DW) ± 2,25 μg/g DW, 2,4-DAB con una concentrazione di 1.223,98 μg/g DW ± 20,7 μg/g DW, e AEG con una concentrazione di 125,27 μg/g DW ± 4,19 μg/g DW. Gli MRM cromatografici sono illustrati nella Figura 4. Per illustrare un risultato negativo per BMAA e i suoi isomeri in un campione, la frazione legata delle specie Microcystis flos-aquae raccolte da Walka Water Works (NSW, Australia) è presentata cromatograficamente nella Figura 5. Mentre la frazione legata non conteneva BMAA, 2,4-DAB e/o AEG, la sua frazione libera conteneva tutti e tre gli isomeri, con concentrazioni di 79,86 μg/g DW ± 1,59 μg/g DW, 1.156,15 μg/g DW ± 8,46 μg/g DW e 433,83 μg/g DW ± 8,92 μg/g DW, rispettivamente.

Così, attraverso l'uso di questo protocollo, Violi et al.38 hanno confermato la presenza di isomeri BMAA nei cianobatteri d'acqua dolce dell'Australia orientale e hanno determinato quali cianobatteri avevano capacità di produrre tossine.

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Figura 1: La struttura chimica del BMAA e dei suoi isomeri 2,4-DAB e AEG. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Diagramma di riferimento riassuntivo del protocollo di estrazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3: Cromatogramma LC-MS/MS di uno standard di calibrazione contenente D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA e AEG per l'identificazione degli isomeri basata sulla ritenzione, indicata dai picchi evidenziati. Chiave: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z a 6,4 min (rosso), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z a 6,4 min (verde), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z a 7,4 min (arancione) e BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z a 7,8 min (blu). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 4: Cromatogramma LC-MS/MS per la rilevazione di D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA e AEG in specie di Merismopedia raccolte dal lago Liddell (NSW, Australia), indicato dai picchi evidenziati. Chiave: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z a 6,4 min (rosso), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z a 6,4 min (verde), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z a 7,4 min (arancione) e BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z a 7,8 min (blu). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 5: Cromatogramma LC-MS/MS di un controllo negativo per 2,4-DAB, BMAA e AEG in una frazione legata di specie di Microcystis flos-aquae raccolte da Walka Water Works (NSW, Australia). Chiave: D5-2,4-DAB 338,01 m/z > 278,10 m/z a 6,4 min (rosso - picco evidenziato), 2,4-DAB 333,01 m/z > 273,10 m/z a 6,4 min (verde), AEG 333,01 m/z > 88,00 m/z a 7,4 min (arancione) e BMAA 333,01 m/z > 187,10 m/z a 7,8 min (blu). Le linee tratteggiate rappresentano i tempi di ritenzione per 2,4-DAB, AEG e BMAA mancanti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Concentrazioni di BMAA, AEG e 2,4-DAB negli isolati cianobatterici. Le concentrazioni ± errore standard della media (n = 3). ND indica non rilevato. La più alta concentrazione di ciascun isomero rilevato è evidenziata in verde. La tabella è una versione modificata da Violi et al.38. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Il protocollo di estrazione qui delineato per l'analisi degli NPAA si applica all'analisi di qualsiasi amminoacido nei campioni biologici. Per le guide sull'isolamento e la coltura di ceppi cianobatterici, si può fare riferimento ai metodi presentati nello studio di Violi et al.38. Il primo passo del protocollo porta il campione a un punto in cui è possibile ottenere la normalizzazione tra i campioni rispetto al peso secco. La seconda fase è la lisi cellulare per rilasciare gli analiti e può essere eseguita utilizzando una serie di tecniche, tra cui interruzioni / lisi meccaniche come la sonicazione della sonda come descritto in questo protocollo, cicli di congelamento / disgelo, macinazione e fresatura delle perline e interruzioni non meccaniche come lisi enzimatica, detergente e / o chimica. La rottura meccanica è nota per essere vantaggiosa rispetto a quella non meccanica in quanto consente una maggiore capacità del campione di lisare consentendo ai legami intracellulari e alle proteine di rimanere intatti41, sebbene la matrice del campione possa dettare il metodo ottimale per la lisi cellulare.

La precipitazione proteica è il terzo passo critico di questo protocollo quando si estraggono gli amminoacidi per l'analisi. Il TCA è il solvente più comunemente usato; tuttavia, sono stati utilizzati anche acido perclorico, acetone, metil terz-butil etere (MTBE), metanolo e/o acetonitrile 8,42, in cui ciascun solvente di estrazione ha lo scopo di estrarre e precipitare substrati diversi. Il modello qui descritto estrae il BMAA NPAA e i suoi isomeri da una matrice cianobatterica e, sebbene sia stata utilizzata una gamma di solventi diversi, i due più comuni sono il 10% di TCA in acqua (acquosa) e il 10% di TCA in acetone. In generale, la precipitazione proteica con TCA è comunemente usata per estrarre aminoacidi per frazionare gli amminoacidi liberi dagli amminoacidi legati alle proteine. Inoltre, l'estrazione TCA consente di determinare il contenuto proteico totale, riducendo i contaminanti per la frazione libera e riducendo l'attività delle proteasi con una degradazione minima delle proteine43. L'estrazione TCA della frazione libera funziona inizialmente risciacquando le sostanze solubili organiche, lasciando dietro di sé proteine e composti insolubili come i resti della parete cellulare nel precipitato, che viene poi seguita dall'estrazione termica dell'idrolisi degli amminoacidi legati alle proteine (frazione legata) utilizzando un acido forte.

Il frazionamento della frazione libera con TCA acquoso al 10% più sonicazione produce la precipitazione proteica più estesa rispetto ad altri solventi organici44 e i migliori recuperi di aminoacidi42. Alcuni studi scelgono di utilizzare un acido combinato con un solvente organico (cioè 10% -20% TCA in acetone 43) per precipitare più molecole, compresi peptidi / biomolecole più piccoli, ridurre al minimo la degradazione proteica e ridurre i contaminanti come i sali43. Un altro vantaggio del 10% di TCA nell'acetone è la sua velocità di essiccazione più rapida nella preparazione del pellet per l'idrolisi, riducendo al minimo i residui di umidità per prevenire la modifica degli aminoacidi. Tuttavia, il 10% di TCA acquoso più sonicazione ha migliori efficienze di estrazione degli aminoacidi liberi rispetto al 10% di TCA nel solo acetone44. Inoltre, la precipitazione acquosa di TCA al 10% ha limitazioni come un lungo tempo di essiccazione, non essendo in grado di precipitare tutte le proteine o piccoli peptidi / biomolecole e, a seconda dell'analita di interesse (cioè proteine o amminoacidi), che richiedono additivi e agenti riducenti per prevenire l'ossidazione e la degradazione45,46.

Questo protocollo utilizza una combinazione di TCA acquoso al 10% e TCA al 10% in acetone per aumentare la precipitazione proteica, garantire che peptidi / biomolecole più piccoli vengano precipitati, consentire tempi di essiccazione del pellet più rapidi e aumentare l'efficienza di estrazione, sfruttando entrambe le proprietà di estrazione con solvente. Tuttavia, la combinazione del 10% di TCA acquoso e del 10% di TCA nell'acetone può precipitare piccoli peptidi / biomolecole nella frazione libera dopo che il 10% di TCA nell'acetone surnatante è combinato con la frazione libera acquosa. In questo caso, i precipitati devono essere trasferiti nella frazione legata per l'idrolisi.

La seconda metà di questo protocollo prevede il rilascio di aminoacidi (cioè BMAA) dal pellet proteico tramite idrolisi acido-vapore a temperature elevate in un ambiente privo di ossigeno. Il fattore prevalentemente limitante per la fase di idrolisi è che richiede tempo e laborioso da preparare. L'incubazione notturna impedisce una preparazione e un'analisi dei campioni rapida ed efficiente in termini di tempo. Inoltre, il trasferimento quantitativo del pellet da un tubo di centrifuga a una fiala di guscio (fase 3.4) è un processo arduo che richiede diligenza e pazienza per garantire un preciso punto di normalizzazione al peso secco. I possibili problemi che l'utente può incontrare sono il trasferimento incompleto del pellet, le proteine precipitate umide che si attaccano alle punte delle pipette e al tubo originale e le particelle solide del pellet che bloccano la punta della pipetta. Un suggerimento pratico per facilitare il trasferimento del pellet è quello di rimuovere circa 0,3-0,5 mm dall'estremità della punta della pipetta con un paio di forbici, consentendo di aspirare particelle di pellet più grandi e rilasciarle nel flaconcino del guscio. Questo metodo di trasferimento è una pratica comune per l'estrazione delle proteine per tutte le analisi degli amminoacidi. Tuttavia, devono essere studiate modifiche per migliorare l'efficienza e l'accuratezza del trasferimento quantitativo del pellet nel flaconcino del guscio.

Due forme di tecniche di idrolisi possono essere impiegate per rilasciare gli amminoacidi dal loro stato legato alle proteine: idrolisi in fase liquida e idrolisi acido-vapore. L'idrolisi in fase liquida, che comporta l'aggiunta di 6 M HCl sul campione, che viene poi posto in un forno a 110 °C durante la notte, è un'alternativa all'idrolisi acido-vapore descritta nel presente protocollo. Le tecniche di estrazione che impiegano l'idrolisi in fase liquida possono richiedere ulteriori elaborazioni, come la desalinizzazione, specialmente se viene scelta la derivatizzazione dell'AQC, in quanto richiede condizioni di base per l'etichettatura40. L'idrolisi acido-vapore evita la desalinizzazione e consente all'utente la libertà di scegliere la tecnica di derivatizzazione al momento della ricostituzione del pellet finale prima della filtrazione. Inoltre, indipendentemente dal metodo di idrolisi scelto, i campioni possono richiedere ulteriori elaborazioni, come SPE per la purificazione della matrice e la concentrazione 29,47,48, a seconda della scelta della tecnica di derivatizzazione e/o dell'analisi analitica (ad esempio, fase inversa LC-MS/MS vs. cromatografia liquida di interazione idrofila [HILIC] LC-MS/MS 37 ). La ricostituzione del pellet finale in 20 mM HCl in questo protocollo è appropriata per la derivatizzazione utilizzando i reagenti PCF48tramite un kit di idrolisi amminoacidica disponibile in commercio39 (vedi Tabella dei materiali). Sia AQC che PCF derivatizzano tutti gli amminoacidi, proteine e non proteine di origine presenti nel campione, e la selettività degli analiti è ottenuta attraverso l'uso di LC-MS/MS e la sua combinazione di corrispondenza del tempo di ritenzione e selezione accurata del quantificatore e qualificatore MRM38. 

Gli attuali protocolli di idrolisi non sono ottimizzati per il rilascio di BMAA, 2,4-DAB e AEG ma per i 22 amminoacidi proteici basati sui metodi esistenti per l'idrolisi proteica 32, in cui l'incubazione per più di 18 ore provoca la degradazione e la modifica di alcuni amminoacidi, influenzando l'analisi LC-MS/MS e, quindi, le concentrazioni ottenute32. Beach et al.49 hanno studiato l'idrolisi nel tempo (0,5-120 ore) per ottimizzare l'idrolisi per l'analisi del BMAA e degli amminoacidi proteinogenici. Hanno scoperto che, sebbene ci fosse un rapido rilascio precoce di BMAA durante le prime 0,5 ore dell'idrolisi, i livelli di BMAA continuavano ad aumentare con l'aumentare del tempo di idrolisi, senza degradazione, anche dopo 5 giorni49. Ci sono anche ancora diversi punti di vista e domande sulla vera natura del BMAA legato e dei suoi isomeri, con alcuni studi che suggeriscono che piuttosto che il legame BMAA 50,51 o l'errata incorporazione nelle proteine14, l'associazione BMAA-proteina è superficiale52. Tuttavia, l'attuale consenso nell'analisi del BMAA "legato" richiede la fase di idrolisi convalidata e ampiamente accettata che rompe peptidi / proteine per rilasciare amminoacidi e, quindi, BMAA e i suoi isomeri.

I tassi di recupero di 20 aminoacidi proteici sono stati determinati in uno studio di Sedgwick et al.42 utilizzando l'estrazione TCA, con conseguente recupero di circa il 100%. Nel caso del BMAA e dei suoi isomeri da matrici algali, gli studi che confrontano l'efficienza dell'estrazione BMAA utilizzando vari solventi di estrazione hanno trovato che il 10% di TCA è il più efficiente per BMAA libero27. I tassi di recupero per il BMAA legato alle proteine estratto utilizzando l'idrolisi in fase liquida sono stati stabiliti negli studi di Glover et al.25 e di Faassen et al.53, dove l'accuratezza è stata determinata da metodi di recupero a picco, con un tasso medio di recupero BMAA del 108,6% e del 70%, rispettivamente. Faassen et al. hanno descritto le procedure per gli esperimenti di recupero delle punte e hanno illustrato come il recupero differisca a seconda della fase del processo di estrazione del picco53. Faassen et al. hanno inoltre determinato l'efficienza del protocollo acido-vapore qui presentato, con tassi di recupero dell'83,6% per gli isomeri BMAA prima dell'estrazione e del 68,6% per quelli picchiati prima dell'idrolisi24. Questi recuperi, metodi di estrazione e analisi sono stati ulteriormente convalidati da Banack 26, con tassi di recupero del 94% -106% per BMAA in una matrice cianobatterica e una deviazione standard relativa (%RSD) tra il 5,6% e il20%, soddisfacendo i criteri FDA per l'accuratezza54. Si raccomanda che ogni laboratorio stabilisca inizialmente i suoi tassi di recupero e l'accuratezza prima di utilizzare questo protocollo tramite esperimenti di recupero spike. I metodi di recupero presentati in Faassen et al.53 e Glover et al.25 possono essere seguiti come guida.

Forme alternative di tecniche di idrolisi possono essere utilizzate al posto dell'idrolisi del forno notturno per un'estrazione più rapida legata alle proteine dell'analita. Ad esempio, un estrattore a microonde potrebbe ridurre significativamente il tempo di idrolisi da 24 ore a un minimo di 10 minutie 55. L'idrolisi a microonde per gli amminoacidi utilizza gli stessi principi del metodo termico convenzionale, utilizzando un vano portaoggetti per preparare e assemblare il recipiente a microonde in un ambiente privo di ossigeno e aggiungendo 6 M HCl. Una volta ermetico, il recipiente contenente il campione subisce radiazioni a microonde. L'idrolisi a microonde è stata utilizzata per estrarre amminoacidi da varie matrici campione56,57,58; tuttavia, l'idrolisi a microonde deve ancora essere sviluppata e convalidata per l'analisi della BMAA.

In conclusione, la precipitazione proteica acquosa TCA al 10% è il metodo ottimale per estrarre aminoacidi liberi non proteici dalle matrici cianobatteriche27 e l'idrolisi termica fornisce un'estrazione affidabile e riproducibile della frazione legata alle proteine. Questo protocollo per estrarre il BMAA NPAA e i suoi isomeri dai cianobatteri è convalidato e ampiamente accettato. Le direzioni future per ottimizzare ulteriormente l'estrazione di BMAA si concentreranno sulla fase di idrolisi, che viene eseguita secondo le specifiche dei 22 aminoacidi proteici. Tuttavia, il protocollo di estrazione qui presentato dovrebbe ancora essere considerato efficiente ed efficace per l'analisi del BMAA e dei suoi isomeri tramite LC-MS/MS.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

D.P.B., K.J.R. e S.M.M. sono supportati dalla Ian Potter Foundation, e J.P.V. è il destinatario di un programma di formazione alla ricerca del governo australiano, Stipend.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fiale di conchiglie in vetro da 1 mLSHIMADZUREST-24663
TCA al 10%Diluire il 100% (p/v) al 10% di TCA acquoso 
di TCA al 100%Sciogliere il TCA in acqua secondo il seguente rapporto 2,2 g:1 mL (TCA:H2O)
1000 &; L. micropipettaEpendorf/Sigma-AldrichZ683809
TCA al 13,3%Diluire al 100% (p/v) al 13,3% di TCA acquoso 
Provette da 2 mLMERCKBR780546-500EA
20 mM HClChem-Supply Pty Ltd7647-01-0Realizzato da stock
20-200 µ L micropipettaEpendorf/Sigma-AldrichZ740441
6 M HClChem-Supply Pty Ltd7647-01-0Ricavato da stock
70% etanoloSupelco1.11727Diluire 70:1 Etanolo:
acqua-80 ° C CongelatoreMartin CHRIST102142Alpha 2-4 Ldplus
AccQ-Tag Ultra Kit di derivatizzazione Waters186003836
AcetoneChem-Supply Pty Ltd34967-2.5L
Bilancia analitica Evaporatore
centrifugoThermo Scientific13442549Concentratore SpeedVac DNA120-115
CentrifugaMERCKEP022620100-1EA
D5-2,4-DAB standardCDN IsotopiD-7568
di essiccazione
Kit per l'analisi degli aminoacidi Ez:faastTMPhenomenexCEO-8492
Supporto
Falcon Provette FalconMERCKT2318-500EAProvette per centrifuga Greiner
Provette filtrantiSigma-AldrichCLS8161-100EACorning Costar Spin-X per provette per centrifuga (dimensione dei pori 0,22 μ m)
Incisore
Fiala di idrolisi & LidEldex Laboratories/AcqueWAT007568 &
Ghiaccio e contenitore
Salvietta di carta senza lanugineKimwipes/Sigma-AldrichZ188956
Milli-Q acqua18.2 MΩ. cm
Rubinetto per azoto con tubo flessibile
Micropipetta P1000Puntali per pipette MERCKEP3123000063
P1000Micropipetta MERCKZ740127
P200MERCKEP3123000055-1EA
Puntali per pipette P200MERCKZ740125
ParafilmMERCKP7793Pellicola sigillante
DPI - cuffie
DPI - guanti
Sonicatore a sondaQSONICA SonicatorsQ125 SonicatorAssicurarsi che tutti i DPI appropriati (ad es. cuffie con cancellazione del rumore)
Spatola
Acido tricloroacetico (TCA)Sigma-AldrichT6399-1KG
Pinzette
Pompa a vuoto con tubo flessibile
Soluzione diSoluzione soluzione diForno per provettein vetroWAT007569con cancellazione del rumoreda fornoper il trasferimento dei campioni

Riferimenti

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