Articolo metodologico

Isolamento e coltura di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo dalla mandibola umana

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DOI:

10.3791/63811

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13 aprile 2022

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Military Stomatology, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2College of Life Sciences, Northwest University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive una procedura efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo mandibolare umano utilizzando il metodo di aderenza dell'intero midollo osseo. Le cellule in coltura sono state identificate mediante saggi di proliferazione cellulare, citometria a flusso e induzione della differenziazione multilinea.

Abstract

Le cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) hanno mostrato un grande potenziale nella rigenerazione ossea, nella modulazione immunitaria e nel trattamento delle malattie croniche refrattarie. Recentemente sono state trovate varie origini per ottenere hMSC, mentre il midollo osseo era ancora considerato la fonte principale. Le MSC derivate dal midollo osseo (BMSC) provenienti da diversi siti ossei donatori hanno caratteristiche distinte a causa di fattori microambientali. Gli studi hanno dimostrato che le BMSC dell'osso maxillo-facciale possono avere maggiori capacità proliferative e osteogeniche rispetto alle BMSC delle ossa lunghe o della cresta iliaca. E le BMSC maxillo-facciali sono state considerate più adatte per la terapia con cellule staminali nei tessuti maxillo-facciali. La mandibola, in particolare l'area rapale ascendente con midollo sufficiente, era un sito donatore fattibile per la raccolta di BMSC. Questo studio ha descritto un protocollo per la raccolta, l'isolamento e la coltura di MSC derivate dal midollo osseo mandibolare umano (hmBMSC). Inoltre, per identificare le cellule in coltura sono stati eseguiti l'immunofenotipizzazione delle hmBMSC, i saggi di proliferazione e l'induzione in vitro della differenziazione osteogenica, adipogenica e condrogenica. L'applicazione di questo protocollo può aiutare i ricercatori a ottenere con successo un numero sufficiente di hmBMSC di alta qualità, necessarie per ulteriori studi sulla funzione biologica, sugli effetti microambientali e sulle applicazioni cliniche.

Introduzione

Le cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) sono cellule multipotenti che possono essere differenziate in vari tipi di cellule, come osteociti, adipociti e condrociti di linea mesodermica, epatociti e pancreociti di linea endodermica e neurociti di linea ectodermica1. Pertanto, le hMSC hanno mostrato un grande potenziale nella rigenerazione dei tessuti. Inoltre, le hMSC sono potenti immunomodulatori in grado di regolare il microambiente nei tessuti dell'ospite e trattare efficacemente le malattie croniche refrattarie2. Pertanto, le hMSC sono state ampiamente utilizzate nella terapia cellulare degli studi clinici. Di conseguenza, è importante ottenere con successo un numero sufficiente di hMSC di alta qualità in modo conveniente.

Da quando le hMSC sono state segnalate per la prima volta nel midollo osseo, sono state trovate molte fonti alternative di MSC, come il tessuto adiposo, il liquido sinoviale, il muscolo scheletrico, il liquido amniotico, l'endometrio, i tessuti dentali e il cordone ombelicale 1,3. Tuttavia, il midollo osseo rimane la principale fonte di hMSC per la maggior parte degli studi preclinici e clinici e le MSC derivate dal midollo osseo (BMSC) sono considerate standard per confrontare le MSC provenienti da altre fonti4. Per anni, la cresta iliaca o le ossa lunghe (la tibia e il femore) sono state le sedi anatomiche più popolari per ottenere il midollo osseo 1,5. Tuttavia, la cresta iliaca o le ossa lunghe hanno origini embrionali e modelli di sviluppo diversi rispetto alle ossa maxillo-facciali 5,6. Molti studi clinici, di laboratorio e sullo sviluppo hanno dimostrato che le BMSC di origini diverse hanno mostrato proprietà sito-specifiche e le BMSC innestate mantengono le proprietà del sito donatore dopo l'impianto nel sito ricevente 5,6,7,8,9. Dal punto di vista dell'origine dello sviluppo, i tessuti maxillo-facciali, come la mascella, la mandibola, la dentina, l'osso alveolare, la polpa e il legamento parodontale, derivano esclusivamente dalle cellule della cresta neurale. Al contrario, la cresta iliaca e le ossa lunghe sono formate dal mesoderma. Inoltre, le mandibole sono create dall'ossificazione intramembranosa, mentre gli scheletri assiali e appendicolari subiscono l'ossificazione endocondrale. Inoltre, rispetto alla cresta iliaca e alle ossa lunghe, alcuni studi clinici hanno dimostrato che le hMSC derivate dal midollo osseo maxillo-facciale hanno una migliore attività proliferativa cellulare e capacità di differenziazione 6,8. Pertanto, si prevede che le BMSC delle aree maxillo-facciali siano una scelta migliore per la rigenerazione del tessuto maxillo-facciale e la terapia delle malattie refrattarie croniche maxillo-facciali.

La mandibola è composta da due strati di ossa corticali spesse con midollo osseo spongioso in mezzo in modo che possa caricare la potenza della masticazione. Pertanto, la mandibola, in particolare l'area rapale ascendente, viene solitamente utilizzata come sito donatore per ottenere innesti ossei autologhi in interventi chirurgici craniomaxillo-facciali10. E in interventi chirurgici come l'osteotomia del ramo diviso sagittale mandibolare e la plastica di riduzione dell'angolo mandibolare, parti dell'osso corticale e spongioso mandibolare devono essere rimosse per ottenere un piacevole contorno facciale. Quelle ossa spugnose scartate potrebbero essere una potenziale risorsa per le hMSC. Tuttavia, pochi studi pubblicati hanno descritto il protocollo per isolare rapidamente e coltivare MSC derivate dal midollo osseo mandibolare umano di alta qualità (hmBMSC).

Il presente studio utilizza un metodo di aderenza modificato del midollo osseo intero per introdurre un protocollo affidabile e riproducibile per l'isolamento e la coltura di hmBMSC. E le cellule staminali sono state identificate mediante immunofenotipizzazione citofluorimetrica delle MSC, saggi di proliferazione e induzione della differenziazione multilineare. L'applicazione di questa procedura standard può aiutare i ricercatori a ottenere MSC derivate dal midollo osseo mandibolare umano di alta qualità, che è importante in ulteriori studi sulla funzione biologica, sugli effetti microambientali e sulle applicazioni cliniche.

Protocollo

La procedura per il prelievo di campioni di osso mandibolare umano è stata approvata dal Comitato Etico della Scuola di Stomatologia, la Quarta Università Medica Militare. Lo studio ha seguito le linee guida etiche della Dichiarazione di Helsinki del 1975. Tutti i donatori per il presente studio sono stati informati dei possibili rischi e degli obiettivi dello studio. L'età dei donatori variava tra i 18 e i 40 anni e non c'erano pregiudizi di genere. Il consenso scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti umani.

1. Preparazione all'intervento chirurgico

  1. Seleziona il donatore appropriato.
    1. Selezionare come donatori i pazienti che intendono sottoporsi a interventi chirurgici come l'arretramento mandibolare a seguito di osteotomia del ramo diviso sagittale e la plastica di riduzione dell'angolo mandibolare.
  2. Preparare la soluzione di conservazione.
    1. Integrare 30 mL di soluzione salina tampone fosfato (1x PBS) con penicillina all'1% e streptomicina in una provetta da centrifuga da 50 mL sterile e priva di enzimi il giorno prima dell'intervento. Conservalo in frigorifero a 4 °C.
    2. Il giorno dell'intervento, mettere la provetta da centrifuga con la soluzione di conservazione in una ghiacciaia e conservarla in sala operatoria 1 ora prima dell'intervento.
  3. Sterilizzare gli strumenti per isolare il midollo osseo il giorno prima dell'intervento, comprese forbici, pinzette e coltelli a 120 °C e 0,27 MPa di pressione per 20 minuti.
  4. Preparare il terreno di coltura α-MEM mescolando il terreno essenziale minimo alfa (α-MEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina e streptomicina.
  5. Preparare un terreno di differenziazione osteogenico mescolando α-terreno di coltura MEM con 50 mM di acido ascorbico, 10 mM di β-glicerolo fosfato e 0,1 mM di desametasone (vedere la Tabella dei materiali).
  6. Preparare il terreno di differenziazione adipogenico A mescolando il terreno di coltura α-MEM con 1 mM di desametasone, 0,2 mM di indometacina, 10 μg/mL di insulina e 0,5 mM di 3-isobutile-1-metilxantina (IBMX) (vedere la Tabella dei materiali).
  7. Preparare il terreno di differenziazione adipogenico B mescolando il terreno di coltura α-MEM con 10 μg/mL di insulina.
  8. Preparare il terreno di differenziazione condrogenica mescolando il terreno di Eagle's modificato di Dulbecco con glucosio alto (HG-DMEM) e 100 nM di desametasone, 100 g/mL di piruvato di sodio, 25 mg/mL di vitamina C, 40 mg/mL di prolina, 10 ng/mL di TGF-β3 e 1% di ITS (vedere la Tabella dei materiali).
    NOTA: Il terreno di differenziazione osteogenico, adipogenico e condrogenico può essere preparato internamente, come accennato in precedenza. Tuttavia, nel presente studio sono stati utilizzati kit disponibili in commercio per lo stesso (vedi Tabella dei materiali).

2. Prelievo di un campione di osso mandibolare umano

  1. Prima dell'intervento, studiare attentamente le immagini della scansione tomografica computerizzata tridimensionale e la pianificazione della simulazione chirurgica dei donatori (Figura 1).
  2. Selezionare il sito mandibolare che il donatore prevede di rimuovere in chirurgia ed è ricco di osso spongioso con midollo osseo come sito donatore.
  3. Disinfettare e drappeggiare il paziente prima dell'operazione.
  4. Resecare il sito donatore selezionato della mandibola utilizzando la lama dell'osteotomo a ultrasuoni (vedi Tabella dei materiali), evitando lesioni del nervo alveolare inferiore e compromissione dell'osso del donatore.
  5. Inserire i campioni di osso mandibolare nella soluzione di conservazione (passaggio 1.2) il prima possibile.
  6. Collocare la soluzione di conservazione con i campioni ossei in una ghiacciaia fino all'inizio dell'isolamento delle MSC in laboratorio.
    NOTA: L'isolamento delle MSC deve essere avviato il prima possibile dopo la raccolta per preservare la vitalità delle cellule. Se l'isolamento delle MSC non può essere effettuato immediatamente, la soluzione di conservazione con campioni ossei può essere conservata in una ghiacciaia o refrigerata a 4 °C per un massimo di 2 ore.

3. Isolamento e coltivazione di mBMSC umane

  1. Estrarre i campioni ossei dalla soluzione di conservazione e immergerli in 1x PBS con penicillina all'1% e streptomicina per 5 minuti su un banco pulito della camera a flusso laminare.
    NOTA: Questo passaggio mira a lavare via il coagulo di sangue e i liquidi orali residui ed eliminare ulteriormente il microrganismo perché la bocca non è un ambiente completamente sterile. Prima dell'isolamento e della coltivazione delle celle, lavarsi e disinfettare le mani con alcol e indossare guanti e mascherine sterili monouso.
  2. Pulire i tessuti molli aderenti e il sangue sulla superficie ossea utilizzando una garza umida sterile.
  3. Riempire una piastra di coltura sterile da 6 cm con 5 mL di terreno di coltura α-MEM.
  4. Mettere l'osso nella piastra di coltura sterile e tagliarlo in piccoli pezzi (quasi 2-3 mm3 di volume) con un coltello sterilizzato o una forbice.
    NOTA: Tenere i campioni di osso con una pinzetta per evitare un taglio con le dita.
  5. Aspirare il terreno di coltura α-MEM nella piastra di coltura con una siringa sterile monouso da 1 ml.
  6. Inserire l'ago della siringa con il terreno di coltura α-MEM in profondità nella cavità del midollo osseo dei pezzi di campione di osso spongioso.
  7. Sciacquare il midollo osseo nella piastra di coltura con la siringa da tutti i lati dei pezzi del campione osseo, almeno 5-10 volte per lato.
  8. Ripetere i passaggi 3.5-3.7 fino a quando tutti i pezzi del campione osseo diventano di colore bianco puro per garantire che la maggior quantità di midollo osseo venga lavata nel terreno di coltura.
    NOTA: Il tempo di funzionamento totale dei passaggi precedenti da 3.1 a 3.8 deve essere controllato entro 30 minuti sul ghiaccio.
  9. Rimuovere e scartare tutti i pezzi di campione osseo con una pinzetta. Rimuovere altri piccoli frammenti utilizzando un filtro cellulare con pori di 70 μm.
  10. Agitare delicatamente la piastra di coltura per distribuire uniformemente le cellule lavate.
  11. Collocare la capsula di coltura in un incubatore cellulare e coltivare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2.
  12. Il terzo giorno di coltura, controllare la morfologia cellulare e lo stato di crescita al microscopio ottico. Rimuovere metà del terreno di coltura senza cellule aderenti e frammento di tessuto; aggiungere 3 mL di terreno di coltura α-MEM fresco.
  13. Al 7° giorno di coltura, rimuovere tutto il terreno di coltura e aggiungere 5 ml di terreno di coltura α-MEM fresco.
  14. Quindi, aggiornare il terreno di coltura α-MEM ogni 3 giorni.
  15. Controlla la morfologia e la crescita cellulare ogni giorno.
    NOTA: Quando le colture cellulari primarie (P0) raggiungono il 70%-80% di confluenza dopo 7-10 giorni di coltura, effettuare il passaggio cellulare.

4. Passaggio cellulare

  1. Alla confluenza del 70%-80%, rimuovere tutto il terreno di coltura delle cellule P0. Lavare delicatamente la piastra di coltura con 1 PBS due volte per pulire il terreno di coltura residuo.
  2. Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% con EDTA allo 0,02% al piatto di coltura per digerire le cellule. Agitare delicatamente il piatto di coltura per assicurarsi che la tripsina sia distribuita uniformemente. Posizionare la capsula di coltura a 37 °C per 3 minuti.
  3. Controllare le cellule al microscopio. Quando il 70%-80% delle cellule si contrae e si arrotonda, aggiungere 2 ml di terreno di coltura α-MEM per fermare la reazione digestiva.
  4. Soffiare delicatamente la superficie del piatto più volte con una pipetta per soffiare le cellule.
  5. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  6. Scartare il surnatante e risospendere le cellule con il terreno di coltura α-MEM. Seminare le cellule P0 in fiasche di coltura (25 cm) per l'espansione con un rapporto di divisione 1:2. Le prime celle di passaggio sono state chiamate cellule P1.
  7. Quando le cellule P1 raggiungono il 70%-80% di confluenza, ripetere il passaggio della cella seguendo i passaggi da 4.1-4.6. Le cellule di seconda generazione sono state chiamate cellule P2.
  8. Modificare il rapporto di divisione dell'espansione a 1:3 dopo il passaggio della cella di terza generazione.
  9. Utilizzare le celle da P3 a P5 per condurre esperimenti di identificazione.

5. Analisi citofluorimetrica

  1. Digerire le MSC da P3 a P5 utilizzando tripsina allo 0,25% con EDTA allo 0,02%, seguendo i passaggi 4.1-4.5.
  2. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 1x PBS a una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL.
  3. Trasferire le cellule in provette da microcentrifuga con 100 μl di sospensione cellulare per provetta.
  4. Aggiungere anticorpi monoclonali anti-umani di topo immunomarcati nelle provette della microcentrifuga.
    NOTA: Per il presente studio, sono stati utilizzati l'anticorpo coniugato con ficoeritrina (PE) contro CD45, l'anticorpo coniugato con fluoresceina-isotiocianato (FITC) contro CD90, CD34 e CD44 4,11 (vedi Tabella dei materiali) e le diluizioni degli anticorpi erano tutte 1:100. Le diluizioni degli anticorpi devono seguire le istruzioni del produttore. PBS servirà come controllo.
  5. Incubare gli anticorpi e il controllo PBS a temperatura ambiente al buio per 30 minuti.
  6. Centrifugare le provette a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare la sospensione e risospendere le cellule in 0,5 mL di 1x PBS. Ripetere questo passaggio due volte.
  7. Caricare le provette nel citometro a flusso (vedere la tabella dei materiali). Contare il numero di cellule marcate con fluorescenza utilizzando un citometro a flusso con un minimo di 10.000 eventi.
    NOTA: È meglio iniziare il processo di conteggio delle cellule del citometro a flusso subito dopo la procedura di marcatura dell'immunofluorescenza. In caso contrario, le cellule devono essere fissate in paraformaldeide all'1%, conservate a 4 °C al buio e terminare il processo entro 24 ore.

6. Saggio di proliferazione cellulare

  1. Utilizzare le cellule P3 per eseguire il saggio di proliferazione cellulare. Digerire le MSC P3 con lo 0,25% di tripsina, seguendo i passaggi 4.1-4.5.
  2. Scartare il surnatante e risospendere le cellule con il terreno di coltura α-MEM.
  3. Contare il numero di cellule con un emocitometro e seminare le cellule su piastre di coltura da 96 pozzetti a una densità di 3 x 103 cellule per pozzetto, per un totale di 35 pozzetti, 5 pozzetti per ogni giorno di conteggio (al giorno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Rinfrescare il terreno di coltura delle cellule ogni 3 giorni.
  4. Ad ogni giorno di conteggio, scartare il terreno di coltura α-MEM dei cinque pozzetti per un determinato giorno di conteggio, quindi aggiungere 100 μL di terreno di coltura e 10 μL di soluzione CCK-8 (vedi Tabella dei materiali). Incubare a 37 °C per 1 ora.
  5. Posizionare le piastre di coltura in uno spettrofotometro per micropiastre (vedere Tabella dei materiali) e misurare il valore della densità ottica di cinque pozzetti per ogni giorno di conteggio (per un totale di 7 giorni di conteggio) a una lunghezza d'onda di 450 nm. Utilizzare cinque pozzetti del terreno di coltura senza cellule come spazi vuoti.
  6. Registrare il valore della densità ottica di ogni pozzetto, calcolare il valore medio e la deviazione standard di cinque pozzetti per ogni giorno di conteggio e tracciare la curva di crescita cellulare 5,12.

7. Differenziazione multilineage

  1. Eseguire l'induzione della differenziazione osteogenica seguendo i passaggi seguenti.
    1. Digerire le cellule P3 con tripsina seguendo i passaggi 4.1-4.5. Seminare le cellule a 2 x 105 cellule/cm2 in una piastra a 6 pozzetti. Aggiungere 2,5 mL di terreno di coltura α-MEM per pozzetto.
    2. Quando le cellule raggiungono la confluenza del 60%-70%, cambiare il terreno di coltura nel terreno di induzione osteogenica (passaggio 1.5). Quindi, cambiare il mezzo di induzione ogni 3 giorni.
    3. Controllare le cellule al microscopio ogni 3 giorni dopo l'induzione. Osserva la morfologia cellulare e cerca i nodi di mineralizzazione evidenti.
    4. Dopo 7 giorni di induzione, eseguire la colorazione con fosfatasi alcalina (ALP) per valutare la calcificazione delle cellule.
    5. Utilizzare 1x PBS per lavare le celle due volte delicatamente. Aggiungere il 4% di paraformaldeide per fissare le cellule a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, utilizzare 1x PBS per lavare le celle due volte.
    6. Aggiungere la soluzione colorante ALP (vedere la Tabella dei materiali) e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
      NOTA: Diversi tipi di soluzione colorante ALP possono colorare le cellule con colori diversi, come grigio scuro, rosso e blu. In questo protocollo, le cellule sono state colorate di blu. Il tempo di incubazione può essere prolungato se il colore della colorazione non è evidente. Alcuni kit di colorazione in soluzione ALP possono essere velenosi; Leggere attentamente le istruzioni prima dell'uso, indossare guanti e maschera durante l'esperimento e lavarsi accuratamente le mani dopo l'uso.
    7. Lavare le cellule con acqua per fermare la reazione di colorazione ALP. Osserva i granuli pigmentati blu nelle cellule al microscopio ottico e scatta le foto. Utilizzare il software Image J per analizzare quantitativamente il grado di colorazione.
    8. Eseguire la colorazione con rosso alizarina (vedi Tabella dei materiali) per valutare la capacità di mineralizzazione delle cellule.
      NOTA: L'evidente formazione di nodi di mineralizzazione delle cellule differenziate di solito può essere osservata dopo 21 giorni dall'induzione.
    9. Utilizzare 1x PBS per lavare le celle due volte delicatamente. Quindi, aggiungere il 4% di paraformaldeide per fissare le cellule a temperatura ambiente per 30 minuti.
    10. Lavare le cellule con 1x PBS due volte, aggiungere la soluzione colorante di rosso alizarina allo 0,1% (vedere la Tabella dei materiali) e incubare per 20 minuti. Ancora una volta, lavare le celle con 1x PBS due volte.
    11. Osservare i noduli rossi tra le cellule fissate al microscopio ottico, che indicano i depositi di calcio della differenziazione osteogenica delle cellule in coltura, e scattare le foto.
    12. Per quantificare la quantità di rosso di alizarina, aggiungere il 10% di cloruro di cetilpiridinio (CPC, vedi Tabella dei materiali) alle cellule colorate di rosso di alizarina e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
    13. Aspirare 50 μl della soluzione CPC e misurare la densità ottica (OD) a una lunghezza d'onda di 540 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre.
  2. Eseguire l'induzione della differenziazione adipogenica.
    1. Seminare le cellule P3 in una piastra a 6 pozzetti utilizzando la procedura descritta sopra (passaggio 7.1).
    2. Quando le cellule ottengono una confluenza dell'80%-90%, cambiare il terreno di coltura nel terreno di differenziazione adipogenica A (passaggio 1.6).
    3. Incubare le cellule con terreno di differenziazione adipogenico A a 37 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO2 per 3 giorni.
    4. Cambiare il terreno di induzione in terreno di differenziazione adipogenica B (passaggio 1.7) e incubare per 1 giorno.
    5. Riportare il terreno al terreno di differenziazione adipogenica A e incubare per 3 giorni. Quindi, sostituire con il medio B per 1 giorno. Ripetere questo ciclo 3-5 volte fino a quando le goccioline lipidiche possono essere viste al microscopio.
      NOTA: Le goccioline lipidiche possono essere osservate circa 21 giorni dopo l'induzione.
    6. Utilizzare il terreno di differenziazione adipogenico B per coltivare le cellule per altri 7 giorni; Quindi, al microscopio si possono vedere goccioline lipidiche grandi e rotonde. Rinfrescare il mezzo B ogni 3 giorni.
    7. Rimuovere il mezzo di induzione e utilizzare 1x PBS per lavare delicatamente le cellule. Quindi, aggiungere il 4% di paraformaldeide per fissare le cellule a temperatura ambiente per 10 minuti.
    8. Lavare le celle con 1x PBS due volte; quindi, incubare le cellule con una soluzione colorante di O rosso olio (1 mL per pozzetto, vedere la Tabella dei materiali) per 15 minuti. Ancora una volta, lavare le celle con 1x PBS due volte.
    9. Metti le cellule al microscopio e osserva le goccioline lipidiche rosse per valutare l'adipogenesi delle cellule differenziate.
  3. Eseguire l'induzione della differenziazione condrogenica.
    1. Digerire e trasferire le cellule P3 in una provetta da centrifuga da 15 mL con numeri di cellule di 5 x 105.
    2. Centrifugare la provetta a 250 x g per 4 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante travasando accuratamente la soluzione superiore.
    3. Aggiungere 0,5 mL di terreno di differenziazione condrogenica (passaggio 1.8) nella provetta per risospendere le cellule e centrifugare nuovamente la provetta a 150 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio due volte.
    4. Allentare il tappo della provetta della centrifuga per facilitare il ricambio d'aria. Posizionare la provetta nell'incubatore e indurre le cellule con 0,5 mL di terreno di differenziazione condrogenico a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2.
    5. Mantenere stabile la provetta da centrifuga senza rimuoverla o scuoterla entro 24 o 48 ore, fino a quando le celle iniziano a pellettare. Muovere il fondo della provetta da centrifuga per sospendere il pellet di cella nel mezzo di differenziazione (passaggio 1.5).
    6. Rinnovare il mezzo di differenziazione condrogenico con una pipetta ogni 3 giorni. Evitare di aspirare il pellet della cella.
    7. Indurre le celle per almeno 21 giorni fino a quando il pellet non si accumula fino a raggiungere un diametro di 2 mm.
    8. Lavare il pellet con 1x PBS e fissarlo con paraformaldeide al 4% per 30 minuti. Dopo la disidratazione e l'inclusione della paraffina13, sezionare il pellet con uno spessore di 3 μm utilizzando un microtomo (vedi Tabella dei materiali).
    9. Metti le sezioni su vetrini. Colorare i vetrini con la soluzione di blu di Alcian (vedi Tabella dei materiali) per 1 ora a 37 °C. Lavare i vetrini macchiati con acqua. Posizionare i vetrini sotto un microscopio ottico e scattare foto del mucopolisaccaride acido colorato di blu che indica i tessuti della cartilagine.

Risultati

Un campione di osso mandibolare è stato raccolto con successo dal paziente. E il tempo dal taglio con la lama ultrasonica dell'osteotomo al posizionamento del frammento osseo nella provetta da centrifuga è di circa 5 minuti. Nessuna delle potenziali complicanze si è verificata durante e dopo la procedura di resezione, inclusi danni al nervo alveolare inferiore o alla radice dentale, infezione, rottura e sanguinamento vascolare, lesioni della mucosa, frattura ossea accidentale, ecc. Le hmBMSC sono state coltivate, fatte passare e differenziate con successo senza contaminazione.

Nel presente studio, molte cellule aderenti sono state osservate al microscopio il terzo giorno dopo la coltura iniziale. Il settimo giorno, la maggior parte delle cellule aderenti era già attaccata alla piastra di coltura. Normalmente, le cellule coltivate hanno raggiunto il 70%-80% di confluenza dopo 7-9 giorni dalla coltura iniziale. Dopo il passaggio, si pensava che le cellule P3 fossero MSC purificate, che mostravano una morfologia a forma di fuso, aderente alla plastica e simile ai fibroblasti (Figura 2). E gli esperimenti di identificazione sono stati condotti in cellule da P3 a P5. Saggio di proliferazione cellulare, il tasso di crescita delle cellule è aumentato rapidamente dal terzo giorno di coltura e il tasso di aumento è rallentato il giorno 6 (Figura 2).

Secondo la definizione data dall'International Society for Cellular Therapy, le MSC hanno un'espressione positiva e negativa di particolari molecole di superficie. In questo studio, l'analisi citofluorimetrica delle cellule di coltura ha mostrato un'espressione positiva di CD44, CD90 e un'espressione negativa di CD45, CD34, che è coerente con la definizione 4,11 (Figura 3). Negli esperimenti di capacità di differenziazione multilineare, le cellule coltivate hanno mostrato una forte capacità di differenziazione osteogenica, adipogenica e condrogenica. Dopo 7 giorni di induzione osteogenica, la deposizione di calcio della matrice extracellulare è emersa al microscopio. Dopo 21 giorni di induzione osteogenica, le cellule in coltura mostravano evidenti nodi di mineralizzazione e i linfonodi sono stati colorati di rosso con colorazione rossa di alizarina (Figura 4). Per l'adipogenesi, nel citoplasma sono state osservate molte goccioline lipidiche rotonde accumulate colorate di rosso mediante colorazione Olio-rosso-O nel citoplasma (Figura 4). Dopo 21 giorni di induzione della differenziazione condrogenica, i vetrini del pellet cellulare che mostrano tessuto simile alla cartilagine con lacuna della cartilagine possono essere colorati di blu (Figura 4).

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Figura 1: Selezione del sito del donatore su immagine TC 3D. (A) Immagine TC 3D della mandibola del donatore da una paziente di 21 anni. (B) Simulazione chirurgica dell'osteotomia bilaterale del ramo sagittale della mandibola. (C) La pianificazione chirurgica mostra l'arretramento di una mandibola divisa. (D) Immagine TC 3D che mostra l'osso corticale (la parte traslucida), l'osso spongioso ricco di midollo osseo e il nervo alveolare inferiore (rosso) in base a diversi valori CT, che possono guidare i chirurghi a selezionare il sito donatore ed evitare lesioni nervose. I frammenti di ossa spongiose sono stati raccolti dalla regione nel rettangolo nero. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Morfologia microscopica e curva di crescita delle cellule staminali del midollo osseo derivate dalla mandibola umana P3 (hmBMSC). (A-C) Morfologia a forma di fuso, aderente alla plastica e simile ai fibroblasti delle hmBMSC P3 (barra della scala = 200 μm, 100 μm, 50 μm per A, B, C, rispettivamente). (D) La curva di crescita cellulare ha mostrato che il tasso di crescita delle hmBMSC è aumentato rapidamente a partire dal terzo giorno di coltura e il tasso di aumento è rallentato il sesto giorno di coltura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: L'espressione dell'antigene sulla superficie cellulare delle hmBMSC è stata rilevata mediante citometria a flusso. L'analisi della citometria a flusso ha mostrato che le hmBMSC erano negative per CD45 (A) e CD44 (C), positive per CD44 (B) e CD90 (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Differenziazione osteogenica, adipogenica e condrogenica delle hmBMSC. (A) Colorazione ALP delle hmBMSC dopo 7 giorni di coltura senza induzione della differenziazione osteogenica (barra della scala = 100 μm). (B) Colorazione ALP di hmBMSC dopo 7 giorni di induzione della differenziazione osteogenica (barra della scala = 100 μm). (C) Risultati quantitativi dell'area positiva di colorazione ALP (***P < 0,001). (D) Colorazione con rosso alizarina di hmBMSC senza differenziazione osteogenica (barra della scala = 100 μm). (E) La formazione di evidenti nodi di mineralizzazione può essere osservata dopo 21 giorni di differenziazione osteogenica di hmBMSCs, e può essere colorata di rosso con colorazione rossa di alizarina (barra della scala = 100 μm). (F) Risultati quantitativi della colorazione con rosso alizarina (***P < 0,001). (G) Colorazione con O rosso olio di hmBMSC senza differenziazione adipogenica (barra della scala = 50 μm); (H) Goccioline lipidiche rotonde sono state osservate dopo 21 giorni di differenziazione adipogenica di hmBMSC e le goccioline lipidiche sono state colorate di rosso con colorazione O rosso olio (barra della scala = 50 μm). (I) La colorazione con blu di Alcian era positiva dopo 21 giorni di induzione della differenziazione condrogenica (barra della scala = 50 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Recentemente, la terapia con hMSCs ha mostrato grandi promesse nella rigenerazione dei tessuti e nel trattamento di molte malattie refrattarie, come le malattie da disfunzione immunitaria, le malattie ematologiche sistemiche, i tumori o i traumi, in numerosi studi clinici 1,14,15,16,17. Tra le varie fonti di MSC, il midollo osseo rimane la fonte più utilizzata e facilmente accessibile. Abbiamo utilizzato chip di osso spongioso mandibolare umano per coltivare con successo BMSC utilizzando il metodo di aderenza dell'intero midollo osseo descritto nel presente protocollo. Ad oggi, esistono quattro approcci principali per isolare le cellule staminali dal midollo osseo, tra cui il metodo di aderenza dell'intero midollo osseo, il metodo di centrifugazione con gradiente di densità, il metodo di selezione cellulare fluorescente e il metodo di selezione cellulare attivato magneticamente10. Il metodo di aderenza dell'intero midollo osseo è semplice, facile da usare, economico e può ottenere grandi quantità di cellule aderenti. Tuttavia, il limite di questo metodo era la bassa purezza delle BMSC primarie in coltura, che venivano mescolate con cellule ematopoietiche e fibroblasti. Dopo aver rinfrescato regolarmente il terreno di coltura delle cellule primarie, le cellule ematopoietiche non aderenti sono state scartate insieme al terreno scartato. Inoltre, i fibroblasti possono essere eliminati attraverso il passaggio cellulare e le cellule P3 erano BMSC altamente purificate. Quindi le cellule da P0 a P2 non possono essere utilizzate per la terapia cellulare, il che significa che è stato necessario più tempo per purificare le cellule staminali. Utilizzando metodi di smistamento cellulare fluorescente e di smistamento cellulare attivato magneticamente, è possibile ottenere BMSC più purificati, mentre i due metodi sono costosi e un lungo tempo di selezione può compromettere la vitalità cellulare11. Per dimostrare che le cellule in coltura erano MSC, abbiamo fatto riferimento alla definizione di MSC umane proposta dal Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee dell'International Society for Cellular Therapy, che includeva il carattere plastico aderente, l'espressione positiva e negativa di alcuni fenotipi, come CD45, CD90 e così via, e la capacità di differenziazione multilineage18.

Nella maggior parte degli studi, i femori e la cresta iliaca erano le principali fonti di BMSC, rispetto alle ossa maxillo-facciali, come la mandibola e la mascella 9,16. Tuttavia, la teoria delle caratteristiche sito-specifiche delle hBMSC in studi recenti ha dimostrato che le hBMSC di ossa diverse avevano caratteri diversi nella capacità di differenziazione, nell'attività proliferativa, nell'osteogenesi e nell'immunità 6,8. La differenza sito-specifica può essere correlata a diverse origini embriologiche, adattamento alle esigenze funzionali in ciascun sito scheletrico, microambiente, apporto vascolare locale, effetti ormonali, ecc. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che l'osso iliaco innestato mostrava una perdita verticale più rapida rispetto all'osso mascellare entro 6 mesi dall'innesto osseo8. Altrimenti, gli studi hanno scoperto che l'attività proliferativa delle MSC del midollo mandibolare era superiore a quella del midollo iliaco 5,8,19,20. E questa differenza di attività proliferativa è stata attribuita ai caratteri che la mandibola aveva più afflusso di sangue e un tasso di ricambio osseo più veloce rispetto all'ileo 5,6,8. Gli studi hanno anche rivelato che le BMSC della mandibola esprimevano un livello più elevato di Runx-2 e OCN rispetto a quelle dei femori e la capacità osteogenica delle BMSC della mandibola era uguale o superiore a quelle dei femori e dell'ileo 5,19,21. L'aderenza alla capacità di titanio delle hmBMSC è risultata anche più forte rispetto alle BMSC dei femori, il che suggeriva che le hmBMSC erano più appropriate per essere utilizzate nell'implantologia orale5. Inoltre, uno studio clinico di 3 anni per ricostruire il difetto alveolare ha rilevato che l'osso rigenerato delle MSC dalla polpa dentale era composto da un osso completamente compatto con una maggiore densità di matrice, mentre le HMC BMSC rigeneravano un osso spugnoso simile alla normale struttura dell'osso alveolare umano22. In conclusione, le hmBMSC erano cellule staminali terapeutiche ideali per la rigenerazione maxillo-facciale e altre malattie a causa della stessa origine embriologica e delle loro caratteristiche superiori.

Tuttavia, la mandibola ha meno midollo osseo rispetto ai femori e all'ileo, quindi è importante ottenere abbastanza midollo osseo e BMSC dalla mandibola per uso clinico. Gli aspirati iliaci umani possono ottenere grandi quantità di midollo osseo per isolare le MSC. I ricercatori hanno anche utilizzato gli aspirati mandibolari per ottenere MSC, mentre la resa iniziale delle MSC dagli aspirati mandibolari era tre volte inferiore a quella degli aspirati iliaci21. Sono state necessarie ulteriori incisioni per raccogliere abbastanza aspirati di midollo mandibolare, aggiungendo ulteriore trauma chirurgico. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che il potenziale proliferativo delle MSC provenienti dai frammenti ossei della mandibola può essere superiore a quello degli aspirati del midollo mandibolare 8,21. Pertanto, in questo studio, i frammenti di osso spongioso della mandibola scartati sono stati utilizzati per isolare le MSC. Poiché entrambi i lati della mandibola sono stati inclusi nell'osteotomia del ramo diviso sagittale o nella plastica di riduzione dell'angolo mandibolare, possiamo ottenere abbastanza midollo mandibolare dai pazienti senza alcun danno aggiuntivo. Recentemente, la tecnologia computer-assistita è stata ampiamente utilizzata nella chirurgia orale e maxillo-facciale per migliorare l'effetto chirurgico e ridurre le complicanze chirurgiche23. Per evitare lesioni alla mandibola e al nervo durante il prelievo del midollo osseo della mandibola, è stata ottenuta l'immagine TC 3D della mandibola dei donatori ed è stata analizzata la pianificazione chirurgica dei donatori per decidere i siti dei donatori e implementare la simulazione chirurgica nello studio; Pertanto, non si è verificata alcuna complicanza chirurgica. La lama ultrasonica dell'osteotomo, un dispositivo specifico per i tessuti che consente ai chirurghi di eseguire osteotomie precise proteggendo i tessuti molli adiacenti24, è stata utilizzata anche per evitare lesioni ai tessuti molli e preservare l'attività del midollo osseo ottenuta.

In sintesi, questo studio ha descritto un protocollo affidabile, semplice, sicuro ed economico per isolare e coltivare adeguate MSC mandibolari umane, che possono essere utilizzate nelle terapie cellulari dei tessuti dentali e maxillo-facciali.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Lo studio è stato sostenuto dalla National Natural Sciences Foundation of China (No.81903249) e dal Natural Science Basic Research Program della provincia dello Shaanxi (No.2019JQ-701, No.2022JZ-50).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4% ParaformaldeidePlantChemMedPC-00005
Terreno di differenziazione adipogenicoOriCell, Cyagen BiosciencesHUXMX-90031
Soluzione blu di alciaOriCell, Cyagen BiosciencesALCB-10001
AlcoolMackline809056
Soluzione colorante rosso di alizarinaSolarbioG1452
soluzione coloranteALP Beijing ComWin Biotech Co.,Ltd.
AutoclaveALP Co., Ltd., GiapponeSoluzione CL-40L
CCK-8Yeasen Biotech Co., Ltd.40203ES80
Filtro cella (70 μ m dimensione dei pori)BD Biosciences352350
Incubatore cellulareThermo Fisher Scientific41334177
CentrifugaEppendorf5805ZP761456
Provetta da centrifuga (50 mL, 15 mL)Sangon BiotechF600888-9001
Cloruro di cetilpiridinioAladinoH108696
Terreno di differenziazione per condrogenesiOriCell, Cyagen BiosciencesHUXMX-90041
Banco pulito/Cabina a flusso laminareBIOBASEBBS-DDS00030
Piatto di coltura (6 cm)Pallonidi coltura Thermo 150462
(25 cm)Piastre di156367
(96 pozzetti, 6 pozzetti)Corning-Costar352350
Guanti e maschere sterili monousoSangon BiotechF516018-9001; F516038-9001
Siringa sterile monouso (1 mL)Shaanxi longkangxin Medical Instrument Co., Ltd1.00009E+11
Dulbecco's modified Eagle's medium con glicemia alta (HG-DMEM)HycloneSH30022.01B
EDTASolarbioE8040-500g
Siero fetale bovino (FBS)PlantChemMedPC-00001
Citometro a flussoBeckman CoulterEPICS XL
Anticorpo monoclonale anti-umano di topo coniugato con fluoresceina-isotiocianato (FITC) contro CD34Biolegend343503
Anticorpo monoclonale anti-umano di topo coniugato con fluoresceina-isotiocianato (FITC) contro CD44Biolegend338804
Anticorpo monoclonale anti-umano coniugato con fluoresceina-isotiocianato (FITC) contro CD90Biolegend328108
EmocitometroKoraba30119480698
GhiacciaiaSangon BiotechF615002-0001
Immagine J softwareNazionale di Salute
Microscopio otticoOLYMPUSIX71-2L20944
Provette per microcentrifugaSangon BiotechF601620-0010
Spettrofotometro per micropiastreBioTek-EPOCH259091
MicrotomoFeica1003001
Software MimicsMaterialise
Medium essenziale minimo alfa (&alfa;-MEM)HycloneSH30265.01
Soluzione colorante O rosso olioSolarbioG1261
Mezzo di differenziazione osteogenicaOriCell, Cyagen BiosciencesHUXMA-90021
Penicillina e streptomicinaPlantChemMedPC-86115
Soluzione salina tampone fosfato (PBS)PlantChemMedPC-00003
Anticorpo monoclonale anti-umano di topo coniugato con ficoeritrina (PE) contro CD45Biolegend304008
PipettaSORFA
ProPlan CMF 3.0Materialise
Forbici, pinzette e coltelliShanghai Jinzhong Surgical instrument Co., LtdZJA030,YAA110,J11010
Garza umida sterileHENAN PIAOAN GROUP Co., Ltd
TrypsinGibco17075029
Lama per osteotomo ad ultrasuoniStryker Instruments5450-815-107
CW0051S coltura termica Istituto Mentale320511

Riferimenti

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