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Articolo metodologico

Iniezioni intravitreali nell'occhio ovino

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⸱

DOI:

10.3791/63823

⸱

5 luglio 2022

 , 
1Faculty of Agriculture and Life Sciences, Lincoln University

In questo articolo

Sommario

Le iniezioni intravitreali sono state eseguite nell'occhio di pecora con l'obiettivo di fornire la terapia genica mediata da virus alla retina.

Abstract

Esistono diversi metodi per la somministrazione di agenti terapeutici alla retina, tra cui la somministrazione intravitreale (IVT), sottoretinica, sopracoroidale, perioculare o topica. La somministrazione di farmaci IVT comporta un'iniezione nell'umore vitreo dell'occhio, una sostanza gelatinosa che riempie la camera posteriore dell'occhio e mantiene la forma del globo oculare. Sebbene la via IVT sia meno mirata rispetto alla somministrazione sottoretinica, è molto meno invasiva ed è ampiamente utilizzata in ambito clinico per una serie di malattie oculari.

Abbiamo precedentemente dimostrato l'efficacia della somministrazione intravitreale di un prodotto di terapia genica mediato da virus adeno-associati (AAV) (AAV9). CLN5) in pecore con una forma naturale CLN5 di ceroide lipofuscinosi neuronale (NCL). Le pecore affette hanno ricevuto la terapia genica IVT in un occhio, con l'altro occhio non trattato che funge da controllo interno. La struttura e la funzione retinica sono state mantenute nell'occhio trattato fino a 15 mesi dopo il trattamento, mentre l'occhio non trattato ha mostrato una funzione progressivamente in declino e una grave atrofia durante l'esame post mortem. Sulla base degli studi sulle pecore, il prodotto di terapia genica CLN5 è stato approvato come nuovo farmaco sperimentale candidato (IND) dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti nel settembre 2021. Questo documento descrive in dettaglio il protocollo chirurgico per la somministrazione IVT di un vettore virale terapeutico all'occhio ovino.

Introduzione

Diversi metodi possono essere utilizzati per fornire agenti terapeutici alla retina, tra cui somministrazione intravitreale (IVT), sottoretinica, sopracoroidale, perioculare o topica. Ogni via di somministrazione comporta il superamento di barriere come la barriera emato-retina o le membrane limitanti interne ed esterne e ha tassi di efficacia variabili a seconda del farmaco somministrato e del bersaglio retinico specifico 1,2.

La somministrazione di farmaci IVT comporta un'iniezione nell'umore vitreo dell'occhio, una sostanza gelatinosa che occupa la camera posteriore dell'occhio. La funzione primaria dell'umore vitreo è quella di mantenere la forma del globo oculare e mantenere i tessuti oculari, come la lente e la retina, in posizione. L'umore vitreo è composto in gran parte da acqua, con piccole quantità di collagene, acido ialuronico e altre proteine non collagene3. L'iniezione IVT è una procedura semplice e comune utilizzata di routine per trattare una vasta gamma di condizioni oculari, tra cui la degenerazione maculare legata all'età, l'edema maculare diabetico, la retinopatia diabetica, l'occlusione venosa retinica e diverse distrofie retiniche ereditarie 4,5.

Ceroidolipofuscinosi neuronale (NCL; Malattia di Batten) sono un gruppo di malattie da accumulo lisosomiale fatali che causano una grave degenerazione del cervello e della retina. Attualmente sono note 13 varianti di NCL derivanti da mutazioni in diversi geni (CLN1-8, CLN10-14) che colpiscono prevalentemente i bambini ma hanno diverse età di insorgenza e gravità della malattia6. Le NCL condividono sintomi progressivi comuni, tra cui declino cognitivo e motorio, convulsioni e perdita della vista. Non esiste una cura per NCL; tuttavia, la terapia enzimatica sostitutiva diretta al cervello è attualmente in studi clinici per la malattia CLN27,8 e la terapia genica mediata da AAV ha mostrato grandi promesse negli studi preclinici, con una sperimentazione clinica per la terapia genica CLN5 che dovrebbe iniziare nel 2022 9,10.

Molte altre specie sviluppano forme naturali di NCL, tra cui gatti, cani, pecore e mucche. Due modelli ovini di NCL sono attualmente in fase di studio attivo in Nuova Zelanda: un modello di malattia CLN5 nelle pecore di Borderdale e un modello di malattia CLN6 nelle pecore del South Hampshire. Le pecore colpite presentano molte delle caratteristiche cliniche e patologiche della malattia umana, tra cui l'atrofia retinica e la perdita della vista10,11. Sebbene la terapia genica CLN5 diretta al cervello nelle pecore con malattia CLN5 possa prevenire o arrestare l'atrofia cerebrale e il declino clinico, le pecore trattate perdono ancora la vista9. Ciò ha evidenziato la necessità di trattare la retina per preservare la vista e mantenere una migliore qualità della vita, portando alla creazione di un protocollo per la terapia genica oculare negli ovini.

L'occhio di pecora rappresenta un buon modello dell'occhio umano grazie alla sua somiglianza nelle dimensioni del globo oculare, nel volume vitreo e nella struttura retinica10,12,13. Questo documento descrive in dettaglio il protocollo chirurgico per la somministrazione IVT di un piccolo volume (≤100 μL) di vettore virale terapeutico all'occhio ovino.

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Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato etico degli animali della Lincoln University e sono in linea con le linee guida del National Institutes of Health degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali nella ricerca e il New Zealand Animal Welfare Act (1999). Le pecore di Borderdale sono state diagnosticate alla nascita14 e mantenute nelle fattorie di ricerca della Lincoln University. Tre pecore omozigoti di 3 mesi (CLN5-/-) hanno ricevuto una singola iniezione IVT all'occhio sinistro, con l'occhio destro non trattato che fungeva da controllo interno. I dati di elettroretinografia e patologia sono stati confrontati con i dati storici di controllo sani e affetti. Il vettore virale utilizzato in questo studio era un sierotipo 9 del virus adeno-associato autocomplementare, contenente il promotore dell'azione beta del pollo (CBh) e l'ovino CLN5 ottimizzato per il codone (scAAV9/CBh-oCLN5opt). Il vettore virale è stato fornito dalla University of North Carolina Vector Core, NC, USA.

1. Pre-chirurgia

  1. Autoclavare il kit chirurgico (Figura 1).
  2. Digiunare le pecore per 24 ore prima dell'intervento.
  3. Registrare pesi vivi prima dell'intervento chirurgico.

figure-protocol-1
Figura 1: Kit di chirurgia intravitreale. Gli strumenti necessari per la chirurgia IVT includono (1) uno speculum per tenere aperte le palpebre e (2) un paio di pinze per il naso curvo per afferrare la congiuntiva bulbare e ruotare l'occhio. (3) Un emostatico naso dritto è incluso anche come strumento alternativo per afferrare la congiuntiva bulbare e tenere l'occhio in posizione se è tornato nell'orbita dell'occhio. Questo kit viene autoclavato prima dell'intervento chirurgico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Procedura chirurgica

  1. Trattenere l'animale e, usando tagliatrici elettroniche, radere la lana da un lato del collo sopra la vena giugulare.
  2. Occludere la vena giugulare applicando pressione alla base del solco giugulare e visualizzare la vena sollevata.
  3. Aspirare la quantità appropriata di diazepam (0,3 mg/kg) e ketamina (7,5 mg/kg) in una siringa sterile e inserire un ago sterile da 20 G. Inserire l'ago nella vena giugulare e tirare delicatamente indietro sullo stantuffo per assicurarsi che il sangue entri nel mozzo e l'ago sia all'interno della vena. Una volta confermato, indurre attraverso la somministrazione endovenosa (giugulare).
  4. Immediatamente dopo l'induzione, posizionare l'animale in posizione dorsale, estendere il collo e tenere la lingua in alto e in avanti, usando un laringoscopio per visualizzare la laringe. Eseguire l'intubazione endotracheale inserendo delicatamente un tubo endotracheale (taglia 6.0-9.0 a seconda delle dimensioni della pecora) tra le corde vocali quando l'animale espira. Gonfiare immediatamente il bracciale endotracheale e fissare il tubo con una cravatta intorno alla mascella inferiore. Confermare il flusso d'aria attraverso il tubo.
  5. Trasferire la pecora sul tavolo chirurgico e posizionarla in posizione sdraiata laterale.
  6. Collegare immediatamente il tubo endotracheale ai tubi della macchina anestetica per l'erogazione di isoflurano al 100% di ossigeno. Iniziare inizialmente con isoflurano al 3% -4% e poi ridurre al 2% -3% per la manutenzione. Osservare la ventilazione spontanea delle pecore.
  7. Monitorare la frequenza cardiaca (polso), la frequenza respiratoria, la saturazione di ossigeno, i livelli di CO2 end-tidal e la temperatura corporea rettale durante tutta la procedura. Vedi Tabella 1 per i valori fisiologici per questi parametri nelle pecore anestetizzate (variabile, ma usare come guida).
  8. Posizionare un grande drappo sterile quadrato su un carrello operatorio chirurgico, seguito dagli strumenti sterili.
  9. Posizionare un drappo chirurgico sterile e fenestrato sull'occhio da iniettare.
  10. Disinfettare asetticamente l'occhio usando una siringa sterile da 20 ml per irrigare l'occhio con una soluzione di iodio povidone all'1-5%.
  11. Applicare 1-2 gocce di soluzione oftalmica Alcaine 0,5% W/V, come anestetico locale, sull'occhio.
  12. Montare uno speculum oculare Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) sulle palpebre per tenere l'occhio aperto.
  13. Afferrare la congiuntiva bulbare sull'aspetto dorsolaterale dell'occhio con una pinza e ruotare il globo oculare ventromedialmente.
CoscienteAnestetizzatiPunto critico di intervento consigliato
Frequenza cardiaca (battiti/min)Da 50-80 (a riposo) a 280 (attivo)50-80<50, >100
Frequenza respiratoria (respiri / min)Da 15-40 (a riposo) a 350 (surriscaldato)10-30<8, >40
Saturazione di ossigeno (mm Hg)95-10098-100<90
CO 2 di fine marea(mm Hg)35-4535-45>55
Temperatura corporea (°C)38.5-39.538.5-39.5<36, >40

Tabella 1: Valori fisiologici dei parametri da monitorare negli ovini anestetizzati.

3. Preparazione virale

  1. Conservare le aliquote vettoriali AAV a -80 °C fino all'uso.
  2. Il giorno dell'intervento, scongelare il numero richiesto di fiale per la consegna IVT sul ghiaccio.
  3. Immediatamente prima della somministrazione, vortice l'aliquota del vettore virale e centrifugare a 400 × g per 10 s per raccogliere il contenuto.
  4. Diluire ciascuna aliquota del vettore virale in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) filtrata sterile 1x alla dose desiderata in un volume finale di 100 μL. Preparare le diluizioni del vettore in una provetta da microcentrifuga sterile da 1,5 mL a basso legame proteico utilizzando punte per pipette filtranti sterili. Smaltire tutti i materiali di consumo che sono stati a contatto con il vettore virale in soluzione disinfettante (vedere la tabella dei materiali).
    NOTA: Nella pubblicazione originale15 la dose dell'agente terapeutico (AAV9. CLN5) era 1,9 x 1010 genomi virali. Il dosaggio raccomandato varierà a seconda dell'agente terapeutico somministrato; Pertanto, un dosaggio non è stato incluso nel protocollo standard presentato qui.
  5. Aspirare l'intero 100 μL del preparato del vettore AAV in una siringa sterile, a basso spazio morto da 1 mL con un ago da 28 G x 1/2 in fissato in modo permanente per l'iniezione immediata. Assicurarsi che il tempo dalla preparazione all'iniezione sia inferiore a 2 minuti.

4. Somministrazione virale

  1. Inserire l'ago circa 7 mm posteriormente alla sclera sull'aspetto laterale dell'occhio e inclinato posteriormente per evitare la lente (Figura 2 e Figura 3). Somministrare la singola iniezione di 100 μL come bolo il più vicino possibile alla retina senza disturbare la superficie retinica.
  2. Risciacquare l'occhio con circa 10-15 ml di soluzione di povidone-iodio all'1-5% seguita da 10 ml di soluzione salina prima di rimuovere lo speculum e il drappo.
  3. Capovolgere le pecore e ripetere con l'altro occhio, se necessario.

figure-protocol-2
Figura 2: Rotazione ventromediale del globo oculare . (A) Afferrare la congiuntiva bulbare con una pinza non dentata e (B) ruotare ventromedialmente (cioè verso il basso e verso il muso) per esporre la superficie dorsolaterale dell'occhio per l'iniezione. Abbreviazioni: V = ventrale, D = dorsale, M = mediale, L = laterale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

figure-protocol-3
Figura 3: Luogo e profondità dell'iniezione. L'ago viene iniettato sull'aspetto dorsolaterale del globo oculare e l'intera lunghezza dell'albero dell'ago (0,5 in/12,7 mm) viene inserita nell'occhio. Notare l'angolo dell'ago verso la parte posteriore dell'occhio per evitare la lente e iniettare il più vicino possibile alla retina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

5. Gestione postoperatoria

  1. Al termine della procedura, interrompere l'anestesia per inalazione di gas isoflurano, lavare la linea con ossigeno al 100%, scollegare il tubo dal tubo endotracheale e trasferire le pecore nella stanza di recupero.
  2. Mettere le pecore in posizione sdraiata sternale, con le zampe nascoste sotto, e monitorare fino al completo recupero. Assicurarsi che la bocca dell'animale sia libera da eventuali ostruzioni.
  3. Quando si osserva il riflesso della deglutizione, sgonfiare parzialmente il bracciale del tubo endotracheale e rimuovere delicatamente il tubo dalla bocca.
  4. Somministrare un antinfiammatorio intramuscolare non steroideo nel muscolo bicipite femorale dell'arto posteriore, antibiotici sottocutanei sul lato del collo o dietro la spalla e collirio cloramfenicolo allo 0,5% sulla superficie del globo oculare.
  5. Fornire acqua e cibo (pellet di erba medica e pula) una volta che le pecore possono stare in piedi senza assistenza.
  6. Somministrare colliri cloramfenicolo allo 0,5% 2-3 al giorno per 7 giorni dopo l'intervento.
  7. Tenere le pecore in casa durante la notte prima di tornare al paddock all'aperto circa 24 ore dopo l'intervento.
  8. Registra le temperature rettali ogni giorno per 3 settimane. Monitorare eventuali cambiamenti nel polso o nella frequenza respiratoria, consumo di cibo, neurocomportamento, temperatura corporea, peso, postura, salute degli occhi e segni clinici di cattiva salute. Cercare un trattamento veterinario appropriato se ci sono indicazioni di eventi avversi.

6. Valutazione dell'efficacia in vivo

  1. Se l'obiettivo dell'iniezione IVT è quello di preservare la vista, monitorare l'efficacia in vivo con metodi come il test del labirinto o l'elettroretinografia (ERG) per valutare la funzione delle cellule retiniche o la tomografia a coerenza ottica (OCT) per valutare la struttura retinica.
    NOTA: Queste misure di efficacia sono state ben descritte dopo la terapia genica IVT11,15,16.

7. Analisi dei tessuti postmortem

  1. Eseguire l'eutanasia delle pecore con un metodo approvato in un endpoint appropriato dopo un intervento chirurgico di iniezione intravitreale.
    NOTA: I metodi di eutanasia suggeriti, come i farmaci per l'eutanasia veterinaria per via endovenosa o un fulmine prigioniero penetrante al rachide cervicale seguito da un rapido dissanguamento, sono dettagliati altrove15,16.
  2. Raccogli i globi di occhio di pecora usando forbici curve chirurgiche affilate / smussate. Tagliare il canto laterale e mediale per aumentare l'apertura dell'orbita oculare e quindi tagliare sistematicamente le pieghe congiuntivali, il tessuto connettivo, i muscoli e il nervo ottico per liberare il globo oculare dalla presa.
  3. Globi oculari enucleati intatti per immersione in formalina al 10% per 2 ore, seguiti da postfissazione nella soluzione di Bouin per 4 ore, facendo un piccolo taglio (0,5 cm) nella sclera per consentire una perfusione sufficiente. In alternativa, fissare a immersione i globi oculari nella soluzione di Davidson per 48 ore.
  4. Elaborare sezioni di tessuto oculare tramite incorporazione di cera di paraffina di routine e sezionamento a 3-5 μm.
    NOTA: Le procedure di colorazione per la colorazione con ematossilina ed eosina (H & E) e l'analisi immunoistochimica sono state descritte in precedenza15,16.
  5. Valutare l'efficacia nel tessuto postmortem mediante misure quali lo spessore totale della retina, lo spessore dello strato retinico, la conta delle file cellulari dello strato nucleare esterno e la colorazione immunoistochimica per i tipi di cellule retiniche, la glia retinica o le proteine di interesse.
    NOTA: Per i protocolli per queste analisi, vedere le pubblicazioni precedenti15,16.

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Risultati

L'efficacia della somministrazione IVT di un vettore di terapia genica CLN5 nell'attenuare la disfunzione retinica e la degenerazione negli ovini con CLN5 NCL è stata precedentemente dimostrata da questo gruppo di ricerca15. Le pecore affette hanno ricevuto una singola iniezione IVT da 100 μL di CLN5 confezionata in un vettore AAV sierotipo 9 (AAV9) (AAV9). CLN5) in un occhio, con l'occhio controlaterale che funge da controllo interno non trattato. La vista è stata valutata mensilmente dall'età al...

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Discussione

Le iniezioni intravitreali sono una delle procedure chirurgiche più comuni nell'oftalmologia umana e si sono dimostrate efficaci nel fornire terapie geniche mediate da AAV alla retina delle pecore. In precedenza avevamo dimostrato l'efficacia di AAV9. La terapia genica CLN5 è stata somministrata per via intravitreale attenuando la disfunzione retinica e la degenerazione negli ovini con CLN5 NCL15. Si spera che anche la traduzione di questa via di somministrazione ai pazienti con NCL umani si rivel...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) per la sua assistenza nello stabilire questo protocollo ed eseguire le iniezioni descritte da Murray et al.15. Gli autori riconoscono anche i finanziamenti di CureKids New Zealand, della Canterbury Medical Research Foundation, di Neurogene Inc e della Batten Disease Support and Research Association.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa di sicurezza a basso spazio morto da 1 ml con ago da 0,5 pollici fissato in modo permanenteFisher Scientific, Auckland, Nuova Zelanda05-561-28Siringa di sicurezza Covidien Monoject Tuberculin o
simile 1,5 ml di provetta per microcentrifugaSigma AldrichHS4323Provette per autoclave da sterilizzare prima dell'uso
Macchina per anestesia con banco a gas e monitor...Hyvet Anesthesia, Christchurch, Nuova Zelanda
Colliri antibiotici Teva Pharma Ltd, Auckland, Nuova ZelandaNome commerciale: Chlorafast (0,5% cloramfenicolo)
BrightMount plus anti-fade mezzo di montaggioAbcam, Cambridge, Regno Unitoab103748
DAPI (4′ ,6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato)Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, Stati Uniti10236276001
Diazepam sedativoIlium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, Nuova Zelanda5 mg/mL
Tubi endotrachealiFlexicare Medical Ltd, Mountain Ash, Regno UnitoStandard, cuffiati. Taglie 7, 7,5 o 8 a seconda delle dimensioni della pecora
Eye speculumCapes Medical Ltd, Tauranga, Nuova ZelandaKP151/14Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)
Telo chirurgico fenestratoAmtech Medical Ltd, Whanganui, Nuova ZelandaDI583O simile 
Puntali filtrantiInterlab, Auckland, Nuova Zelanda10, 200 e 1.000 &; L 
Soluzione di formaldeide (37%)Fisher Scientific, Auckland, Nuova ZelandaAJA809-2.5PLPrepara fino al 10% in acqua distillata con lo 0.9% di NaCl
Capra anti-coniglio Alexa Fluor 594Invitrogen Carlsbad, CA, USA&nbsp; A-11012Utilizzare a una diluizione di 1:500
Anestetico isofluranoAttane, Bayer Animal Health, Auckland, Nuova Zelanda
Ketamina HCl anestetico/analgesicoPhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, Nuova Zelanda100 mg/mL
Laringoscopio (veterinario)KaWe Medical, DanimarcaMiller C lama, misura 2
Aghi Capes Medical Ltd, Tauranga, Nuova Zelanda302025BD Aghi ipodermici, o simili
Antinfiammatorio non steroideoBoehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, Nuova Zelanda49402/008Nome commerciale: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)
Pinze non dentateCapes Medical Ltd, Tauranga, Nuova ZelandaAB864/16O simile 
Emostatico non dentatoCapes Medical Ltd, Tauranga, Nuova ZelandaAA150/12O simile 
Siero di capra normaleThermo Fisher Scientific, Christchurch, Nuova Zelanda16210072
Ossigeno (medico)BOC Gas, Christchurch, Nuova ZelandaBombola D2, codice gas 180
Soluzione salina tamponata con fosfato Thermo Fisher Scientific, Christchurch, Nuova Zelanda10010023Soluzione sterile
iodio povidoneCapes Medical Ltd, Tauranga, Nuova Zelanda005835Nome commerciale: Betadine (10% di iodio povidone)
Proteina acida fibrillare gliale anti-mucca di coniglio (GFAP)Dako, Glostrup, DanimarcaZ0334Utilizzare con una diluizione di 1:2.500
Sierotipo 9 del virus adeno-associato autocomplementare, contenente il promotore dell'azione beta del pollo (CBh) e l'ovino ottimizzato per il codone CLN5University of North Carolina Vector Core, NC, USA.scAAV9/CBh-oCLN5opt
Cloruro di sodio 0,9% Soluzione IVCapes Medical Ltd, Tauranga, Nuova ZelandaAHB1322Nome commerciale: Soluzione salina 
Antibiotici sottocutaneiIntervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, Nuova ZelandaNome commerciale: Duplocillin LA (150.000 UI/mL di procaina penicillina e 115.000 UI/mL di penicillina benzatina)
Forbici curve smussate affilate chirurgiche Capes Medical Ltd, Tauranga, Nuova ZelandaSSSHBLC130
Terumo Siringa Luer LockAmtech Medical Ltd, Whanganui, Nuova ZelandaSH159/SH160Siringhe sterili; 10 mL per la preparazione di farmaci di induzione, 20 mL per la preparazione di soluzione salina
Virkon Disinfettante in polvereEBOS Group Ltd, Christchurch, Nuova Zelanda28461115
di filtrata

Riferimenti

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