Le iniezioni intravitreali sono state eseguite nell'occhio di pecora con l'obiettivo di fornire la terapia genica mediata da virus alla retina.
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Articolo metodologico
Iniezioni intravitreali nell'occhio ovino
In questo articolo
Sommario
Abstract
Esistono diversi metodi per la somministrazione di agenti terapeutici alla retina, tra cui la somministrazione intravitreale (IVT), sottoretinica, sopracoroidale, perioculare o topica. La somministrazione di farmaci IVT comporta un'iniezione nell'umore vitreo dell'occhio, una sostanza gelatinosa che riempie la camera posteriore dell'occhio e mantiene la forma del globo oculare. Sebbene la via IVT sia meno mirata rispetto alla somministrazione sottoretinica, è molto meno invasiva ed è ampiamente utilizzata in ambito clinico per una serie di malattie oculari.
Abbiamo precedentemente dimostrato l'efficacia della somministrazione intravitreale di un prodotto di terapia genica mediato da virus adeno-associati (AAV) (AAV9). CLN5) in pecore con una forma naturale CLN5 di ceroide lipofuscinosi neuronale (NCL). Le pecore affette hanno ricevuto la terapia genica IVT in un occhio, con l'altro occhio non trattato che funge da controllo interno. La struttura e la funzione retinica sono state mantenute nell'occhio trattato fino a 15 mesi dopo il trattamento, mentre l'occhio non trattato ha mostrato una funzione progressivamente in declino e una grave atrofia durante l'esame post mortem. Sulla base degli studi sulle pecore, il prodotto di terapia genica CLN5 è stato approvato come nuovo farmaco sperimentale candidato (IND) dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti nel settembre 2021. Questo documento descrive in dettaglio il protocollo chirurgico per la somministrazione IVT di un vettore virale terapeutico all'occhio ovino.
Introduzione
Diversi metodi possono essere utilizzati per fornire agenti terapeutici alla retina, tra cui somministrazione intravitreale (IVT), sottoretinica, sopracoroidale, perioculare o topica. Ogni via di somministrazione comporta il superamento di barriere come la barriera emato-retina o le membrane limitanti interne ed esterne e ha tassi di efficacia variabili a seconda del farmaco somministrato e del bersaglio retinico specifico 1,2.
La somministrazione di farmaci IVT comporta un'iniezione nell'umore vitreo dell'occhio, una sostanza gelatinosa che occupa la camera posteriore dell'occhio. ....
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Protocollo
Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato etico degli animali della Lincoln University e sono in linea con le linee guida del National Institutes of Health degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali nella ricerca e il New Zealand Animal Welfare Act (1999). Le pecore di Borderdale sono state diagnosticate alla nascita14 e mantenute nelle fattorie di ricerca della Lincoln University. Tre pecore omozigoti di 3 mesi (CLN5-/-) hanno ricevuto una singola iniezione IVT all'occhio sinistro, con l'occhio destro non trattato che fungeva da controllo interno. I dati di elettroretinografia e patologia sono stati ....
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Risultati
L'efficacia della somministrazione IVT di un vettore di terapia genica CLN5 nell'attenuare la disfunzione retinica e la degenerazione negli ovini con CLN5 NCL è stata precedentemente dimostrata da questo gruppo di ricerca15. Le pecore affette hanno ricevuto una singola iniezione IVT da 100 μL di CLN5 confezionata in un vettore AAV sierotipo 9 (AAV9) (AAV9). CLN5) in un occhio, con l'occhio controlaterale che funge da controllo interno non trattato. La vista è stata valutata mensilmente dall'età al.......
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Discussione
Le iniezioni intravitreali sono una delle procedure chirurgiche più comuni nell'oftalmologia umana e si sono dimostrate efficaci nel fornire terapie geniche mediate da AAV alla retina delle pecore. In precedenza avevamo dimostrato l'efficacia di AAV9. La terapia genica CLN5 è stata somministrata per via intravitreale attenuando la disfunzione retinica e la degenerazione negli ovini con CLN5 NCL15. Si spera che anche la traduzione di questa via di somministrazione ai pazienti con NCL umani si rivel.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) per la sua assistenza nello stabilire questo protocollo ed eseguire le iniezioni descritte da Murray et al.15. Gli autori riconoscono anche i finanziamenti di CureKids New Zealand, della Canterbury Medical Research Foundation, di Neurogene Inc e della Batten Disease Support and Research Association.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa di sicurezza a basso spazio morto da 1 ml con ago da 0,5 pollici fissato in modo permanente | Fisher Scientific, Auckland, Nuova Zelanda | 05-561-28 | Siringa di sicurezza Covidien Monoject Tuberculin o |
| simile 1,5 ml di provetta per microcentrifuga | Sigma Aldrich | HS4323 | Provette per autoclave da sterilizzare prima dell'uso |
| Macchina per anestesia con banco a gas e monitor... | Hyvet Anesthesia, Christchurch, Nuova Zelanda | ||
| Colliri antibiotici | Teva Pharma Ltd, Auckland, Nuova Zelanda | Nome commerciale: Chlorafast (0,5% cloramfenicolo) | |
| BrightMount plus anti-fade mezzo di montaggio | Abcam, Cambridge, Regno Unito | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, Stati Uniti | 10236276001 | |
| Diazepam sedativo | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, Nuova Zelanda | 5 mg/mL | |
| Tubi endotracheali | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, Regno Unito | Standard, cuffiati. Taglie 7, 7,5 o 8 a seconda delle dimensioni della pecora | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, Nuova Zelanda | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Telo chirurgico fenestrato | Amtech Medical Ltd, Whanganui, Nuova Zelanda | DI583 | O simile |
| Puntali filtranti | Interlab, Auckland, Nuova Zelanda | 10, 200 e 1.000 &; L | |
| Soluzione di formaldeide (37%) | Fisher Scientific, Auckland, Nuova Zelanda | AJA809-2.5PL | Prepara fino al 10% in acqua distillata con lo 0.9% di NaCl |
| Capra anti-coniglio Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA& | nbsp; A-11012 | Utilizzare a una diluizione di 1:500 |
| Anestetico isoflurano | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, Nuova Zelanda | ||
| Ketamina HCl anestetico/analgesico | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, Nuova Zelanda | 100 mg/mL | |
| Laringoscopio (veterinario) | KaWe Medical, Danimarca | Miller C lama, misura 2 | |
| Aghi | Capes Medical Ltd, Tauranga, Nuova Zelanda | 302025 | BD Aghi ipodermici, o simili |
| Antinfiammatorio non steroideo | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, Nuova Zelanda | 49402/008 | Nome commerciale: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Pinze non dentate | Capes Medical Ltd, Tauranga, Nuova Zelanda | AB864/16 | O simile |
| Emostatico non dentato | Capes Medical Ltd, Tauranga, Nuova Zelanda | AA150/12 | O simile |
| Siero di capra normale | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, Nuova Zelanda | 16210072 | |
| Ossigeno (medico) | BOC Gas, Christchurch, Nuova Zelanda | Bombola D2, codice gas 180 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, Nuova Zelanda | 10010023 | Soluzione sterile |
| iodio povidone | Capes Medical Ltd, Tauranga, Nuova Zelanda | 005835 | Nome commerciale: Betadine (10% di iodio povidone) |
| Proteina acida fibrillare gliale anti-mucca di coniglio (GFAP) | Dako, Glostrup, Danimarca | Z0334 | Utilizzare con una diluizione di 1:2.500 |
| Sierotipo 9 del virus adeno-associato autocomplementare, contenente il promotore dell'azione beta del pollo (CBh) e l'ovino ottimizzato per il codone CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Cloruro di sodio 0,9% Soluzione IV | Capes Medical Ltd, Tauranga, Nuova Zelanda | AHB1322 | Nome commerciale: Soluzione salina |
| Antibiotici sottocutanei | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, Nuova Zelanda | Nome commerciale: Duplocillin LA (150.000 UI/mL di procaina penicillina e 115.000 UI/mL di penicillina benzatina) | |
| Forbici curve smussate affilate chirurgiche | Capes Medical Ltd, Tauranga, Nuova Zelanda | SSSHBLC130 | |
| Terumo Siringa Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, Nuova Zelanda | SH159/SH160 | Siringhe sterili; 10 mL per la preparazione di farmaci di induzione, 20 mL per la preparazione di soluzione salina |
| Virkon Disinfettante in polvere | EBOS Group Ltd, Christchurch, Nuova Zelanda | 28461115 |
Riferimenti
- Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye. Neural Regeneration Research.
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Ristampe e permessi
