Analisi a singola molecola dei motori della famiglia Kinesin-3 superprocessiva purificata Sf9

Pushpanjali Soppina; Dipeshwari J. Shewale; Pradeep K. Naik; Virupakshi Soppina

doi:10.3791/63837

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Articolo metodologico

Analisi a singola molecola dei motori della famiglia Kinesin-3 superprocessiva purificata Sf9

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DOI:

10.3791/63837

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27 luglio 2022

Pushpanjali Soppina¹^,² , Dipeshwari J. Shewale¹ , Pradeep K. Naik² , Virupakshi Soppina¹

¹Discipline of Biological Engineering, Indian Institute of Technology Gandhinagar, ²Department of Biotechnology and Bioinformatics, Sambalpur University

In questo articolo

Sommario

Questo studio descrive in dettaglio la purificazione di KIF1A (1-393LZ), un membro della famiglia kinesin-3, utilizzando il sistema di espressione del baculovirus Sf9. L'analisi in vitro di scorrimento monomolecola e multimotore di questi motori purificati ha mostrato robuste proprietà di motilità paragonabili ai motori del lisato cellulare di mammifero. Pertanto, il sistema Sf9-baculovirus è suscettibile di esprimere e purificare la proteina motoria di interesse.

Abstract

Un ambiente cellulare complesso pone sfide per l'analisi della motilità di singole molecole. Tuttavia, i progressi nelle tecniche di imaging hanno migliorato gli studi sulle singole molecole e hanno guadagnato un'immensa popolarità nel rilevare e comprendere il comportamento dinamico delle molecole marcate con fluorescenza. Qui, descriviamo un metodo dettagliato per studi in vitro a singola molecola di motori della famiglia kinesin-3 utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF). Kinesin-3 è una grande famiglia che svolge ruoli critici nelle funzioni cellulari e fisiologiche che vanno dal trasporto intracellulare del carico alla divisione cellulare allo sviluppo. Abbiamo dimostrato in precedenza che i motori della chinesina-3 dimerica costitutivamente attivi mostrano una motilità veloce e superprocessiva con elevata affinità microtubulare a livello di singola molecola utilizzando lisati cellulari preparati esprimendo motori in cellule di mammifero. Il nostro laboratorio studia i motori della chinesina-3 e i loro meccanismi di regolazione utilizzando approcci cellulari, biochimici e biofisici, e tali studi richiedono proteine purificate su larga scala. L'espressione e la purificazione di questi motori utilizzando cellule di mammifero sarebbe costosa e richiederebbe molto tempo, mentre l'espressione in un sistema di espressione procariotica ha portato a proteine significativamente aggregate e inattive. Per superare i limiti posti dai sistemi di purificazione batterica e dal lisato cellulare di mammifero, abbiamo stabilito un robusto sistema di espressione del baculovirus Sf9 per esprimere e purificare questi motori. I motori kinesin-3 sono marcati C-terminalmente con proteine fluorescenti 3-tandem (3xmCitirine o 3xmCit) che forniscono segnali potenziati e diminuzione del fotosbiancamento. L'analisi in vitro di scorrimento a singola molecola e multimotore di proteine purificate Sf9 dimostra che i motori della kinesina-3 sono veloci e superprocessivi simili ai nostri studi precedenti che utilizzano lisati cellulari di mammifero. Altre applicazioni che utilizzano questi saggi includono una conoscenza dettagliata delle condizioni oligomeriche dei motori, partner di legame specifici paralleli agli studi biochimici e il loro stato cinetico.

Introduzione

Un ambiente cellulare immensamente affollato pone molte sfide nella selezione di proteine e molecole destinate. Questo intenso carico di lavoro di organizzazione e distribuzione spaziotemporale delle molecole all'interno del citoplasma è facilitato dai motori molecolari e dalle tracce citoscheletriche. I motori molecolari sono gli enzimi che idrolizzano le valute energetiche come l'ATP e utilizzano quell'energia durante la generazione di movimento e forza¹. Sulla base della somiglianza della sequenza di aminoacidi, le chinesine sono raggruppate in 14 famiglie e, nonostante questa somiglianza, ogni motore contribuisce in modo univoco al funziona....