Analisi a singola molecola dei motori della famiglia Kinesin-3 superprocessiva purificata Sf9

Un ambiente cellulare immensamente affollato pone molte sfide nella selezione di proteine e molecole destinate. Questo intenso carico di lavoro di organizzazione e distribuzione spaziotemporale delle molecole all'interno del citoplasma è facilitato dai motori molecolari e dalle tracce citoscheletriche. I motori molecolari sono gli enzimi che idrolizzano le valute energetiche come l'ATP e utilizzano quell'energia durante la generazione di movimento e forza¹. Sulla base della somiglianza della sequenza di aminoacidi, le chinesine sono raggruppate in 14 famiglie e, nonostante questa somiglianza, ogni motore contribuisce in modo univoco al funzionamento di una cellula. I motori della famiglia Kinesin-3 costituiscono uno dei più grandi, comprendente cinque sottofamiglie (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 e KIF28)², associate a diverse funzioni cellulari e fisiologiche, tra cui il trasporto delle vescicole, la segnalazione, la mitosi, la migrazione nucleare e lo sviluppo ^3,4,5. La compromissione della funzione di trasporto della chinesina-3 è implicata in molti disturbi neurodegenerativi, difetti dello sviluppo e malattie tumorali 6,7,8,9.

Recenti lavori hanno dimostrato che i motori della chinesina-3 sono monomeri ma subiscono una dimerizzazione indotta dal carico e determinano una motilità rapida e superprocessiva rispetto alla chinesina convenzionale^10,11,12,13. La loro caratterizzazione biochimica e biofisica richiede una grande quantità di proteine attive purificate. Tuttavia, la loro produzione nel sistema di espressione procariotica ha portato a motori inattivi o aggregati, presumibilmente a causa di incompatibili meccanismi di sintesi proteica, ripiegamento e modifica 14,15,16,17,18. Per aggirare tali limitazioni e aumentare la resa, qui abbiamo stabilito un robusto sistema di espressione del baculovirus Sf9 per esprimere e purificare questi motori.

Il sistema di espressione del baculovirus utilizza linee cellulari di insetti Sf9 come sistema ospite per l'espressione della proteina ricombinante eucariotica ad alto rendimento ^19,20. Il baculovirus possiede un forte promotore della poliedrina che assiste nell'espressione genica eterologa e nella produzione di proteine ricombinanti solubili¹⁷. Grazie alla sua economicità, alla sicurezza da maneggiare e all'elevata quantità di espressione proteica attiva, è diventato uno strumento potente²¹. Per esprimere una proteina di interesse, un passo fondamentale è generare un bacmide ricombinante. Poiché i kit di generazione di bacmidi disponibili in commercio sono costosi e lavoreremo con più campioni, abbiamo sviluppato un protocollo interno per inserti grandi e piccoli di motori kinesin-3 nei batteridi. I motori kinesin-3 purificati con sf9 sono stati utilizzati per caratterizzare in vitro le proprietà di scorrimento dei microtubuli a singola molecola e multimotore utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF). I motori sono marcati C-terminalmente con molecole fluorescenti a 3 tandem (3xmCit) per fornire un segnale migliorato e una riduzione del fotosbiancamento. Grazie al suo maggiore rapporto segnale-rumore, alla minore fototossicità e all'imaging selettivo di un'area molto piccola vicino al vetrino, l'imaging TIRF è stato ampiamente utilizzato per visualizzare la dinamica delle proteine a livello di singola molecola in vivo e in vitro.

Questo studio discute la purificazione dei motori kinesin-3 impiegando il sistema di espressione del baculovirus Sf9 e l'imaging a singola molecola in vitro e l'analisi multi-motore dei motori utilizzando la microscopia TIRF. Nel complesso, questo studio mostra che le proprietà di motilità dei motori purificati Sf9 sono identiche a quelle dei motori preparati da lisati cellulari di mammifero. Pertanto, riteniamo che il sistema Sf9-baculovirus possa essere adattato per esprimere e purificare qualsiasi proteina motoria di interesse.

1. Cultura Sf9, trasfezione e generazione di virus

NOTA: Mantenere le cellule Sf9 in 30 mL di terreno Sf-900/SFM in matraccio conico sterile monouso da 100 mL senza antibiotico/antimicotico a 28 °C. Mantenere la coltura delle sospensioni in uno shaker orbitale a 90 giri/min. Non è richiesta la fornitura di CO₂ e il mantenimento dell'umidità. Le cellule vengono solitamente subcoltivate ogni quarto giorno inoculando 0,5 x 10 6 cellule / ml per raggiungere 2,0 x 10⁶ cellule / mL densità il quarto giorno.

1. Generazione di stock di virus P0
   1. Per la trasfezione, le cellule del seme in un piatto da 35 mm con confluenza di 4,5 x 10⁵ cellule/ml e mantenere a 28 °C senza agitare.
   2. Dopo 24 ore, una volta che le cellule sono attaccate e sembrano sane, procedere alla trasfezione come descritto di seguito.
      1. Tubo A: Mescolare 1 μg di DNA batteridico codificante per il motore KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG specifico per la chinasina-3 costitutivamente attivo con 100 μL di terreno di Grace non integrato.
      2. Tubo B: Mescolare 6 μL di reagente di trasfezione con 100 μL di terreno di Grace non integrato.
      3. Trasferire con cautela il contenuto del tubo A nel tubo B e mescolare accuratamente pipettando su e giù (circa 20 volte).
      4. Incubare la miscela per ~ 45 minuti a temperatura ambiente.
   3. Dopo aver completato l'incubazione, aggiungere 0,8 ml di supporto Grace non integrato alla miscela di cui sopra e mescolare lentamente mediante pipettaggio.
   4. Aspirare delicatamente il supporto Sf-900/SFM dalle cellule (per rimuovere eventuali tracce di siero che potrebbero influire sull'efficienza della trasfezione).
   5. Aggiungere la miscela di trasfezione del punto 1.1.3 goccia a goccia sulla parte superiore delle celle e incubare la piastra per 6 ore a 28 °C.
   6. Dopo l'incubazione, rimuovere con cautela la miscela di trasfezione, aggiungere 2 ml di materiale Sf-900/SFM e incubare ulteriormente per 48 ore a 28 °C.
   7. Controllare l'espressione proteica motoria al microscopio a fluorescenza invertita. La proteina motoria è marcata con una proteina fluorescente, mCitrine, una variante della proteina fluorescente gialla.
      NOTA: Le cellule trasfettate sono state visualizzate al microscopio invertito dotato di contrasto di interferenza differenziale (DIC) e illuminazione a epifluorescenza con un obiettivo 20x (ingrandimento 200 volte), lampada al mercurio e una telecamera EM-CCD. Controllare l'efficienza della generazione e dell'infezione del virus monitorando l'espressione dei motori marcati con mCitrino nelle cellule attraverso l'eccitazione citrina e il cubo del filtro di emissione. Inoltre, verificare i cambiamenti morfologici delle cellule infette, come le cellule / nuclei ingranditi (Figura 1A-C).
   8. Ancora una volta, controllare le cellule 72 ore dopo l'infezione. Di solito, le cellule iniziano a staccarsi dalla superficie (Figura 2).
   9. Se il >5% delle cellule si stacca dalla superficie, raccogliere il terreno con le cellule infette in provette sterili da microcentrifuga da 1,5 ml e ruotare per 5 minuti a 500 x g.
   10. Raccogliere le aliquote di surnatante e congelamento istantaneo di 1 mL in azoto liquido e conservarle come stock P0 a -80 °C o utilizzarle per generare lo stock di virus P1.
2. Generazione di stock di virus P1
   1. Per amplificare ulteriormente lo stock di baculovirus P0 e confermare l'espressione proteica, far crescere cellule Sf9 in coltura di sospensione liquida.
   2. In un matraccio conico sterile da 100 ml, aggiungere 10 mL di materiale Sf-900/SFM con una densità cellulare di 2 x 10⁶ cellule/ml e 1 mL di materiale virale P0. Incubare a 28 °C con agitazione costante a 90 giri/min.
   3. Dopo 72 ore di infezione, verificare l'espressione proteica come descritto in precedenza (fase 1.1.7). Se l'espressione proteica è buona (>90% delle cellule mostra un segnale di fluorescenza citrina brillante) e mostra una significativa morte cellulare (circa il 10%-15%), ruotare le cellule in un tubo conico sterile da 15 mL a 500 x g per 5 minuti.
   4. Raccogliere le aliquote di congelamento supernatante di 1 mL (stock P1) in azoto liquido e conservare a -80°C o procedere per l'infezione su larga scala e la purificazione delle proteine.
3. Infezione su larga scala
   1. Per l'espressione proteica su larga scala, infettare 30 mL della coltura in sospensione a 2 x 10⁶ cellule/mL di densità con 1 mL di stock di virus P1 e incubare a 28 °C con agitazione costante a 90 giri/min.
   2. Dopo ~72 ore dopo l'infezione, controllare l'espressione proteica (in generale, la massima espressione proteica si ottiene tra 65-75 ore dopo l'infezione).
   3. Se il >90% delle cellule mostra un segnale fluorescente luminoso con morte cellulare minima (<5%), raccogliere le cellule in un tubo conico sterile da 50 mL e ruotare verso il basso a 500 x g a 4 °C per 15 minuti.
      NOTA: Ci dovrebbe essere una morte cellulare minima (<5%), perché le cellule morte rilasciano il contenuto cellulare nei media, che porta alla perdita di proteine espresse.
   4. Scartare il surnatante, raccogliere il pellet cellulare e procedere con la purificazione delle proteine.

2. Purificazione Sf9 dei motori kinesin-3

1. Al pellet cellulare di cui sopra, aggiungere 3 ml di tampone di lisi ghiacciato (Tabella supplementare 1) appena integrato con 5 mM DTT, 5 μg/mL di aprotinina, 5 μg/mL di leupeptina e 5 μg/mL di PMSF e lisare le cellule pipettando 20-25 volte senza generare bolle d'aria. Per tutte le composizioni tampone e i reagenti, fare riferimento alla Tabella supplementare 1.
2. Ruotare il lisato cellulare a 150.000 x g per 30 minuti a 4 °C.
3. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco e sterile e mescolare con ~40 μL di resina di affinità M2 anti-FLAG al 50%. Incubare la miscela per 3 ore a 4 °C con burattatura end-to-end.
4. Dopo l'incubazione, pellettare la resina FLAG centrifugando a 500 x g per 1 minuto a 4 °C. Aspirare delicatamente il surnatante senza disturbare il pellet con un ago da 26 G ed eliminarlo.
5. Lavare il pellet di resina FLAG tre volte con tampone di lavaggio ghiacciato (Tabella supplementare 1) appena integrato con 2 mM DTT, 5 μg/mL di aprotinina, 5 μg/mL di leupeptina e 5 μg/mL di PMSF. Pellettare le perle girando a 500 x g per 1 minuto a 4 °C ad ogni lavaggio.
6. Dopo il terzo lavaggio, drenare accuratamente il tampone di lavaggio il più possibile senza disturbare il pellet. Per l'eluizione delle proteine, aggiungere ~70 μL di tampone di lavaggio contenente 100 μg/mL di peptide FLAG al pellet di resina e incubare per una notte a 4 °C con burattatura end-to-end.
7. Il giorno successivo, centrifugare la resina a 500 x g per 1 minuto a 4 °C. Raccogliere il surnatante contenente proteine purificate in un tubo fresco e integrare con glicerolo al 10%. Congelare aliquote di 5 μL in azoto liquido e conservare a -80 °C fino a ulteriore utilizzo.
8. Eseguire il gel SDS-PAGE per determinare la concentrazione e la resa proteica. Insieme alle proteine purificate di interesse, un controllo proteico standard, BSA di concentrazioni note che vanno da 0,2 μg, 0,4 μg, 0,6 μg, 0,8 μg e 1 μg vengono caricati per generare una curva standard. Colorare il gel con blu Coomassie Brilliant (Figura 3).
9. Analizzare il gel utilizzando uno strumento di quantificazione del gel integrato nel software ImageJ. In primo luogo, misurare l'intensità della banda delle concentrazioni note di BSA e generare la curva standard. Quindi, misurare l'intensità della banda proteica purificata e determinare la concentrazione proteica. Per fare ciò apri il software Image J, fai clic sull'opzione Analizza nella barra dei menu e seleziona Gel nel menu a discesa.

3. Saggio di motilità a singola molecola in vitro mediante motori kinesin-3 purificati con Sf9

NOTA: I motori kinesin-3 purificati con Sf9 possono essere utilizzati per studiare proprietà biochimiche e biofisiche come il tasso di turnover dell'ATP, l'affinità dei microtubuli, la velocità, la lunghezza della corsa, la dimensione del passo e la generazione di forza. Qui viene descritto un protocollo dettagliato per l'analisi in vitro della motilità di singole molecole di KIF1A(1-393LZ) utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF). Per tutta la composizione dei tamponi e i reagenti, fare riferimento alla Tabella supplementare 1.

1. Polimerizzazione di microtubuli
   1. In una provetta da microcentrifuga da 0,5 mL pre-raffreddata, preparare una miscela di polimerizzazione mediante pipettaggio nel seguente ordine: 12,0 μL di tampone BRB80, pH 6,9; 0,45 μL di 100 mM MgCl₂, 1 μL di 25 mM GTP.
   2. Estrarre un'aliquota di 10 μL di tubulina da 10 mg/mL immagazzinata in azoto liquido, scongelare immediatamente e aggiungere alla miscela di polimerizzazione di cui sopra. Mescolare delicatamente pipettando 2-3 volte senza creare bolle d'aria.
      NOTA: eseguire i passaggi precedenti in modo rapido e rigorosamente sul ghiaccio.
   3. Lasciare riposare la miscela sopra sul ghiaccio per 5 minuti.
      NOTA: Questo è un passaggio critico per prevenire la denaturazione della tubulina o per evitare la formazione di semi di microtubuli corti.
   4. Trasferire il tubo in un blocco termico/bagno d'acqua preriscaldato a 37 °C e incubare per 30 minuti per la polimerizzazione dei microtubuli.
   5. Mentre i microtubuli si polimerizzano, scongelare un'aliquota di tampone P12 e portarla a temperatura ambiente.
   6. Prima di completare 30 minuti di incubazione, iniziare a preparare il tampone di stabilizzazione MT pipettando 100 μL di tampone P12 in una provetta di microcentrifuga fresca. A questo, aggiungere 1 μL di 1 mM taxolo e immediatamente vortice la miscela.
      NOTA: Iniziare a preparare il tampone di stabilizzazione MT circa 5 minuti prima di completare l'incubazione al punto 3.1.4. Il taxolo stabilizza i microtubuli polimerizzati legandosi alla β-tubulina.
   7. Riscaldare il tampone di stabilizzazione dei microtubuli per 2-3 minuti a 37 °C e aggiungerlo delicatamente ai microtubuli polimerizzati senza disturbare la miscela di polimerizzazione sul fondo.
      NOTA: il riscaldamento del tampone di stabilizzazione lo porterà alla stessa temperatura della miscela di polimerizzazione.
   8. Non picchiettare o pipettare la miscela e incubare ulteriormente a 37 °C per 5 minuti.
   9. Picchiettare delicatamente la miscela e mescolarla con una punta tagliata smussata (capacità 200 μL) utilizzando la pipetta.
      NOTA: Da questo punto in poi, maneggiare sempre i microtubuli con una punta di taglio smussata per evitare la cesoiatura dei microtubuli.
   10. Prelevare 10-15 μL di microtubuli polimerizzati in una cella di flusso per verificare la corretta polimerizzazione dei microtubuli.
       NOTA: È possibile visualizzare i microtubuli non etichettati utilizzando una configurazione di microscopia DIC.
   11. Se i microtubuli sono concentrati, diluirli in tampone P12 integrato con taxolo da 10 μM.
2. Preparazione della camera cellulare a flusso di motilità
   1. Preparare una camera di motilità utilizzando un vetrino, nastro biadesivo e coprivetro (22 mm x 30 mm).
   2. Prendi un vetrino, metti una goccia (~ 70 μL) di acqua distillata deionizzata nel mezzo e puliscila con una carta velina priva di lanugine.
   3. Tagliare due strisce di nastro biadesivo (~35 x 3 mm) e attaccarle saldamente al vetrino parallelamente, lasciando uno spazio di ~4-5 mm tra due strisce per creare uno stretto passaggio.
   4. Quindi, prendi un coprislip e aggiungi una goccia (~ 20 μL) di acqua distillata deionizzata nel mezzo. Posizionare una striscia di carta velina per la pulizia delle lenti priva di lanugine sulla goccia d'acqua fino a quando non assorbe l'acqua. Quindi, farlo scorrere lentamente verso un'estremità del vetrino.
      NOTA: Il coprislip deve essere completamente asciutto. L'acqua non deve essere visibile sul vetrino.
   5. Posizionare il coprislip sulle strisce bifacciali bloccate sulla diapositiva e premere il coprislip in modo uniforme lungo le strisce per aderire saldamente.
      NOTA: assicurarsi che il lato pulito del vetrino sia rivolto verso il vetrino.
   6. Assicurarsi che insieme questo crei una camera stretta di 10-15 μL di capacità per eseguire il saggio di motilità (Figura 4A).
3. Saggio di motilità a singola molecola in vitro
   NOTA: Per studiare le proprietà di motilità a singola molecola basate su microtubuli dei motori, i microtubuli devono essere adsorbiti sulla superficie del coprislip nella camera di motilità.
   1. Diluire i microtubuli polimerizzati stabilizzati con taxolo in tampone P12 integrato con taxolo da 10 μM in rapporto 1:5 e mescolare pipettando lentamente con una punta smussata.
   2. Mantenere la camera di flusso in posizione inclinata (~15-20°). Far scorrere 30 μL di soluzione di microtubuli diluiti attraverso la camera di flusso dall'estremità superiore mantenendo una carta velina priva di lanugine all'estremità inferiore per assorbire il liquido. Questo crea una forza di taglio per allineare il microtubulo nella direzione del flusso e aiuta ad assorbire i microtubuli dritti e ad allineare parallelamente.
   3. Lasciare una piccola goccia di liquido su entrambe le estremità della camera e mantenere la cella di flusso in posizione invertita (coprivetrino rivolto verso il basso) in una camera chiusa e umida per evitare l'essiccazione della camera di motilità.
   4. Lasciare riposare per ~ 30 minuti in modo che i microtubuli adsorbano sulla superficie del coprislip all'interno della camera di motilità.
   5. Nel frattempo, preparare il tampone bloccante mescolando 500 μL di tampone P12-BSA con 5 μL di taxolo da 1 mM.
   6. Far scorrere 40-50 μL di tampone bloccante e incubare il vetrino in posizione invertita per 10 minuti in una camera umida.
   7. Preparare la miscela di motilità pipettando i seguenti componenti in una provetta sterile per microcentrifuga da 500 μL nell'ordine seguente: 25 μL di tampone P12 con taxolo, 0,5 μL di 100 mM MgCl₂, 0,5 μL di 100 mM DTT, 0,5 μL di 20 mg/mL di glucosio ossidasi, 0,5 μL di 8 mg/mL di catalasi, 0,5 μL di 2,25 M di glucosio e 1,0 μL di 100 mM di ATP.
      NOTA: L'imaging a fluorescenza è stato ampiamente utilizzato per applicazioni biologiche 22,23,24,25,26. La fotoeccitazione delle proteine fluorescenti genera specie reattive dell'ossigeno (ROS), che possono causare il fotosbiancamento delle proteine fluorescenti e danni ai campioni biologici^27,28. Gli scavenger di ossigeno come il glucosio, la glucosio ossidasi e la catalasi sono abitualmente utilizzati nei saggi di motilità per limitare il fotodanneggiamento e prolungare il tempo di sbiancamento delle proteine fluorescenti.
   8. Infine, aggiungere 1 μL del motore purificato alla miscela di motilità di cui sopra e mescolare bene prima di fluire nella camera di motilità.
   9. Sigillare entrambe le estremità della camera di motilità con cera di paraffina liquida e immediatamente l'immagine sotto illuminazione TIRF utilizzando l'obiettivo TIRF 100X di 1,49 NA con ingrandimento 1,5x.
   10. Per mettere a fuoco la superficie del coprifoglio, in primo luogo, concentrarsi su uno dei bordi interni del nastro biadesivo nella camera di motilità sotto illuminazione a contrasto di interferenza differenziale (DIC).
       NOTA: La superficie brillante e irregolare sarà visibile.
   11. Quindi, spostare l'attenzione nella camera di motilità. Utilizzando la regolazione fine, focalizzare la superficie del coprislip e cercare i microtubuli adsorbiti sulla superficie del coprifoglio.
   12. Una volta focalizzati i microtubuli, passare all'illuminazione TIRF con un laser di eccitazione a 488 nm e regolare la profondità di illuminazione modificando l'angolo del fascio di eccitazione per ottenere l'illuminazione TIRF migliore e uniforme (Figura 4B).
   13. Mettere a fuoco i singoli motori con tag mCitrine che si muovono in modo processuale lungo la superficie del microtubulo con un'esposizione di 100 ms e registrare il movimento utilizzando una telecamera EM-CCD.
       NOTA: Sebbene i saggi di motilità siano stati eseguiti su microtubuli non marcati, la funzione di proiezione z di massima intensità può essere utilizzata per rivelare il contorno della traccia dei microtubuli. Preferibilmente, gli eventi su lunghe tracce di microtubuli sono stati considerati per l'analisi di tracciamento.
   14. Tracciare manualmente la posizione dei singoli motori contrassegnati a fluorescenza camminando su lunghe tracce di microtubuli fotogramma per fotogramma utilizzando un plug-in personalizzato nel software ImageJ (nih.gov) come descritto in precedenza²⁹.
   15. Generare gli istogrammi di velocità e lunghezza di corsa per la popolazione motoria tracciando il numero di eventi in ciascun contenitore. Adattare questi istogrammi a una singola funzione di picco gaussiana per ottenere velocità media e lunghezza di corsa¹² (Figura 4C-E).

4. Saggio di scorrimento dei microtubuli in vitro

NOTA: Per comprendere il comportamento collettivo dei motori kinesin-3, è stato eseguito il saggio di scorrimento dei microtubuli in vitro 18,30,31. Dove i motori sono immobilizzati sul coperchio in posizione invertita e dopo aver aggiunto microtubuli nella camera, i microtubuli atterrano sui motori e scivolano mentre i motori cercano di camminare su di essi (Figura 5A,B).

1. Polimerizzazione fluorescente dei microtubuli: Polimerizzare i microtubuli seguendo il protocollo descritto in precedenza, ad eccezione della miscelazione della tubulina marcata con rodamina (3 mg/ml) con tubulina non marcata (10 mg/ml) in un rapporto 1:10.
2. Dopo 30 minuti di polimerizzazione, aggiungere delicatamente 30 μL di tampone di stabilizzazione dei microtubuli preriscaldato e incubare ulteriormente per 5 minuti a 37 °C.
3. Quindi, tagliare i microtubuli pipettando con la punta di caricamento capillare (~ 25-30 volte).
4. Preparare la camera a flusso di motilità come descritto in precedenza, far convogliare 50 μL di nanocorpi GFP purificati con Sf9 (2,5 μL di 100 nM diluiti in 50 μL di tampone P12) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con il vetrino rivolto verso il basso in una camera umida.
   NOTA: I motori sono contrassegnati con C-terminale con mCitrine. I nanocorpi GFP sono utilizzati per immobilizzare i motori a causa della loro bassa costante di dissociazione³².
5. Bloccare la superficie del coprislip facendo scorrere 50 μL di tampone di blocco nella camera di flusso per evitare l'adsorbimento proteico non specifico e incubare ulteriormente per 5 minuti.
6. Preparare la miscela di motori pipettando 50 μL di tampone di blocco, 1 μL di ATP da 100 mM e 5 μL di motori kinesin-3 purificati con Sf9 da 100 nM. Mescolare delicatamente prima di fluire nella camera e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente in una camera umida.
7. Lavare la camera due volte con 50 μL di caseina P12.
8. In una provetta da microcentrifuga sterile, preparare la miscela di saggio di scorrimento nel seguente ordine, 45 μL di P12-caseina con 10 μM di taxolo, 1 μL di 100 mM ATP, 0,5 μL di 8 mg/mL catalasi, 0,5 μL di 20 mg/mL di glucosio ossidasi, 0,5 μL di 2,25 M di glucosio e 1 μL di microtubuli fluorescenti tranciati. Mescolare delicatamente il contenuto prima di fluire nella camera di motilità e sigillare le estremità della camera con cera di paraffina liquida.
9. Microtubuli di immagini che scivolano sotto illuminazione TIRF a 100 ms di esposizione e catturano le immagini con la fotocamera EM-CCD collegata.
   NOTA: La velocità media di scorrimento dei microtubuli è stata determinata tracciando manualmente circa 100 singoli microtubuli fotogramma per fotogramma utilizzando un plug-in personalizzato in ImageJ²⁹. Determinare la velocità media di scorrimento dei microtubuli generando un istogramma e adattandolo a una funzione gaussiana (Figura 5C,D).

Per esprimere e purificare le proteine motorie ricombinanti attive e funzionali su larga scala utilizzando l'espressione del baculovirus Sf9, il sistema ha bisogno della generazione di particelle virali che trasportano stabilmente una sequenza codificante per infettare le cellule Sf9. Per raggiungere questo obiettivo, le cellule Sf9 sono state trasfettate con bacmide ricombinante codificante KIF1A (1-393LZ)-3xmCit-FLAG. Dopo 72 ore, una popolazione significativa di cellule ha mostrato espressione di proteina fluorescente verde (mCitrine) con cellule e nuclei ingrossati (Figura 1 e Figura 2), suggerendo la generazione di successo di particelle virali (P0). Queste particelle virali sono state ulteriormente espanse infettando la popolazione di Sf9 fresco a un volume più elevato per generare scorte virali P1 per lo stoccaggio e l'infezione su larga scala. Per la purificazione del motore kinesin-3, una coltura di 30 ml di cellule Sf9 è stata infettata con 1 mL di particelle virali P1. Dopo 72 ore di infezione, le cellule che esprimono brillantemente proteine fluorescenti verdi sono state raccolte, lisate e purificate utilizzando la purificazione di affinità del tag FLAG C-terminale con resina rivestita di anticorpi anti-FLAG. È interessante notare che l'aggiunta del peptide FLAG alle perle attaccate con motori kinesin-3 ha eluito la maggior parte della proteina in una singola frazione e la proteina purificata era di elevata purezza, mostrata come una banda di ~ 120 kDa nella corsia 7 della Figura 3.

La polimerizzazione di successo di microtubuli lunghi e sani per studiare le proprietà di motilità dei motori kinesin-3 purificati con S9 a livello di singola molecola richiede tubulina pura. Nel presente studio, i microtubuli sono stati polimerizzati utilizzando tubulina ciclica 2X purificata dal cervello di capra ad una concentrazione critica tra ~ 2,5-3,0 mg / ml per 30 minuti in assenza di taxolo, poiché il taxolo diminuisce la concentrazione critica della nucleazione dei microtubuli e genera un gran numero di microtubuli corti33,34,35 . Il taxolo è stato aggiunto post-polimerizzazione per stabilizzare i microtubuli e prevenire la depolimerizzazione. I microtubuli polimerizzati con questo metodo hanno dato luogo a strutture lunghe e uniformi (Video 1) con una lunghezza media di 60-70 μm.

L'analisi della motilità in vitro di una singola molecola del motore kinesin-3 purificato con Sf9, KIF1A (1-393LZ) sotto illuminazione TIRF (Figura 4B) ha mostrato un movimento unidirezionale, veloce e superprocessivo lungo il microtubulo (Video 2), come mostrato nel cimografo come lunghe linee bianche diagonali (Figura 4C). L'analisi di tracciamento di questi lunghi eventi di motilità superprocessiva ha mostrato una velocità media e una lunghezza di corsa di 2,44 ± 0,02 μms-1 e 10,79 ± 0,28 μm (Figura 4D-E), rispettivamente. Questi risultati sono in accordo con i nostri dati precedentemente pubblicati12,13 utilizzando motori preparati da lisato cellulare di mammifero mediante sovraespressione. Inoltre, il test multi-motore microtubulo-gliding utilizzando motori purificati Sf9 attaccati sul coprislip sotto illuminazione TIRF ha mostrato un movimento lungo, uniforme e unidirezionale (Figura 5C e Video 3). L'analisi di tracciamento di questi lunghi eventi di scorrimento dei microtubuli ha mostrato una velocità media di 1,37 ± 0,01 μms-1 (Figura 5D).

Insieme, questi risultati suggeriscono che il sistema Sf9-baculovirus fornisce un sistema eccellente per l'espressione e la purificazione delle proteine motorie attive che sono generalmente difficili utilizzando il sistema procariotico. Il tag FLAG offre il vantaggio della purificazione in un'unica fase delle proteine nella sua forma pura. Inoltre, la polimerizzazione dei microtubuli utilizzando tubulina fresca e pura e la loro stabilizzazione dopo la polimerizzazione produce microtubuli lunghi e uniformi. Inoltre, l'analisi della motilità a singola molecola in vitro suggerisce che i motori purificati con Sf9 erano robusti e mostravano proprietà di motilità simili ai motori espressi nei sistemi dei mammiferi.

Figura 1: 48 ore dopo la trasfezione di cellule Sf9 con motore kinesin-3 marcato con fluorescenza: le cellule Sf9 sono state placcate su un piatto di 35 mm ad una densità di 4,5 x 105 cellule/ml. Dopo 24 ore, le cellule sono state trasfettate con DNA bacmidico ricombinante che codifica un motore specifico kinesina-3, KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG utilizzando il reagente di trasfezione. Dopo 48 ore di trasfezione, le immagini sono state catturate sotto interferenza differenziale e contrasto (DIC) e illuminazione a epifluorescenza. (A) Cellule non trasfettate, piccole, rotonde e saldamente attaccate. (B) Cellule trasfettate che esprimono la proteina marcata KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG che mostra un diametro cellulare allargato e debolmente attaccata alla superficie. Barra della scala, 100 μm. (C) Grafico a barre che indica il diametro medio delle celle non trasfettate e trasfettate. Le barre di errore rappresentano la media ± SD. N = 50 celle. Il test t di Student viene utilizzato per trovare il valore di significatività (****p < 0,0001). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: 72 ore dopo la trasfezione di cellule Sf9 con motore kinesin-3 marcato in modo fluorescente: immagini che mostrano oltre il 90% delle cellule Sf9 che esprimono il motore kinesin-3 marcato in modo fluorescente, KIF1A (1-393LZ). Le cellule sono debolmente legate alla superficie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Motore kinesin-3 purificato con Sf9: gel SDS-PAGE colorato con Coomassie che rappresenta il motore kinesin-3 purificato con Sf9, KIF1A(1-393LZ) C-terminalmente marcato con 3xmCit-FLAG. Da sinistra a destra, scala proteica (M), controllo proteico standard BSA, 0,2 μg (corsia 2), 0,4 μg (corsia 3), 0,6 μg (corsia 4), 0,8 μg (corsia 5) e 1,0 μg (corsia 6), motore kinesina-3 purificato (S) (corsia 7). La BSA è stata utilizzata come standard per stimare la concentrazione di proteine purificate. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Saggio di motilità a singola molecola in vitro utilizzando motori di kinesina-3 purificati Sf9:(A) Camera schematica di motilità delle celle a flusso preparata utilizzando un vetrino, un nastro biadesivo e un vetrino. (B) Diagramma a fumetti che illustra l'imaging in vitro di singole molecole di motori marcati con fluorescenza che si muovono lungo la superficie del microtubulo adsorbiti sul vetrino di copertura utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF). Solo le molecole molto vicine al coprivetrino si eccitano a causa del campo evanescente (~150-200 nm) formato dalla riflessione completa della luce incidente quando illuminata con un angolo oltre l'angolo critico. (C) Il cimografo raffigura il motore della kinesina-3 che cammina in modo processuale (linee bianche diagonali) lungo la superficie del microtubulo. Tempo sull'asse y (freccia verticale) e distanza sull'asse x (freccia orizzontale). (D-E) Gli istogrammi di velocità (D) e lunghezza di corsa (E) sono stati determinati seguendo i singoli motori che camminano sulla superficie dei microtubuli fotogramma per fotogramma e gli istogrammi sono stati tracciati per ogni popolazione di motori e adattati a un singolo gaussiano. Il picco rappresenta la velocità media e la lunghezza della corsa e i valori sono mostrati sul grafico come media ± SEM. N = Numero di eventi contati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Saggio di scorrimento dei microtubuli in vitro utilizzando motori kinesin-3 purificati Sf9: (A) Schema della camera della cella di flusso preparata utilizzando un vetrino, un nastro biadesivo e un vetrino. (B) Diagramma a fumetti che illustra i microtubuli marcati con rodamina che scivolano sulla superficie dei motori costitutivamente attivi della kinesina-3. Poiché i motori kinesin-3 sono marcati C-terminalmente con mCitrine, sono stati utilizzati nanocorpi GFP per attaccarli alla superficie del vetro. Successivamente, sono stati introdotti microtubuli marcati con rodamina tranciati nella camera di flusso e sono state catturate immagini del movimento di scorrimento dei microtubuli sotto l'illuminazione TIRF. (C) Il cimografo rappresenta lo scorrimento liscio dei microtubuli (striscia bianca diagonale) da parte dei motori kinesin-3. Tempo sull'asse y (freccia verticale) e distanza sull'asse x (freccia orizzontale). D. Gli istogrammi della velocità sono stati tracciati per una popolazione di microtubuli e adattati a un singolo picco gaussiano . La velocità media di scorrimento è indicata nell'angolo in alto a sinistra come media ± SEM. N = Numero di molecole contate. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Video 1: Microtubuli polimerizzati. Imaging TIRF di microtubuli polimerizzati prima della diluizione per il saggio di motilità. Il filmato è stato acquisito a 100 ms di esposizione e il video viene riprodotto a 60 fotogrammi/s. Barra scala, 10 μm. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Saggio in vitro di singole molecole del motore costitutivamente attivo della kinesina-3. Motori KIF1A(1-393LZ) marcati con fluorescenza purificati da cellule Sf9 che si muovono progressivamente lungo la superficie del microtubulo (non etichettate) adsorbite sul vetrino in una camera di analisi della motilità. L'imaging è stato eseguito con illuminazione TIRF e le immagini sono state acquisite con un'esposizione di 100 ms. Il video viene riprodotto a 30 fotogrammi/s. Barra scala, 10 μm. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 3: Saggio di scorrimento dei microtubuli del motore costitutivamente attivo della kinesina-3. Microtubuli marcati con rodamina scivolano dolcemente sulla superficie del vetrino rivestito con motore purificato KIF1A (1-393LZ) Sf9. L'imaging è stato eseguito con illuminazione TIRF e le immagini sono state acquisite con un'esposizione di 100 ms. Il video viene riprodotto a 60 fotogrammi/s. Barra scala, 10 μm. Clicca qui per scaricare questo video.

Tabella supplementare 1: Composizione dei tamponi e dei reagenti. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da dichiarare.