Tecniche molecolari e immunologiche in un modello murino geneticamente modificato di tumore stromale gastrointestinale

Summary

L'obiettivo di questo manoscritto è quello di descrivere il modello murino Kit^{V558Δ/+ e le} tecniche per la dissezione e l'elaborazione di campioni di topo.

Abstract

Il tumore stromale gastrointestinale (GIST) è il sarcoma umano più comune ed è tipicamente guidato da una singola mutazione nel recettore KIT. Tra i tipi di tumore, sono stati sviluppati numerosi modelli murini al fine di studiare la prossima generazione di terapie contro il cancro. Tuttavia, in GIST, la maggior parte degli studi in vivo utilizza modelli murini con xenotrapianto che presentano limitazioni intrinseche. Qui, descriviamo un modello murino immunocompetente e geneticamente modificato di tumore stromale gastrointestinale che ospita una mutazione Kit^{V558Δ / +} . In questo modello, il KIT mutante, l'oncogene responsabile della maggior parte dei GIST, è guidato dal suo promotore endogeno che porta a un GIST che imita l'aspetto istologico e l'infiltrato immunitario visto nei GIST umani. Inoltre, questo modello è stato utilizzato con successo per studiare sia terapie molecolari mirate che immunitarie. Qui descriviamo l'allevamento e il mantenimento di una colonia di topi Kit^V558Δ/+ . Inoltre, questo documento descrive in dettaglio il trattamento e l'approvvigionamento di GIST, drenaggio del linfonodo mesenterico e cieco adiacente nei topi Kit^{V558Δ / +} , nonché la preparazione del campione per analisi molecolari e immunologiche.

Introduction

GIST è il sarcoma più comune negli esseri umani con un'incidenza di circa 6.000 casi negli Stati Uniti d'America¹. GiST sembra provenire dalle cellule pacemaker gastrointestinali chiamate cellule interstiziali di Cajal ed è tipicamente guidato da una singola mutazione nella tirosin-chinasi KIT o PDGFRA². La chirurgia è il pilastro del trattamento per GIST e può essere curativa, ma i pazienti con malattia avanzata possono essere trattati con l'inibitore della tirosin-chinasi (TKI), imatinib. Dalla sua introduzione oltre 20 anni fa, imatinib ha trasformato il paradigma di trattamento in GIST, migliora....

Protocol

Tutti i topi sono stati ospitati in condizioni prive di agenti patogeni presso l'Università della Pennsylvania secondo le linee guida NIH e con l'approvazione dell'Università della Pennsylvania IACUC. L'eutanasia è stata eseguita seguendo le procedure operative standard dell'Università della Pennsylvania Laboratory Animal Resources.

1. Kit^V558Δ/+ allevamento di topi

1. Incrocia i mouse Kit^V558Δ/+ più di 10 volte su uno sfondo C57BL/6J utilizzando mouse C57BL/6J. Per fare questo, allevare i topi maschi Kit^{V558Δ / +} con topi C57BL ....

Results

Il modello ^{murino Kit V558Δ/+} consente lo studio delle terapie in un modello murino immunocompetente. I topi Kit^V558Δ/+ hanno una durata media di 8 mesi a causa dell'ostruzione intestinale progressiva (Figura 4). I tumori dei topi kit^V558Δ/+ esprimono marcatori canonici di GIST tra cui il KIT tirosin-chinasico e il canale transmembrana DOG1 (Figura 5

Discussion

Il modello^{murino Kit V558Δ/+} è un potente strumento di ricerca nell'analisi molecolare e immunologica del GIST. Sebbene la strategia di allevamento richieda un singolo incrocio, l'utilizzo di coorti di topi Kit^V558Δ/+ in esperimenti di analisi della risposta tumorale richiede un allevamento estensivo. I topi dovrebbero essere abbinati all'età e al sesso per garantire pesi tumorali simili e il 10% dei topi muore prima delle 8 settimane di età quando i tumori sono stabiliti. Strategi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
filtro da 100 micron	EMSCO	1194-2360
1x tampone di lisi RBC	Life Technologies	00-4333-57
Siringa da 3 ml	Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4– Gel proteici prefabbricati Mini-PROTEAN TGX al 15%, 10 pozzetti, 30 & micro; l	Bio-Rad	4561083
Soluzione di paraformaldeide al 4%	Thermo Fisher Scientific AAJ19943K2
Filtro da 40 micron	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
Filtro da 70 micron	EMSCO	1194-2350
Anticorpo AKT (C67E7)	Segnalazione cellulare	4691
Topi C57BL/6J	The Jackson Laboratory
Collagenase IV	Sigma Aldrich	C5138
Mini inibitore completo della proteasi senza EDTA	Thomas Scientific	C852A34
Countess II Contatore di cellule automatizzato	Thermo Fisher Scientific
Bisturi monouso	Thermo Fisher Scientific/Exel International	14-840-00
Dnase I	Thomas Scientific	C756V81
Dog1 anticorpo	abcam	ab64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
ERK anticorpo (p44/42)	Cell Signaling	9102
FBS	Thomas Scientific	C788U23
FIJI software	FIJI		https://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 Omogeneizzatore	Thermo Fisher Scientific	15-340-169
HBSS	University of Pennsylvania Cell Center
Imatinib mesilato	Selleck Chemicals	S1026
KIT anticorpo (D13A2)	Cell Signaling	3074
KitV558Δ/+ Genotipizzazione	Transnetyx
Provette per microcentrifuga (1,5 ml)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Kit di immunorilevazione topo su topo, Basic	Vector Laboratories	BMK-2202
Membrana in nitrocellulosa, pretagliata, 0,45 e micro; m	Rio-Rad	1620145
Latte in polvere scremato	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
p-AKT anticorpo (S473)	Segnalazione cellulare	4060
p-ERK anticorpo (p44/42)	Segnalazione cellulare	9101
p-KIT anticorpo (Y719)	Segnalazione cellulare	3391
Inibitore della proteasi PMSF	Thermo Fisher Scientific	36978
Proeinasi K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
Provette per test del polistirene a fondo tondo (FACS) Falcon	/Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI	University of Pennsylvania Cell Center
Fluoruro di sodio (NaF)	Sigma Aldrich
Ortovanadato di sodio (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura Substrato a durata estesa	Thermo Fisher Scientific	34076
TBS tampone (10x)	University of Pennsylvania Cell Center
Piatto per coltura tissutale (100mm2)	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
piattaforma vivaCT 80	Scanco medical