Le proprietà viscoelastiche del muco svolgono un ruolo fondamentale nella clearance mucociliare. Tuttavia, le tecniche reologiche tradizionali del muco richiedono approcci complessi e dispendiosi in termini di tempo. Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per l'uso di un reometro da banco in grado di eseguire in modo rapido e affidabile misurazioni viscoelastiche.
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Articolo metodologico
Caratterizzazione viscoelastica rapida del muco delle vie aeree utilizzando un reometro da banco
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nelle malattie polmonari muco-ostruttive (ad esempio, asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva, fibrosi cistica) e in altre condizioni respiratorie (ad esempio, infezioni virali / batteriche), le proprietà biofisiche del muco sono alterate dall'ipersecrezione delle cellule caliciformi, dalla disidratazione delle vie aeree, dallo stress ossidativo e dalla presenza di DNA extracellulare. Studi precedenti hanno dimostrato che la viscoelasticità dell'espettorato è correlata alla funzione polmonare e che i trattamenti che influenzano la reologia dell'espettorato (ad esempio, i mucolitici) possono portare a notevoli benefici clinici. In generale, le misurazioni reologiche di fluidi non newtoniani impiegano approcci elaborati e dispendiosi in termini di tempo (ad esempio, reometri paralleli / cone-plate e / o tracciamento delle particelle di microsfere) che richiedono una formazione approfondita per eseguire il test e interpretare i dati. Questo studio ha testato l'affidabilità, la riproducibilità e la sensibilità di Rheomuco, un dispositivo da banco di facile utilizzo progettato per eseguire misurazioni rapide utilizzando l'oscillazione dinamica con una sweep di taglio-deformazione per fornire moduli viscoelastici lineari (G', G", G * e δ di abbronzatura) e caratteristiche del punto gel (γc e σc) per campioni clinici entro 5 minuti. Le prestazioni del dispositivo sono state convalidate utilizzando diverse concentrazioni di un simulante di muco, 8 MDa ossido di polietilene (PEO) e rispetto alle tradizionali misurazioni di reologia di massa. Un isolato clinico prelevato da un paziente intubato con stato asmatico (SA) è stato quindi valutato in misurazioni triplicate e il coefficiente di variazione tra le misurazioni è <10%. L'uso ex vivo di un potente agente riducente del muco, TCEP, sul muco SA ha comportato una diminuzione di cinque volte del modulo elastico e un cambiamento verso un comportamento più "liquido" in generale (ad esempio, una maggiore δ di abbronzatura). Insieme, questi risultati dimostrano che il reometro da banco testato può effettuare misurazioni affidabili della viscoelasticità del muco in contesti clinici e di ricerca. In sintesi, il protocollo descritto potrebbe essere utilizzato per esplorare gli effetti dei farmaci mucoattivi (ad esempio, rhDNasi, N-acetil cisteina) in loco per adattare il trattamento caso per caso o in studi preclinici di nuovi composti.
Introduzione
Le malattie muco-ostruttive delle vie aeree, tra cui l'asma, la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), la fibrosi cistica (FC) e altre condizioni respiratorie, come la polmonite virale e batterica, sono preoccupazioni per la salute prevalenti in tutto il mondo. Mentre la fisiopatologia varia notevolmente tra ogni condizione, una caratteristica chiave comune è la clearance mucociliare anormale. Nei polmoni sani, il muco allinea l'epitelio delle vie aeree per intrappolare le particelle inalate e fornire una barriera fisica contro gli agenti patogeni. Una volta secreto, il muco delle vie aeree, composto da ~ 97,5% di acqua, 0,9% di sale, ~ 1,1% di proteine globular....
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Protocollo
Nel presente studio, i campioni sono stati raccolti durante una broncoscopia clinicamente indicata dopo aver ottenuto il consenso informato in base a un protocollo approvato dal Comitato di revisione istituzionale dell'UNC.
1. Raccolta e conservazione dell'espettorato/muco
- Raccogliere il muco delle vie aeree tramite la raccolta dell'espettorato o l'aspirazione per broncoscopia.
- Raccogliere l'espettorato tramite espettorazione spontanea o indurre l'espettorato per inalazione salina ipertonica al 3%. In alternativa, aspirare direttamente il muco dalle vie aeree durante una procedura di bron....
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Risultati
La Figura 1 mostra l'accuratezza e la ripetibilità delle misurazioni reologiche utilizzando curve dipendenti dalla concentrazione del controllo viscoelastico, cioè soluzione di ossido di polietilene (PEO) e stato asmatico (SA) muco. Le misurazioni delle caratteristiche viscoelastiche di 8 MDa PEO a cinque diverse concentrazioni (1%, 1,5%, 2%, 2,5% e 3%) sono state confrontate direttamente tra il reometro da banco valutato e un reometro sfuso tradizionale (Table of Materials).......
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Discussione
Le proprietà viscoelastiche uniche del muco sono essenziali per mantenere le vie aeree sane. Fattori interni ed esterni possono alterare le proprietà biofisiche del muco delle vie aeree, causando complicanze cliniche caratteristiche delle malattie muco-ostruttive. Pertanto, il monitoraggio dei cambiamenti nella viscoelasticità del muco potrebbe essere preso in considerazione durante le valutazioni dello stato della malattia e l'esplorazione di terapie che riducono la viscoelasticità del muco. Studi empirici degli anni 19.......
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Ringraziamenti
Questo documento è supportato da sovvenzioni di Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) e Research EHRE20XX0 supportato da CFF.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Punte dei pistoni capillari Gilson | CP1000 | ||
| Discovery Hybrid Rheometer-3 | TA Instruments | Reometro di massa DHR-3 prodotto da TA Instruments a New Castle, DE: utilizzato per eseguire test reologici. | |
| Software grafico | GraphPad Prism | GraphPad Software (San Diego, CA) utilizzato per l'analisi dei dati | |
| Tubo per microcentrifuga | Costar | 3621 | |
| Piastra di | Peltier TA Instruments Sistema | controllo della temperatura prodotto da TA Instruments a New Castle, DE | |
| Polimero di ossido di polietilene | Sigma | 372838 | 8 MDa utilizzato come simulante |
| di mucoPipetta a spostamento positivo | Gilson | M1000 | Pipetta utilizzata per la manipolazione di soluzioni viscose |
| Reometro da banco Rheomuco | Rheonova | prodotto da Rheonova in Francia: utilizzato per eseguire test reologici. | |
| Geometrie inferiori ruvide | Rheonova | D-1811-007 | Geometrie |
| superiori ruvide | Rheonova | U-1811-007 | di 25 mm di diametro |
| TA Instruments | |||
| Tris(2-carbossietil)fosfina | di diametro Sigma | 646547-10X1ML | TCEP: Potente agente riducente. |
Riferimenti
- Button, B., et al. A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia. Science. 337 (6097), 937-941 (2012).
- Boucher, R. C. Muco-obstructive lung diseases. New England Journal of Medicine. 380 ....
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Ristampe e permessi
