Mycobacterium tuberculosis Arricchimento delle vescicole extracellulari attraverso la cromatografia di esclusione dimensionale

Il rilascio di vescicole extracellulari (EV) da parte di agenti patogeni può essere la chiave per sbloccare nuove tecnologie per controllare le malattie infettive¹. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è un agente patogeno di alta conseguenza, che infetta circa un terzo della popolazione mondiale e reclama la vita di milioni di persone ogni anno². La produzione di VEICOLI ELETTRICI da parte di Mtb è ben documentata ma sfuggente nella biogenesi e nei vari ruoli (cioè immunostimolante, immunosoppressiva, ferro e acquisizione di nutrienti) di questi veicoli elettrici nel contesto dell'infezione ^3,4,5. Gli sforzi per comprendere la composizione dei veicoli elettrici Mtb hanno rivelato sfere chiuse con membrana lipidica a 50-150 nm derivate dalla membrana plasmatica contenenti lipidi e proteine di significato immunologico ^3,6. Lo studio del ruolo dei veicoli elettrici Mtb nella fisiologia batterica ha rivelato l'importanza della modulazione batterica ev in risposta allo stress ambientale per la sopravvivenza⁵. Gli studi di interazione ospite-patogeno sono stati più complicati da interpretare, ma le prove indicano che i veicoli elettrici Mtb possono influenzare la risposta immunitaria dell'ospite e possono potenzialmente servire come componente di vaccinazione efficace ^3,4,7.

La maggior parte degli studi sui veicoli elettrici Mtb finora si sono basati sull'ultracentrifugazione del gradiente di densità per l'arricchimento delle^{vescicole 8}. Questo è stato efficace per studi su piccola scala; tuttavia, questa tecnica presenta diverse sfide tecniche e logistiche. Flussi di lavoro alternativi accoppiano la centrifugazione multistep, per la rimozione di intere celle e detriti di grandi dimensioni, con una fase finale di ultracentrifugazione ai veicoli elettrici a pellet. Questa metodologia può variare in termini di efficienza e spesso si traduce in una bassa resa e co-purificazione di biomolecole solubili non associate alle vescicole, influenzando anche l'integrità delle^{vescicole 9}. Inoltre, questo processo richiede molto tempo, richiede un uso manuale e un throughput molto limitato a causa dei vincoli delle apparecchiature.

Il presente protocollo descrive una tecnica alternativa all'ultracentrifugazione a gradiente di densità: la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC). Questo metodo è stato dimostrato per i micobatteri ambientali e nel lavoro attuale è stato estrapolato a Mtb¹⁰. Una colonna disponibile in commercio e un collettore automatico di frazioni possono migliorare la coerenza nella preparazione vescicale e ridurre la necessità di attrezzature specifiche e costose. È anche possibile completare questo protocollo in una frazione del tempo rispetto all'ultracentrifugazione del gradiente di densità, aumentando la produttività. Questa tecnica è meno impegnativa dal punto di vista tecnico, rendendola più facile da padroneggiare e può aumentare la riproducibilità inter/intra-laboratorio. Infine, SEC ha un'elevata efficienza di separazione ed è delicato, preservando l'integrità delle vescicole.

Il Comitato istituzionale per la biosicurezza della Colorado State University ha approvato il presente studio (19-046B). La coltivazione del Mycobacterium tuberculosis e la raccolta di supernatanti di coltura ricchi di EV sono state eseguite da personale addestrato in un laboratorio ad alto contenimento. I materiali sono stati spostati fuori dall'area ad alto contenimento dopo che è stato eseguito, confermato e approvato dalle politiche di biosicurezza istituzionali un valido metodo di inattivazione. Durante la replica del protocollo, se l'inattivazione convalidata o il metodo di filtrazione sterile non sono fattibili, le seguenti procedure devono essere eseguite in un laboratorio ad alto contenimento.

1. Preparazione del concentrato grezzo di Mtb EV

NOTA: Per le procedure dettagliate sulla coltivazione di Mtb e la preparazione di proteine filtrate di coltura (CFP), vedere Riferimenti^11,12. Si raccomanda che i terreni di coltura batterica siano esenti da integratori di crescita con componenti contenenti EV o proteinacei, come l'albumina oleica destrosi catalasi (OADC) e detergenti come Tween. Si raccomanda inoltre che la qualità della coltura batterica e la CFP raccolta siano sottoposte a screening per garantire una morte cellulare limitata e la lisi^13,14.

1. Preparare un filtro centrifugo da 100 kDa a peso molecolare (MWCO) (vedere Tabella dei materiali) aggiungendo l'intera capacità volumetrica della soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS). Centrifugare per 5 min a 2.800 x g a 4 °C.
   NOTA: se si utilizza un filtro senza volume dead stop, è necessario prestare attenzione per garantire che il volume del campione non si riduca al di sotto del livello del filtro, con conseguente completa asciugatura del filtro durante la centrifugazione.
2. Scartare il flusso passante e l'eventuale PBS rimanente prima di riempire la camera del campione con Mtb CFP alla sua massima capacità. Centrifugare a 2.800 x g a 4 °C fino a quando il volume non si è ridotto al volume minimo del dispositivo di ultrafiltrazione. Ripetere se necessario, aggiungendo più CFP all'unità fino a quando l'intero campione non è stato sufficientemente ridotto.
   NOTA: Conservare una parte del materiale a flusso continuo (100F) da 100 kDa per la qualificazione a valle, se lo si desidera. Conservare a 4 °C.
3. Aggiungere 1x PBS all'unità filtrante contenente il concentrato fino alla capacità totale del dispositivo. Ridurre il volume come descritto al punto 1.2. Ripetere questo passaggio cinque volte per garantire il lavaggio completo e lo scambio del tampone.
4. Recuperare il retentato CFP concentrato da 100 kDa (100R) secondo le specifiche del dispositivo di ultrafiltrazione (vedi Tabella dei materiali). Una volta recuperato il 100R, lavare il filtro con un volume minimo di 1x PBS almeno tre volte e raggruppare il lavaggio con il 100R per massimizzare il recupero.
5. Quantificare il materiale 100R con un saggio bicinchoninico (BCA) seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Per eseguire il test, utilizzare diverse diluizioni di campioni 1:2, 1:5 e 1:10 in PBS. Testare il campione in triplice copia.
   NOTA: conservare una parte del materiale 100R per la qualificazione a valle, se lo si desidera. Conservare a 4 °C.

2. Cromatografia di esclusione dimensionale per l'arricchimento di MTB EV da CFP

NOTA: La seguente procedura è specifica per l'utilizzo di 3 mg di 100R Mtb CFP con colonna SEC e collettore automatico di frazioni (AFC, vedi Tabella dei materiali). Può essere adattato per altre concentrazioni di partenza e tipi di colonne seguendo le specifiche del produttore. Inoltre, si consiglia agli utenti di leggere e comprendere il manuale utente del raccoglitore automatico di frazioni.

1. Consentire alla colonna SEC di equilibrarsi a temperatura ambiente.
2. Accendere l'AFC utilizzando l'interruttore di alimentazione sul retro dell'unità tower e regolare le impostazioni per la cella di carico, se necessario, premendo SETUP sul touchscreen del menu principale. La cella di carico deve essere calibrata solo al primo utilizzo, dopo ogni aggiornamento del software e se si nota un'incoerenza nei volumi di raccolta delle frazioni.
3. Dalla schermata SETUP , allineare il carosello selezionando CAROSELLO > CALIBRA. Inserire la giostra con i 13 piccoli fori rivolti verso l'alto nella torre AFC e regolare la giostra in modo che l'ugello del fluido sia direttamente sopra la posizione di scarico premendo i pulsanti - e/ o + .
4. Rimuovere i tappi dalla colonna SEC bilanciata. Far scorrere la colonna SEC nel supporto a colonna appropriato e installarla con attenzione sulla torre AFC. Assicurarsi che il tag di identificazione a radiofrequenza (RFID) sulla colonna sia rivolto verso l'AFC e verificare che la connessione tra la colonna e la valvola sia sicura. Posizionare il tubo di uscita dei rifiuti in un contenitore di raccolta.
5. Dalla schermata SETUP , selezionare Collection Schedule e impostare il conteggio su 13 e la dimensione su 0,5 mL premendo i pulsanti - e/o + . Lasciare l'impostazione "Volume buffer" come valore predefinito di 2,7 ml, quindi chiudere la finestra "Pianificazione raccolta" premendo X.
6. Selezionare START COLLECTION dalla schermata iniziale e confermare i parametri di raccolta selezionando YES. Caricare 13 tubi microcentrifuga etichettati da 1,7 mL con i coperchi aperti e rivolti verso il centro della giostra.
7. Avanzate l'AFC selezionando OK, quindi montate il serbatoio della colonna e avanzate di nuovo premendo OK. Selezionare l'opzione per svuotare la colonna premendo YES e aggiungere un volume di colonna di PBS filtrato da 0,2 μm per rimuovere qualsiasi buffer di archiviazione. Una volta completato il lavaggio, far avanzare l'AFC premendo OK.
8. Posizionare il coperchio della giostra sull'AFC e premere OK. Preparare un volume di colonna di PBS filtrato da 0,2 μm. Utilizzare una pipetta per rimuovere il buffer in eccesso dalla colonna.
9. Portare 3 mg di campione 100R come quantificato nei passaggi da 1,5 a 500 μL con 1x PBS. Aggiungere il campione da 3 mg nella parte superiore della colonna. Fate avanzare l'AFC e lasciate che il campione si imbatta nella fritta. Una volta che il campione è entrato completamente nella colonna, aggiungere il PBS preparato nel passaggio 2.6 al serbatoio.
10. Monitorare l'esecuzione dell'AFC mentre raccoglie prima il volume del vuoto e poi le frazioni specificate. Dopo che la corsa è stata completata e la giostra ritorna in posizione di scarico, rimuovere il coperchio e rimuovere i tubi di frazione dalla giostra. Conservare le frazioni a 4 °C prima della quantificazione (fase 3) e della qualifica (fase 4).
11. Se la colonna deve essere riutilizzata, selezionare l'opzione per pulire la colonna premendo SÌ; in caso contrario, premere NO. Seguire le istruzioni sull'AFC.
    NOTA: una volta che la colonna è stata lavata e il buffer di stoccaggio è stato attraversato, può essere rimosso, tappato e conservato a 4 °C.

3. Quantificazione dei veicoli elettrici Mtb

1. Misurare la concentrazione proteica per ogni frazione utilizzando BCA e micro BCA¹².
   1. Per frazioni da 0,5 mL raccolte da 3 mg di 100R Mtb CFP, utilizzare il micro BCA con diluizione 1:3 per frazioni numerate 1-7 di ciascun campione in triplice copia.
   2. Per frazioni di 0,5 ml numerate 5-13, utilizzare il BCA senza diluizione per ciascun campione in triplice copia.
      NOTA: la sovrapposizione dei saggi per le frazioni 5-7 contribuirà a garantire che tutte le frazioni abbiano un output leggibile.
2. Quantitare la concentrazione di particelle per ogni frazione utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA).
   1. Diluire i campioni in 1 mL di 1x PBS utilizzando i seguenti rapporti di partenza suggeriti; per le frazioni 1-3, utilizzare 1:100, quindi per le frazioni rimanenti, utilizzare una diluizione 1:10.
   2. Vorticolare le soluzioni diluite e quindi prelevare il campione in una siringa monouso da 1 mL. Impostare la siringa in una pompa automatica a siringa, se disponibile.
   3. Impostare la pompa della siringa su 30 μL/min e utilizzare le impostazioni di acquisizione video con un guadagno dello schermo di 10-12 e un livello della fotocamera di 10-12. Regolare la messa a fuoco per ogni campione.
   4. Raccogli un minimo di tre video a 30 s ciascuno utilizzando un flusso costante.
   5. Eseguire l'analisi con la soglia di rilevamento del software impostata su cinque.
      NOTA: potrebbe non essere possibile ottenere dati NTA per le frazioni più recenti (>7) senza sacrificare un volume significativo del campione.

4. Qualificazione dei veicoli elettrici Mtb

1. Visualizza il profilo proteico generale di ogni frazione utilizzando un gel proteico macchiato d'argento.
   NOTA: Le procedure dettagliate per SDS-PAGE e la macchia d'argento sono disponibili nel riferimento¹⁵.
   1. Aggiungere il buffer del campione SDS a 10 μL di ciascuna frazione e 5 μg di CFP, 100R e 100F. Far bollire per 5 minuti a 100 °C, quindi caricare su un gel Bis-Tris al 4%-12% con una scala a peso molecolare per l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) (vedi Tabella dei materiali).
   2. Eseguire il gel utilizzando 1x 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid (MES) running buffer (vedi Tabella dei materiali) e una corrente di 200 V per 35 min.
   3. Rimuovere il gel dalla cassetta e procedere con la colorazione dell'argento¹⁵.
2. Valutare la presenza o l'assenza di marcatori EV in ogni frazione per Western blot.
   NOTA: le procedure dettagliate per il Western blotting sono disponibili nel riferimento¹⁵.
   1. Eseguire un gel SDS-PAGE come descritto nei passaggi 4.1.1-4.1.2.
   2. Rimuovere il gel dalla cassetta e trasferire le proteine risolte su una membrana di nitrocellulosa da 0,2 μm (vedere Tabella dei materiali) applicando una corrente di 50 V per un minimo di 1 ora.
   3. Eseguire analisi Western blot per valutare le proteine di interesse. Si raccomandano anticorpi primari contro LpqH, lipoarabinomannan (LAM) e GroES (vedere Tabella dei materiali).
   4. Frazioni del pool basate sulla presenza o l'assenza di marcatori come applicabile per l'applicazione a valle.
3. Confermare la presenza di vescicole intatte mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
   1. Fissare 15 μL del campione di vescicola aggiungendo 15 μL di paraformaldeide di grado EM al 4% e conservare a 4 °C durante la notte.
   2. Preparare una griglia TEM in rame rivestito in carbonio a 200 maglie pulendo la superficie e creando un substrato idrofilo.
      NOTA: si consiglia la pulizia al plasma con il 95% di argon, il 5% di ossigeno e il 30% di potenza al plasma per 1 minuto.
   3. Rilasciare 10 μL del campione fisso sulla griglia e lasciare che il campione aderisca per 10 minuti, quindi asciugare il liquido in eccesso con carta da filtro.
   4. Far galleggiare la griglia su una goccia di acqua ultrapura per 30 s, quindi eliminare il liquido in eccesso.
   5. Far galleggiare la griglia su una goccia di acetato di uranile di grado EM d% per 2 minuti, quindi eliminare il liquido in eccesso.
   6. Lasciare asciugare completamente la griglia all'aria.
   7. Immagine utilizzando un TEM (vedi Tabella dei materiali) a 100 kV o simile.
      NOTA: altri metodi di quantificazione e caratterizzazione dei veicoli elettrici devono essere utilizzati in base alle applicazioni a valle. Le informazioni minime per gli studi sulle vescicole extracellulari¹⁸ devono essere consultate per le linee guida per garantire il rigore e la riproducibilità di tutti gli studi EV.

La proteina filtrata di coltura (CFP) da Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è stata concentrata, quantificata e quindi 3 mg di materiale sono stati applicati a una colonna di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). Le concentrazioni di proteine e particelle sono state enumerate rispettivamente da BCA e NTA. Gli intervalli previsti per il recupero di proteine e particelle più i valori esatti ottenuti per questi risultati sono riportati nella Tabella 1. Valori molto più alti di questi intervalli possono indicare problemi di contaminazione o integrità della colonna. Valori significativamente più bassi indicano problemi nelle fasi di ultrafiltrazione, e quindi il flusso deve essere confrontato con la CFP iniziale e 100R per determinare se si è verificata una concentrazione riuscita. Una macchia d'argento proteica non specifica mostra che le frazioni successive contengono più proteine e assomigliano al materiale 100R (Figura 1).

Le macchie occidentali delle frazioni dimostrano che il lipoarabinomannano (LAM) è presente in tutte le frazioni, con frazioni successive che mostrano bande di intensità inferiore (Figura 2A, Figura supplementare 1). La lipoproteina 19 kDa LpqH, nota per essere presente in Mtb EV 3,19, è arricchita nelle prime frazioni della SEC (Figura 2B, Figura supplementare 1). La proteina 10 kDa chaperonina GroES è assente nelle prime frazioni della SEC (Figura 2C, Figura supplementare 1); questa scoperta si allinea con gli studi precedentemente pubblicati riguardanti GroES come contaminante durante l'arricchimento mtb EV12 e funge da controllo negativo per la presenza di Mtb EV. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) conferma la presenza di vescicole chiuse legate alla membrana (Figura 3A). Un confronto tra i veicoli elettrici Mtb separati dall'ultrafiltrazione del gradiente di densità e questo metodo SEC è riportato nella Tabella 2. SEC fornisce un maggiore recupero di proteine e particelle per tre repliche tecniche dalla stessa CFP. Questi risultati sono stati coerenti tra più lotti di CFP (dati non mostrati). Entrambi i metodi si traducono in vescicole chiuse legate alla membrana nell'intervallo di dimensioni previsto, come dimostrato da TEM (Figura 3) e NTA (Figura 4).

Complessivamente, questi dati dimostrano l'arricchimento dei veicoli elettrici Mtb nelle prime frazioni SEC. I valori di NTA più alti si verificano nelle frazioni 1-3 e il contenuto proteico aumenta all'aumentare del numero di frazioni, indicando la separazione delle proteine solubili dagli EV (Tabella 1). Poiché la frazione 4 contiene prove di GroES (Figura 2C, Figura supplementare 1), questa frazione non è stata inclusa nel materiale aggregato per TEM. A seconda dell'applicazione a valle, deve essere presa in considerazione l'inclusione o l'esclusione di frazioni specifiche per la strategia di pooling.

Figura 1: Macchia d'argento per frazione. Un gel SDS-PAGE colorato con argento dimostra il profilo proteico complessivo per ogni frazione. CFP = 5 μg di Mtb CFP, 100R = 5 μg di 100R, 100F = 5 μg di 100F, 1-11 = 10 μL di frazioni SEC 1-11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Western blots per frazione. Western blots che rilevano (A) LAM, (B) LpqH e (C) GroES, dimostrando i cambiamenti dei marcatori proteici attraverso le frazioni. CFP = 5 μg di Mtb CFP, 100R = 5 μg di 100R, 100F = 5 μg di 100F, 1-11 = 10 μL di frazioni SEC 1-11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini TEM (Transmission Electron Microscopy). (A) Frazioni SEC 1-3 raggruppate prima della fissazione. (B) L'ultracentrifugazione del gradiente di densità dei veicoli elettrici Mtb è stata macchiata negativamente per l'imaging TEM. Barre della scala = 200 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Distribuzione dell'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). (A) Frazioni SEC 1-3. (B) L'ultracentrifugazione del gradiente di densità Mtb EV è stata analizzata con l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle. Viene visualizzata la distribuzione delle dimensioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Recupero di proteine e particelle per frazione. Intervallo di recupero di proteine e particelle previsto per frazione basato su 3 mg di materiale di partenza. I valori esatti per ottenere il materiale utilizzato in questo studio sono inclusi nelle due colonne più a destra.

Tabella 2: Metodo di confronto del recupero di proteine e particelle. Resa proteica misurata con BCA e conta totale delle particelle misurata da NTA per EV Mtb originati da 3 mg dello stesso materiale di partenza 100R, arricchito utilizzando il metodo di ultracentrifugazione del gradiente di densità di riferimento8 o questo metodo SEC (triplicato).

Figura 1 supplementare: Macchie occidentali originali (non ritagliate) dalla Figura 2. Fare clic qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.