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Articolo metodologico

Mycobacterium tuberculosis Arricchimento delle vescicole extracellulari attraverso la cromatografia di esclusione dimensionale

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DOI:

10.3791/63895

⸱

19 maggio 2022

 ,  , 
1Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology Immunology & Pathology, Colorado State University, 2BioMARC, Infectious Disease Research Center, Colorado State University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la cromatografia di esclusione dimensionale, una tecnica facile e riproducibile per arricchire le vescicole extracellulari del Mycobacterium tuberculosis dai supernatanti di coltura.

Abstract

Il ruolo delle vescicole extracellulari (EV) nel contesto dell'infezione batterica è emerso come una nuova strada per comprendere la fisiologia microbica. In particolare, i veicoli elettrici Mycobacterium tuberculosis (Mtb) svolgono un ruolo nell'interazione ospite-patogeno e nella risposta allo stress ambientale. I veicoli elettrici Mtb sono anche altamente antigenici e mostrano un potenziale come componenti del vaccino. Il metodo più comune per purificare i veicoli elettrici Mtb è l'ultracentrifugazione del gradiente di densità. Questo processo presenta diverse limitazioni, tra cui bassa produttività, bassa resa, dipendenza da attrezzature costose, sfide tecniche e può avere un impatto negativo sulla preparazione risultante. La cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) è un metodo alternativo più delicato che combatte molte delle limitazioni dell'ultracentrifugazione. Questo protocollo dimostra che SEC è efficace per l'arricchimento Mtb EV e produce preparazioni Mtb EV di alta qualità di maggiore resa in modo rapido e scalabile. Inoltre, un confronto con l'ultracentrifugazione del gradiente di densità mediante procedure di quantificazione e qualificazione dimostra i vantaggi della SEC. Mentre la valutazione della quantità ev (analisi del tracciamento delle nanoparticelle), del fenotipo (microscopia elettronica a trasmissione) e del contenuto (Western blotting) è adattata ai veicoli elettrici Mtb, il flusso di lavoro fornito può essere applicato ad altri micobatteri.

Introduzione

Il rilascio di vescicole extracellulari (EV) da parte di agenti patogeni può essere la chiave per sbloccare nuove tecnologie per controllare le malattie infettive1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è un agente patogeno di alta conseguenza, che infetta circa un terzo della popolazione mondiale e reclama la vita di milioni di persone ogni anno2. La produzione di VEICOLI ELETTRICI da parte di Mtb è ben documentata ma sfuggente nella biogenesi e nei vari ruoli (cioè immunostimolante, immunosoppressiva, ferro e acquisizione di nutrienti) di questi veicoli elettrici nel contesto dell'infezione 3,4,5. Gli sforzi per comprendere la composizione dei veicoli elettrici Mtb hanno rivelato sfere chiuse con membrana lipidica a 50-150 nm derivate dalla membrana plasmatica contenenti lipidi e proteine di significato immunologico 3,6. Lo studio del ruolo dei veicoli elettrici Mtb nella fisiologia batterica ha rivelato l'importanza della modulazione batterica ev in risposta allo stress ambientale per la sopravvivenza5. Gli studi di interazione ospite-patogeno sono stati più complicati da interpretare, ma le prove indicano che i veicoli elettrici Mtb possono influenzare la risposta immunitaria dell'ospite e possono potenzialmente servire come componente di vaccinazione efficace 3,4,7.

La maggior parte degli studi sui veicoli elettrici Mtb finora si sono basati sull'ultracentrifugazione del gradiente di densità per l'arricchimento dellevescicole 8. Questo è stato efficace per studi su piccola scala; tuttavia, questa tecnica presenta diverse sfide tecniche e logistiche. Flussi di lavoro alternativi accoppiano la centrifugazione multistep, per la rimozione di intere celle e detriti di grandi dimensioni, con una fase finale di ultracentrifugazione ai veicoli elettrici a pellet. Questa metodologia può variare in termini di efficienza e spesso si traduce in una bassa resa e co-purificazione di biomolecole solubili non associate alle vescicole, influenzando anche l'integrità dellevescicole 9. Inoltre, questo processo richiede molto tempo, richiede un uso manuale e un throughput molto limitato a causa dei vincoli delle apparecchiature.

Il presente protocollo descrive una tecnica alternativa all'ultracentrifugazione a gradiente di densità: la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC). Questo metodo è stato dimostrato per i micobatteri ambientali e nel lavoro attuale è stato estrapolato a Mtb10. Una colonna disponibile in commercio e un collettore automatico di frazioni possono migliorare la coerenza nella preparazione vescicale e ridurre la necessità di attrezzature specifiche e costose. È anche possibile completare questo protocollo in una frazione del tempo rispetto all'ultracentrifugazione del gradiente di densità, aumentando la produttività. Questa tecnica è meno impegnativa dal punto di vista tecnico, rendendola più facile da padroneggiare e può aumentare la riproducibilità inter/intra-laboratorio. Infine, SEC ha un'elevata efficienza di separazione ed è delicato, preservando l'integrità delle vescicole.

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Protocollo

Il Comitato istituzionale per la biosicurezza della Colorado State University ha approvato il presente studio (19-046B). La coltivazione del Mycobacterium tuberculosis e la raccolta di supernatanti di coltura ricchi di EV sono state eseguite da personale addestrato in un laboratorio ad alto contenimento. I materiali sono stati spostati fuori dall'area ad alto contenimento dopo che è stato eseguito, confermato e approvato dalle politiche di biosicurezza istituzionali un valido metodo di inattivazione. Durante la replica del protocollo, se l'inattivazione convalidata o il metodo di filtrazione sterile non sono fattibili, le seguenti procedure devono essere eseguite in un laboratorio ad alto contenimento.

1. Preparazione del concentrato grezzo di Mtb EV

NOTA: Per le procedure dettagliate sulla coltivazione di Mtb e la preparazione di proteine filtrate di coltura (CFP), vedere Riferimenti11,12. Si raccomanda che i terreni di coltura batterica siano esenti da integratori di crescita con componenti contenenti EV o proteinacei, come l'albumina oleica destrosi catalasi (OADC) e detergenti come Tween. Si raccomanda inoltre che la qualità della coltura batterica e la CFP raccolta siano sottoposte a screening per garantire una morte cellulare limitata e la lisi13,14.

  1. Preparare un filtro centrifugo da 100 kDa a peso molecolare (MWCO) (vedere Tabella dei materiali) aggiungendo l'intera capacità volumetrica della soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS). Centrifugare per 5 min a 2.800 x g a 4 °C.
    NOTA: se si utilizza un filtro senza volume dead stop, è necessario prestare attenzione per garantire che il volume del campione non si riduca al di sotto del livello del filtro, con conseguente completa asciugatura del filtro durante la centrifugazione.
  2. Scartare il flusso passante e l'eventuale PBS rimanente prima di riempire la camera del campione con Mtb CFP alla sua massima capacità. Centrifugare a 2.800 x g a 4 °C fino a quando il volume non si è ridotto al volume minimo del dispositivo di ultrafiltrazione. Ripetere se necessario, aggiungendo più CFP all'unità fino a quando l'intero campione non è stato sufficientemente ridotto.
    NOTA: Conservare una parte del materiale a flusso continuo (100F) da 100 kDa per la qualificazione a valle, se lo si desidera. Conservare a 4 °C.
  3. Aggiungere 1x PBS all'unità filtrante contenente il concentrato fino alla capacità totale del dispositivo. Ridurre il volume come descritto al punto 1.2. Ripetere questo passaggio cinque volte per garantire il lavaggio completo e lo scambio del tampone.
  4. Recuperare il retentato CFP concentrato da 100 kDa (100R) secondo le specifiche del dispositivo di ultrafiltrazione (vedi Tabella dei materiali). Una volta recuperato il 100R, lavare il filtro con un volume minimo di 1x PBS almeno tre volte e raggruppare il lavaggio con il 100R per massimizzare il recupero.
  5. Quantificare il materiale 100R con un saggio bicinchoninico (BCA) seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Per eseguire il test, utilizzare diverse diluizioni di campioni 1:2, 1:5 e 1:10 in PBS. Testare il campione in triplice copia.
    NOTA: conservare una parte del materiale 100R per la qualificazione a valle, se lo si desidera. Conservare a 4 °C.

2. Cromatografia di esclusione dimensionale per l'arricchimento di MTB EV da CFP

NOTA: La seguente procedura è specifica per l'utilizzo di 3 mg di 100R Mtb CFP con colonna SEC e collettore automatico di frazioni (AFC, vedi Tabella dei materiali). Può essere adattato per altre concentrazioni di partenza e tipi di colonne seguendo le specifiche del produttore. Inoltre, si consiglia agli utenti di leggere e comprendere il manuale utente del raccoglitore automatico di frazioni.

  1. Consentire alla colonna SEC di equilibrarsi a temperatura ambiente.
  2. Accendere l'AFC utilizzando l'interruttore di alimentazione sul retro dell'unità tower e regolare le impostazioni per la cella di carico, se necessario, premendo SETUP sul touchscreen del menu principale. La cella di carico deve essere calibrata solo al primo utilizzo, dopo ogni aggiornamento del software e se si nota un'incoerenza nei volumi di raccolta delle frazioni.
  3. Dalla schermata SETUP , allineare il carosello selezionando CAROSELLO > CALIBRA. Inserire la giostra con i 13 piccoli fori rivolti verso l'alto nella torre AFC e regolare la giostra in modo che l'ugello del fluido sia direttamente sopra la posizione di scarico premendo i pulsanti - e/ o + .
  4. Rimuovere i tappi dalla colonna SEC bilanciata. Far scorrere la colonna SEC nel supporto a colonna appropriato e installarla con attenzione sulla torre AFC. Assicurarsi che il tag di identificazione a radiofrequenza (RFID) sulla colonna sia rivolto verso l'AFC e verificare che la connessione tra la colonna e la valvola sia sicura. Posizionare il tubo di uscita dei rifiuti in un contenitore di raccolta.
  5. Dalla schermata SETUP , selezionare Collection Schedule e impostare il conteggio su 13 e la dimensione su 0,5 mL premendo i pulsanti - e/o + . Lasciare l'impostazione "Volume buffer" come valore predefinito di 2,7 ml, quindi chiudere la finestra "Pianificazione raccolta" premendo X.
  6. Selezionare START COLLECTION dalla schermata iniziale e confermare i parametri di raccolta selezionando YES. Caricare 13 tubi microcentrifuga etichettati da 1,7 mL con i coperchi aperti e rivolti verso il centro della giostra.
  7. Avanzate l'AFC selezionando OK, quindi montate il serbatoio della colonna e avanzate di nuovo premendo OK. Selezionare l'opzione per svuotare la colonna premendo YES e aggiungere un volume di colonna di PBS filtrato da 0,2 μm per rimuovere qualsiasi buffer di archiviazione. Una volta completato il lavaggio, far avanzare l'AFC premendo OK.
  8. Posizionare il coperchio della giostra sull'AFC e premere OK. Preparare un volume di colonna di PBS filtrato da 0,2 μm. Utilizzare una pipetta per rimuovere il buffer in eccesso dalla colonna.
  9. Portare 3 mg di campione 100R come quantificato nei passaggi da 1,5 a 500 μL con 1x PBS. Aggiungere il campione da 3 mg nella parte superiore della colonna. Fate avanzare l'AFC e lasciate che il campione si imbatta nella fritta. Una volta che il campione è entrato completamente nella colonna, aggiungere il PBS preparato nel passaggio 2.6 al serbatoio.
  10. Monitorare l'esecuzione dell'AFC mentre raccoglie prima il volume del vuoto e poi le frazioni specificate. Dopo che la corsa è stata completata e la giostra ritorna in posizione di scarico, rimuovere il coperchio e rimuovere i tubi di frazione dalla giostra. Conservare le frazioni a 4 °C prima della quantificazione (fase 3) e della qualifica (fase 4).
  11. Se la colonna deve essere riutilizzata, selezionare l'opzione per pulire la colonna premendo SÌ; in caso contrario, premere NO. Seguire le istruzioni sull'AFC.
    NOTA: una volta che la colonna è stata lavata e il buffer di stoccaggio è stato attraversato, può essere rimosso, tappato e conservato a 4 °C.

3. Quantificazione dei veicoli elettrici Mtb

  1. Misurare la concentrazione proteica per ogni frazione utilizzando BCA e micro BCA12.
    1. Per frazioni da 0,5 mL raccolte da 3 mg di 100R Mtb CFP, utilizzare il micro BCA con diluizione 1:3 per frazioni numerate 1-7 di ciascun campione in triplice copia.
    2. Per frazioni di 0,5 ml numerate 5-13, utilizzare il BCA senza diluizione per ciascun campione in triplice copia.
      NOTA: la sovrapposizione dei saggi per le frazioni 5-7 contribuirà a garantire che tutte le frazioni abbiano un output leggibile.
  2. Quantitare la concentrazione di particelle per ogni frazione utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA).
    1. Diluire i campioni in 1 mL di 1x PBS utilizzando i seguenti rapporti di partenza suggeriti; per le frazioni 1-3, utilizzare 1:100, quindi per le frazioni rimanenti, utilizzare una diluizione 1:10.
    2. Vorticolare le soluzioni diluite e quindi prelevare il campione in una siringa monouso da 1 mL. Impostare la siringa in una pompa automatica a siringa, se disponibile.
    3. Impostare la pompa della siringa su 30 μL/min e utilizzare le impostazioni di acquisizione video con un guadagno dello schermo di 10-12 e un livello della fotocamera di 10-12. Regolare la messa a fuoco per ogni campione.
    4. Raccogli un minimo di tre video a 30 s ciascuno utilizzando un flusso costante.
    5. Eseguire l'analisi con la soglia di rilevamento del software impostata su cinque.
      NOTA: potrebbe non essere possibile ottenere dati NTA per le frazioni più recenti (>7) senza sacrificare un volume significativo del campione.

4. Qualificazione dei veicoli elettrici Mtb

  1. Visualizza il profilo proteico generale di ogni frazione utilizzando un gel proteico macchiato d'argento.
    NOTA: Le procedure dettagliate per SDS-PAGE e la macchia d'argento sono disponibili nel riferimento15.
    1. Aggiungere il buffer del campione SDS a 10 μL di ciascuna frazione e 5 μg di CFP, 100R e 100F. Far bollire per 5 minuti a 100 °C, quindi caricare su un gel Bis-Tris al 4%-12% con una scala a peso molecolare per l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) (vedi Tabella dei materiali).
    2. Eseguire il gel utilizzando 1x 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid (MES) running buffer (vedi Tabella dei materiali) e una corrente di 200 V per 35 min.
    3. Rimuovere il gel dalla cassetta e procedere con la colorazione dell'argento15.
  2. Valutare la presenza o l'assenza di marcatori EV in ogni frazione per Western blot.
    NOTA: le procedure dettagliate per il Western blotting sono disponibili nel riferimento15.
    1. Eseguire un gel SDS-PAGE come descritto nei passaggi 4.1.1-4.1.2.
    2. Rimuovere il gel dalla cassetta e trasferire le proteine risolte su una membrana di nitrocellulosa da 0,2 μm (vedere Tabella dei materiali) applicando una corrente di 50 V per un minimo di 1 ora.
    3. Eseguire analisi Western blot per valutare le proteine di interesse. Si raccomandano anticorpi primari contro LpqH, lipoarabinomannan (LAM) e GroES (vedere Tabella dei materiali).
    4. Frazioni del pool basate sulla presenza o l'assenza di marcatori come applicabile per l'applicazione a valle.
  3. Confermare la presenza di vescicole intatte mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
    1. Fissare 15 μL del campione di vescicola aggiungendo 15 μL di paraformaldeide di grado EM al 4% e conservare a 4 °C durante la notte.
    2. Preparare una griglia TEM in rame rivestito in carbonio a 200 maglie pulendo la superficie e creando un substrato idrofilo.
      NOTA: si consiglia la pulizia al plasma con il 95% di argon, il 5% di ossigeno e il 30% di potenza al plasma per 1 minuto.
    3. Rilasciare 10 μL del campione fisso sulla griglia e lasciare che il campione aderisca per 10 minuti, quindi asciugare il liquido in eccesso con carta da filtro.
    4. Far galleggiare la griglia su una goccia di acqua ultrapura per 30 s, quindi eliminare il liquido in eccesso.
    5. Far galleggiare la griglia su una goccia di acetato di uranile di grado EM d% per 2 minuti, quindi eliminare il liquido in eccesso.
    6. Lasciare asciugare completamente la griglia all'aria.
    7. Immagine utilizzando un TEM (vedi Tabella dei materiali) a 100 kV o simile.
      NOTA: altri metodi di quantificazione e caratterizzazione dei veicoli elettrici devono essere utilizzati in base alle applicazioni a valle. Le informazioni minime per gli studi sulle vescicole extracellulari18 devono essere consultate per le linee guida per garantire il rigore e la riproducibilità di tutti gli studi EV.

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Risultati

La proteina filtrata di coltura (CFP) da Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è stata concentrata, quantificata e quindi 3 mg di materiale sono stati applicati a una colonna di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). Le concentrazioni di proteine e particelle sono state enumerate rispettivamente da BCA e NTA. Gli intervalli previsti per il recupero di proteine e particelle più i valori esatti ottenuti per questi risultati sono riportati nella Tabella 1. Valori molto più alti di questi interv...

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Discussione

Le vescicole extracellulari di Mycobacterium tuberculosis sono serbatoi altamente antigenici, che li presentano come una strada attraente per lo sviluppo di strumenti diagnostici e futuri vaccini 4,19,20. Storicamente, l'ultracentrifugazione del gradiente di densità è stata utilizzata per separare i veicoli elettrici Mtb da altri materiali solubili e secreti8. Sebbene questo processo sia efficace...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo riconoscere il sostegno del College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award e del College Research Council Shared Research Program a NKG e il finanziamento da parte di ATCC (premio # 2016-0550-0002) a KMD. Vorremmo anche ringraziare Anne Simpson per il supporto tecnico e BEI Resources, NIAID, NIH per i seguenti reagenti: Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (prodotto in vitro), NR-13792, Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (prodotto in vitro), NR-49223 e Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (prodotto in vitro), NR-13811.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
20x MES SDS Running BufferThermoFisher ScientificNP0002
Piastra a 96 pozzettiCorning15705-066
Collettore automatico di frazioniIZON ScienceAFC-V1-USD
BenchMark CentrifugaInvitrogen10748010
Beckman CoulterAllegra 6R
Centricon Plus - 70 Filtro centrifugo, cutoff 100 kDaMillipore SigmaUFC710008Dispositivo di ultrafiltrazione utilizzato nella fase 1.1
Sistema di elettroblottingThermoFisher Scientific09-528-135
Microscopia elettronica con paraformaldeide di grado EMScienze15714-S
Formvar/Carbon 200 mesh Cu GriglieMicroscopia elettronica ScienzeFCF200H-Cu-TA
Capra Anti-Topo IgG H& L (fosfatasi alcalina), molecola intera, 1 mLAbCamab6790Anticorpo secondario
JEM-1400 Microscopio elettronico a trasmissioneJOEL
Kit per il dosaggio delle proteine Micro BCAThermoFisher Scientific23235
Lettore di micropiastreBIOTEKEpoch
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (gene Rv3814c)BEI ResourcesNR-49223Anticorpo primario
Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)BEI ResourcesNR-13792Anticorpo
primario Monocolonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35BEI ResourcesNR-13811Anticorpo primario
NanoClean 1070Fischione InstrumentsPer la pulizia al plasma della griglia TEM
Nanosight dotato di pompa a siringa e computer con software NanoSight NTAMalvern PanalyticalNS300
Membrana in nitrocellulosa, Roll, 0.2 μ mBioRad1620112
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsThermoFisher ScientificNP0323BOX
Soluzione salina tamponata con fosfato, 1X senza calcio e magnesioCorning21-040-CV
dosaggio delle proteine BCA PierceThermoFisher Scientific23225
PowerPac Alimentatore di baseBioRad1645050
qEV Originale 35 nm 5/pkIZON ScienceSP5-USDColonna SEC
Tampone campione SDSBosterAR1112Ricetta interna utilizzata in questa procedura, tuttavia questo prodotto è equivalente
Camera gel SDS-PAGEThermoFisher ScientificEI0001
Sigmafast BCIP/NBTMillipore SigmaB5655
Silver Stain Plus KitBioRad1610449Protocollo interno utilizzato in questa procedura, tuttavia questo kit è equivalente
Microscopia elettronicaall'acetato di uranileScienze 22400
da banco Ladder per proteine precolorate Kit per il

Riferimenti

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