Questo protocollo descrive la cromatografia di esclusione dimensionale, una tecnica facile e riproducibile per arricchire le vescicole extracellulari del Mycobacterium tuberculosis dai supernatanti di coltura.
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Articolo metodologico
Mycobacterium tuberculosis Arricchimento delle vescicole extracellulari attraverso la cromatografia di esclusione dimensionale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il ruolo delle vescicole extracellulari (EV) nel contesto dell'infezione batterica è emerso come una nuova strada per comprendere la fisiologia microbica. In particolare, i veicoli elettrici Mycobacterium tuberculosis (Mtb) svolgono un ruolo nell'interazione ospite-patogeno e nella risposta allo stress ambientale. I veicoli elettrici Mtb sono anche altamente antigenici e mostrano un potenziale come componenti del vaccino. Il metodo più comune per purificare i veicoli elettrici Mtb è l'ultracentrifugazione del gradiente di densità. Questo processo presenta diverse limitazioni, tra cui bassa produttività, bassa resa, dipendenza da attrezzature costose, sfide tecniche e può avere un impatto negativo sulla preparazione risultante. La cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) è un metodo alternativo più delicato che combatte molte delle limitazioni dell'ultracentrifugazione. Questo protocollo dimostra che SEC è efficace per l'arricchimento Mtb EV e produce preparazioni Mtb EV di alta qualità di maggiore resa in modo rapido e scalabile. Inoltre, un confronto con l'ultracentrifugazione del gradiente di densità mediante procedure di quantificazione e qualificazione dimostra i vantaggi della SEC. Mentre la valutazione della quantità ev (analisi del tracciamento delle nanoparticelle), del fenotipo (microscopia elettronica a trasmissione) e del contenuto (Western blotting) è adattata ai veicoli elettrici Mtb, il flusso di lavoro fornito può essere applicato ad altri micobatteri.
Introduzione
Il rilascio di vescicole extracellulari (EV) da parte di agenti patogeni può essere la chiave per sbloccare nuove tecnologie per controllare le malattie infettive1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è un agente patogeno di alta conseguenza, che infetta circa un terzo della popolazione mondiale e reclama la vita di milioni di persone ogni anno2. La produzione di VEICOLI ELETTRICI da parte di Mtb è ben documentata ma sfuggente nella biogenesi e nei vari ruoli (cioè immunostimolante, immunosoppressiva, ferro e acquisizione di nutrienti) di questi veicoli elettrici nel contesto dell'infezione....
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Protocollo
Il Comitato istituzionale per la biosicurezza della Colorado State University ha approvato il presente studio (19-046B). La coltivazione del Mycobacterium tuberculosis e la raccolta di supernatanti di coltura ricchi di EV sono state eseguite da personale addestrato in un laboratorio ad alto contenimento. I materiali sono stati spostati fuori dall'area ad alto contenimento dopo che è stato eseguito, confermato e approvato dalle politiche di biosicurezza istituzionali un valido metodo di inattivazione. Durante la replica del protocollo, se l'inattivazione convalidata o il metodo di filtrazione sterile non sono fattibili, le seguenti procedure devono essere eseg....
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Risultati
La proteina filtrata di coltura (CFP) da Mycobacterium tuberculosis (Mtb) è stata concentrata, quantificata e quindi 3 mg di materiale sono stati applicati a una colonna di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). Le concentrazioni di proteine e particelle sono state enumerate rispettivamente da BCA e NTA. Gli intervalli previsti per il recupero di proteine e particelle più i valori esatti ottenuti per questi risultati sono riportati nella Tabella 1. Valori molto più alti di questi interv.......
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Discussione
Le vescicole extracellulari di Mycobacterium tuberculosis sono serbatoi altamente antigenici, che li presentano come una strada attraente per lo sviluppo di strumenti diagnostici e futuri vaccini 4,19,20. Storicamente, l'ultracentrifugazione del gradiente di densità è stata utilizzata per separare i veicoli elettrici Mtb da altri materiali solubili e secreti8. Sebbene questo processo sia efficace.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere il sostegno del College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award e del College Research Council Shared Research Program a NKG e il finanziamento da parte di ATCC (premio # 2016-0550-0002) a KMD. Vorremmo anche ringraziare Anne Simpson per il supporto tecnico e BEI Resources, NIAID, NIH per i seguenti reagenti: Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (prodotto in vitro), NR-13792, Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (prodotto in vitro), NR-49223 e Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (prodotto in vitro), NR-13811.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| Piastra a 96 pozzetti | Corning | 15705-066 | |
| Collettore automatico di frazioni | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Centrifuga | Invitrogen | 10748010 | |
| Beckman Coulter | Allegra 6R | ||
| Centricon Plus - 70 Filtro centrifugo, cutoff 100 kDa | Millipore Sigma | UFC710008 | Dispositivo di ultrafiltrazione utilizzato nella fase 1.1 |
| Sistema di elettroblotting | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| Microscopia elettronica con paraformaldeide di grado EM | Scienze | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Griglie | Microscopia elettronica Scienze | FCF200H-Cu-TA | |
| Capra Anti-Topo IgG H& L (fosfatasi alcalina), molecola intera, 1 mL | AbCam | ab6790 | Anticorpo secondario |
| JEM-1400 Microscopio elettronico a trasmissione | JOEL | ||
| Kit per il dosaggio delle proteine Micro BCA | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Lettore di micropiastre | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Anticorpo primario |
| Monoclonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Anticorpo |
| primario Monocolonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Anticorpo primario |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | Per la pulizia al plasma della griglia TEM | |
| Nanosight dotato di pompa a siringa e computer con software NanoSight NTA | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Membrana in nitrocellulosa, Roll, 0.2 μ m | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato, 1X senza calcio e magnesio | Corning | 21-040-CV | |
| dosaggio delle proteine BCA Pierce | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Alimentatore di base | BioRad | 1645050 | |
| qEV Originale 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | Colonna SEC |
| Tampone campione SDS | Boster | AR1112 | Ricetta interna utilizzata in questa procedura, tuttavia questo prodotto è equivalente |
| Camera gel SDS-PAGE | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | Protocollo interno utilizzato in questa procedura, tuttavia questo kit è equivalente |
| Microscopia elettronica | all'acetato di uranile | Scienze 22400 |
Riferimenti
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-R....
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Ristampe e permessi
