Qui presentiamo un protocollo incentrato sul controllo di qualità della legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra modificando tecnicamente la procedura tradizionale nei ratti per la ricerca acuta sull'ischemia-riperfusione miocardica.
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Articolo metodologico
Legatura delle arterie coronarie discendenti anteriori sinistre per la ricerca sull'ischemia-riperfusione: miglioramento del modello tramite modifiche tecniche e controllo qualità
In questo articolo
Sommario
Abstract
La malattia coronarica è la principale causa di morte a livello globale. La completa cessazione del flusso sanguigno nelle arterie coronarie provoca infarto miocardico con elevazione del segmento ST (STEMI), con conseguente shock cardiogeno e aritmia fatale, che sono associati ad alta mortalità. L'intervento coronarico primario (PCI) per la ricanalizzazione dell'arteria coronaria migliora significativamente i risultati di STEMI, ma i progressi compiuti nel ridurre il tempo da porta a palloncino non sono riusciti a ridurre la mortalità ospedaliera, suggerendo che sono necessarie ulteriori strategie terapeutiche. La legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) nei ratti è un modello animale per la ricerca IR miocardica acuta paragonabile allo scenario clinico in cui viene utilizzata la rapida ricanalizzazione coronarica attraverso PCI per STEMI; tuttavia, lo STEMI indotto da PCI è un'operazione tecnicamente impegnativa e complicata associata a un'elevata mortalità e a grandi variazioni nelle dimensioni dell'infarto. Abbiamo identificato la posizione ideale per la legatura LAD, creato un gadget per controllare un anello di rullante e supportato una manovra chirurgica modificata, riducendo così il danno tissutale, per stabilire un protocollo di ricerca sull'ischemia-riperfusione miocardica acuta (IR) affidabile e riproducibile per i ratti. Questo è un intervento chirurgico di non sopravvivenza. Proponiamo anche un metodo per convalidare la qualità dei risultati dello studio, che è un passo fondamentale per determinare l'accuratezza delle successive analisi biochimiche.
Introduzione
La cardiopatia ischemica è una delle principali cause di morte in tutto il mondo 1,2. Oltre al controllo dei fattori di rischio modificabili per prevenire lo sviluppo di malattia coronarica, le strategie terapeutiche sono necessarie in modo cruciale per la sindrome coronarica acuta 3,4. È stato riscontrato che lo shock cardiogeno e l'aritmia fatale nell'infarto miocardico acuto con elevazione del tratto ST (STEMI) aumentano la probabilità di mortalità ospedaliera 5,6,7,8. L'intervento coronarico percutaneo primario (PCI) è il trattamento preferito per STEMI 9,10,11; Tuttavia, gli effetti terapeutici hanno un limite quando il tempo door-to-balloon è <90 min12,13. Sono necessarie ulteriori strategie per migliorare ulteriormente gli esiti clinici della malattia 14,15,16,17,18,19.
Un esperimento acuto di ischemia-riperfusione miocardica (IR) che coinvolge la legatura dell'arteria discendente anteriore sinistra (LAD) nei ratti è uno dei modelli animali paragonabili allo scenario clinico in cui sono necessari brevi tempi door-to-balloon per i pazienti con STEMI per salvare il cuore dal danno ischemico. Tuttavia, lo STEMI indotto dalla chirurgia nei piccoli animali è spesso tecnicamente impegnativo perché è un'operazione complessa associata ad alta mortalità e alta variazione delle dimensioni dell'infarto 20,21,22,23,24. Per superare la sfida tecnica, il presente studio ha sviluppato un modello animale completo ed efficace nei ratti (perché sono più grandi dei topi) per stabilire un protocollo di ricerca IR miocardica acuta affidabile e riproducibile attraverso modifiche tecniche. Il protocollo proposto si traduce in un minor numero di complicanze chirurgiche, meno danni ai tessuti e meno probabilità di mortalità durante l'intervento chirurgico. Inoltre, è stata utilizzata una procedura per misurare le dimensioni dell'infarto e l'area a rischio (AAR) e, quindi, verificare la qualità dei risultati dello studio. Il protocollo proposto può essere utilizzato per studiare i processi fisiopatologici dello stress IR miocardico acuto per sviluppare nuove strategie terapeutiche contro il danno.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, pubblicata dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (pubblicazione NIH n. 85-23, rivista nel 1996). Il protocollo di studio è stato approvato e in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università cattolica Fu-Jen.
1. Preparazione prima dell'intervento chirurgico
- Preparazione di batuffoli di cotone bagnati salini
- Indossare una maschera chirurgica e guanti.
- Pizzica una piccola porzione di cotone sterile e arrotolala per formare una palla. Ripetere questa procedura.
- Immergere i batuffoli di cotone in soluzione salina sterile allo 0,9% e spremere la soluzione salina in eccesso.
- Conservare i batuffoli di cotone in una scatola pulita sterilizzata con etanolo al 75%.
- Preparazione di ganci di tenuta.
- Indossare una maschera chirurgica e guanti.
- Sterilizzare clip e elastici con etanolo al 75%.
- Piegare le clip a forma di gancio per la parete toracica e il tessuto.
- Collegare le clip piegate con uno, due o tre elastici per garantire che la tensione dalla ferita della finestra chirurgica sia abbastanza ampia per la legatura LAD.
- Preparare e conservare almeno cinque ganci fatti in casa in una scatola pulita sterilizzata con etanolo al 75%.
- Preparazione di un anello di legatura.
- Posizionare il centro di un punto di seta 7-0 nell'occhio a molla di dimensione 1/2 cerchio 3 di un ago chirurgico affusolato non avvolto.
- Preparazione di un controller ad anello rullante
- Tagliare un tubo di polietilene (PE)-10 da 5 mm usando le forbici.
- Riscaldare e ammorbidire il tubo sotto la fiamma per levigare entrambi i bordi.
- Preparare i ratti
- Seleziona ratti maschi di Sprague-Dawley di 8 settimane con un peso minimo di 250 g.
- Ospitare e mantenere i ratti sotto un ciclo luce/buio di 12 ore a temperatura controllata (21 °C ± 2 °C) con libero accesso al cibo, pellet standard di topo e acqua di rubinetto.
- Anestetizzare i ratti con pentobarbital (50 mg/kg, somministrato per via intraperitoneale).
NOTA: Un anestetico aggiuntivo (pentobarbital, 30 mg/kg) deve essere somministrato dopo ogni ora. - Controlla i riflessi dei ratti pizzicando la coda e le zampe posteriori per assicurarti che l'animale sia sufficientemente anestetizzato.
- Aprire il tessuto tra due anelli di cartuccia sotto la glottide usando le forbici e inserire un tubo PE-10 di 3 cm per agire come un tubo endotracheale25.
- Collegare manualmente il tubo endotracheale a un ventilatore.
- Ispezionare il movimento toracico dell'animale sincronizzato con il ciclo respiratorio per assicurarsi che i polmoni siano adeguatamente ventilati.
- Aprire la regione del collo e cannulare la vena giugulare26.
2. Legatura LAD
- Indossare una maschera chirurgica e guanti.
- Tocca il torace e trova il manubrio e l'angolo sternale (la giunzione del corpo del manubrio e dello sterno).
- Identifica la costola sul lato sinistro che si collega con l'angolo sternale (costola A) toccando manualmente.
- Identificare lo spazio intercostale immediatamente sotto la costola A. Utilizzare una pinza a punta fine per sollevare delicatamente la pelle vicino allo spazio intercostale, quindi utilizzare un bisturi chirurgico con una lama per creare un'incisione obliqua di 1 cm lungo le linee di tensione della pelle dal punto a circa 5 mm a sinistra del corpo sternale.
- Utilizzare una pinza curva per separare delicatamente la pelle e gli strati muscolari dall'incisione. Agganciare gli strati muscolari all'esterno della parete toracica anteriore sinistra verso il basso con clip piegate per esporre le costole sottostanti.
- Identificare la costola sotto la costola A (costola B). Tagliare la costola B con una forbice smussata dal centro della cartilagine della costola (circa 2-3 mm dal corpo sternale). Toccare delicatamente e comprimere la ferita con un batuffolo di cotone bagnato salino per diversi secondi se si verifica sanguinamento.
- Aprire il torace con attenzione dal taglio della costola B con quattro clip piegate. Ogni clip piegata dovrebbe agganciare il muscolo intercostale e le costole per allargare delicatamente la parete toracica in quattro direzioni (vale a dire, superiore poi sinistra, superiore poi destra, sinistra verso il basso e destra verso il basso) e creare una finestra chirurgica rettangolare.
- Aggancia delicatamente contro il polmone sinistro e altri tessuti adiacenti che coprono il pericardio con un'altra clip piegata per prevenire danni accidentali ai tessuti durante la procedura.
- Esporre il cuore rimuovendo delicatamente il pericardio sottile con una pinza. Identificare il 1 ° ramo dell'arteria coronaria principale sinistra (LMCA), che di solito si trova tra l'arteria polmonare e il padiglione auricolare sinistro. LMCA e LAD si presentano come una linea rossa brillante superficiale che corre dal bordo del padiglione auricolare sinistro verso l'apice.
- Utilizzare l'ago chirurgico preparato per creare un anello di legatura aperto inserendo e passando il punto di seta sotto il LAD in una posizione immediatamente distale al 1 ° ramo del LMCA nella direzione da sinistra verso il lato destro del LAD per evitare di perforare accidentalmente il padiglione auricolare sinistro. Con una singola sutura, viene creato il ciclo aperto. Tamponare delicatamente la superficie del cuore per visualizzare le arterie coronarie se il LAD è invisibile a causa del liquido o del sangue che copre la superficie del cuore.
- Tenere un lato della sutura e separare delicatamente l'ago dalla sutura usando un portaaghi.
- Inserire le due estremità della sutura di seta su un lato dell'anello aperto nel cerchio sull'altro lato per formare un anello di rullante.
- Inserire le due estremità della sutura di seta dell'anello rullante nel controller del rullante preparato prima di chiudere l'anello.
- Far scorrere il controller del rullante lungo la sutura della seta mentre si allunga delicatamente la seta per chiudere l'anello del rullante. Interrompere il flusso coronarico del LAD per indurre ischemia miocardica temporanea per 1 ora.
- Tenere la seta per fissare la posizione del controller del rullante con una pinza Kelly una volta che il cappio è stato legato saldamente. Posizionare l'altra estremità della pinza Kelly sul lettino chirurgico durante la legatura LAD.
- Coprire la finestra chirurgica con batuffoli di cotone bagnati salini durante la legatura LAD.
- Apri la pinza Kelly.
- Rilasciare il controller del loop del rullante per la riperfusione del flusso coronarico per 2 ore.
- Resecare il cuore lungo la base e i bordi vascolari con attenzione ed evitare di afferrare il tessuto.
NOTA: Eutanasia del ratto con CO2 ad una portata del 40% del volume della gabbia/min.
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Risultati
Al termine dell'ischemia miocardica e della riperfusione, la qualità della legatura del LAD deve essere valutata prima di ulteriori analisi biochimiche o molecolari.
La sufficienza dell'occlusione di LAD attraverso la legatura è stata determinata iniettando 1 mL di colorante blu di Evan al 2% attraverso il catetere venoso centrale. Quindi, il miocardio con perfusione coronarica è stato colorato di blu rispetto alla regione non perfusa, che è rimasta rossa (Figura 1A
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Discussione
Il protocollo proposto ha diverse caratteristiche distintive, come l'identificazione della posizione esatta per la legatura LAD, la creazione di un gadget per controllare un anello di rullante in una singola sutura e il supporto di una manovra chirurgica modificata per ridurre il danno tissutale, consentendo così ai ricercatori di legare il LAD in modo accurato, sicuro e coerente, nonché di controllare istantaneamente lo stato del loop del rullante per la ricerca IR miocardica acuta.
La posizi...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi per quanto riguarda la pubblicazione di questo articolo.
Ringraziamenti
Questo modello è stato sviluppato con il sostegno finanziario del Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan (MOST 109-2320-B-030-006-MY3).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Evan' s blu | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Pinze | Shinva | ||
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Lame per bisturi | Shinva | s2646 | |
| Manici per bisturi | Shinva | ||
| Suture in seta | SharpointTM | DC-2150N | |
| Ago chirurgico | AnchorTM | ||
| Soluzione di cloruro di trifeniltetrazolio (TTC) | Ventilatore Solarbio | T8170-1 | |
| Ventilatore | per roditori di Harvard |
Riferimenti
- Khan, M. A., et al. Global epidemiology of ischemic heart disease: Results from the global burden of disease study. Cureus. 12 (7), 9349(2020).
- Nowbar, A. N., Gitto, M., Howard, J. P., Francis, D. P., Al-Lamee, R. Mortality from ischemic heart disease. Circulation: Cardiovascular Quality and Outcomes. 12 (6), 005375(2019).
- Kuo, F. Y., et al. Effect of CYP2C19 status on platelet reactivity in Taiwanese acute coronary syndrome patients switching to prasugrel from clopidogrel: Switch Study. Journal of the Formosan Medical Association. , (2022).
- Li, Y. H., et al. Guidelines of the Taiwan Society of Cardiology, Taiwan Society of Emergency Medicine and Taiwan Society of Cardiovascular Interventions for the management of non ST-segment elevation acute coronary syndrome. Journal of the Formosan Medical Association. 117 (9), 766-790 (2018).
- Liu, Y. B., et al. Dyslipidemia is associated with ventricular tachyarrhythmia in patients with acute ST-segment elevation myocardial infarction. Journal of the Formosan Medical Association. 105 (1), 17-24 (2006).
- Anghel, L., Sascău, R., Stătescu, C. Myocardial infarction with cardiogenic shock-the experience of a primary PCI center from North-East Romania. Signa Vitae. 17 (5), 64-70 (2021).
- Samat, A. H. A., Embong, H., Harunarashid, H., Maskon, O. Predicting ventricular arrhythmias and in-hospital mortality in acute coronary syndrome patients presenting to the emergency department. Signa Vitae. 16 (1), 55-64 (2020).
- Wang, Y. C., et al. Outcome of primary percutaneous coronary intervention in octogenarians with acute myocardial infarction. Journal of the Formosan Medical Association. 105 (6), 451-458 (2006).
- Markovic, D., et al. Effects of a percutaneous coronary intervention or conservative treatment strategy on treatment outcomes in elderly female patients with acute coronary syndrome. Signa Vitae. 12 (1), 96-100 (2016).
- Hannan, E. L., et al. Effect of onset-to-door time and door-to-balloon time on mortality in patients undergoing percutaneous coronary interventions for ST-segment elevation myocardial infarction. American Journal of Cardiology. 106 (2), 143-147 (2010).
- McNamara, R. L., et al. Effect of door-to-balloon time on mortality in patients with ST-segment elevation myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 47 (11), 2180-2186 (2006).
- Pehnec, Z., Sinkovië, A., Kamenic, B., Marinšek, M., Svenšek, F. Baseline characteristics, time-to-hospital admission and in-hospital outcomes of patients hospitalized with ST-segment elevation acute coronary syndromes, 2002 to 2005. Signa Vitae. 4 (1), 14-20 (2009).
- Menees, D. S., et al. Door-to-balloon time and mortality among patients undergoing primary PCI. The New England Journal of Medicine. 369 (10), 901-909 (2013).
- Ku, H. C., Chen, W. P., Su, M. J. DPP4 deficiency preserves cardiac function via GLP-1 signaling in rats subjected to myocardial ischemia/reperfusion. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 384 (2), 197-207 (2011).
- Lee, S. Y., Ku, H. C., Kuo, Y. H., Chiu, H. L., Su, M. J. Pyrrolidinyl caffeamide against ischemia/reperfusion injury in cardiomyocytes through AMPK/AKT pathways. Journal of Biomedical Science. 22 (1), 18(2015).
- Ku, H. C., et al. TM-1-1DP exerts protective effect against myocardial ischemia reperfusion injury via AKT-eNOS pathway. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 388 (5), 539-548 (2015).
- Ku, H. C., Lee, S. Y., Yang, K. C., Kuo, Y. H., Su, M. J. Modification of caffeic acid with pyrrolidine enhances antioxidant ability by activating AKT/HO-1 pathway in heart. PLoS ONE. 11 (2), 0148545(2016).
- Alonso-Herranz, L., et al. Macrophages promote endothelial-to-mesenchymal transition via MT1-MMP/TGFbeta1 after myocardial infarction. eLife. 9, 57920(2020).
- Liu, J., Zheng, X., Zhang, C., Zhang, C., Bu, P. Lcz696 alleviates myocardial fibrosis after myocardial infarction through the sFRP-1/Wnt/beta-catenin signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 724147(2021).
- Goldman, S., Raya, T. E. Rat infarct model of myocardial infarction and heart failure. Journal of Cardiac Failure. 1 (2), 169-177 (1995).
- Ke, J., Zhu, C., Zhang, Y., Zhang, W. Anti-arrhythmic effects of linalool via Cx43 expression in a rat model of myocardial infarction. Frontiers in Pharmacology. 11, 926(2020).
- Houde, M., et al. Mouse mast cell protease 4 deletion protects heart function and survival after permanent myocardial infarction. Frontiers in Pharmacology. 9, 868(2018).
- Chen, J., Ceholski, D. K., Liang, L., Fish, K., Hajjar, R. J. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (2), 275-282 (2017).
- Kainuma, S., et al. Influence of coronary architecture on the variability in myocardial infarction induced by coronary ligation in rats. PLoS ONE. 12 (8), 0183323(2017).
- Heil, J., Schlapfer, M. A reproducible intensive care unit-oriented endotoxin model in rats. Journal of Visualized Experiments. (168), e62024(2021).
- Schleimer, K., et al. Training a sophisticated microsurgical technique: Interposition of external jugular vein graft in the common carotid artery in rats. Journal of Visualized Experiments. (69), e4124(2012).
- Lindsey, M. L., et al. Guidelines for experimental models of myocardial ischemia and infarction. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 812-838 (2018).
- Li, H., et al. A new model of heart failure post-myocardial infarction in the rat. Journal of Visualized Experiments. (172), e62540(2021).
- Opitz, C. F., Mitchell, G. F., Pfeffer, M. A., Pfeffer, J. M. Arrhythmias and death after coronary artery occlusion in the rat. Continuous telemetric ECG monitoring in conscious, untethered rats. Circulation. 92 (2), 253-261 (1995).
- Kawashima, T., Sato, F. Clarifying the anatomy of the atrioventricular node artery. International Journal of Cardiology. 269, 158-164 (2018).
- Vikse, J., et al. Anatomical variations in the sinoatrial nodal artery: A meta-analysis and clinical considerations. PLoS ONE. 11 (2), 0148331(2016).
- Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury through ligation of the left anterior descending artery. Journal of Visualized Experiments. (86), e51329(2014).
- Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovascular Research. 74 (1), 29-38 (2007).
- De Villiers, C., Riley, P. R. Mouse models of myocardial infarction: Comparing permanent ligation and ischemia-reperfusion. Disease Models & Mechanisms. 13 (11), (2020).
- Reichert, K., et al. Murine left anterior descending (LAD) coronary artery ligation: An improved and simplified model for myocardial infarction. Journal of Visualized Experiments. (122), e55353(2017).
- Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. Murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery. Journal of Visualized Experiments. (150), e59591(2019).
- Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K. Acute myocardial infarction in rats. Journal of Visualized Experiments. (48), e2464(2011).
- Muthuramu, I., Lox, M., Jacobs, F., De Geest, B. Permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice: a model of post-myocardial infarction remodelling and heart failure. Journal of Visualized Experiments. (94), e52206(2014).
- Langer, K. On the anatomy and physiology of the skin. British Journal of Plastic Surgery. 31 (4), 277-278 (1978).
- Carmichael, S. W. The tangled web of Langer's lines. Clinical Anatomy. 27 (2), 162-168 (2014).
- Chang, L. R., Marston, G., Martin, A. Anatomy, Cartilage. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2022).
- Kolk, M. V., et al. LAD-ligation: A murine model of myocardial infarction. Journal of Visualized Experiments. (32), e1438(2009).
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