I metodi immunochimici stabiliti per misurare i trasmettitori peptidici in vivo si basano sulla microdialisi o sul prelievo di liquidi sfusi per ottenere il campione per l'analisi offline. Tuttavia, questi soffrono di limitazioni spazio-temporali. Il presente protocollo descrive la fabbricazione e l'applicazione di un biosensore immunoprobo capacitivo che supera i limiti delle tecniche esistenti.
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Articolo metodologico
Misurazione in vivo risolta nel tempo della dinamica dei neuropeptidi mediante immunosonda capacitiva nel cuore suino
In questo articolo
Sommario
Abstract
La capacità di misurare in vivo biomarcatori rilevanti per la valutazione della progressione della malattia è di grande interesse per la comunità scientifica e medica. La risoluzione dei risultati ottenuti dagli attuali metodi di misurazione di alcuni biomarcatori può richiedere diversi giorni o settimane per essere ottenuta, in quanto possono essere limitati nella risoluzione sia spazialmente che temporalmente (ad esempio, microdialisi del compartimento fluido del liquido interstiziale analizzato mediante saggio immunoassorbente enzimatico [ELISA], cromatografia liquida ad alte prestazioni [HPLC] o spettrometria di massa); pertanto, la loro guida di diagnosi e trattamento tempestivi viene interrotta. Nel presente studio, viene riportata una tecnica unica per rilevare e misurare i trasmettitori peptidici in vivo attraverso l'uso di un biosensore immunoprobo capacitivo (sonda CI). Vengono descritti il protocollo di fabbricazione e la caratterizzazione in vitro di queste sonde. Vengono fornite misurazioni del rilascio in vivo di neuropeptide Y (NPY) evocato dalla stimolazione simpatica. Il rilascio di NPY è correlato al rilascio simpatico di noradrenalina per riferimento. I dati dimostrano un approccio per la misurazione rapida e localizzata dei neuropeptidi in vivo. Le applicazioni future includono la valutazione intraoperatoria in tempo reale della progressione della malattia e l'implementazione minimamente invasiva basata su catetere di queste sonde.
Introduzione
Diversi metodi chimici per rilevare e quantificare i biomarcatori sono abitualmente utilizzati sia nella chimica delle proteine che nella diagnostica clinica, in particolare nelle diagnosi di cancro e nella valutazione della progressione delle malattie cardiovascolari. Attualmente, metodi come la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), il saggio immunoassorbinte enzimatico (ELISA) e la spettrometria di massa si basano sulla raccolta di campioni dal compartimento vascolare 1,2,3 mediante prelievo di liquidi sfusi o dal compartimento interstiziale mediante microdialis....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Università della California, Los Angeles Animal Research Committee ed eseguiti seguendo le linee guida stabilite dal National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8a edizione, 2011). Suini maschi adulti dello Yorkshire di circa 75 kg sono stati utilizzati per studi in vivo 10.
1. Fabbricazione e funzionalizzazione di immunosonda capacitive
- Tagliare un filo di platino rivestito di perfluoroaltoxi (PFA) lungo 25 cm (vedi Tabella dei materiali) e rimuovere circa 5 mm di riv....
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Risultati
Fabbricazione e caratterizzazione degli elettrodi
È stata fabbricata un'immunosonda capacitiva flessibile (sonde CI) e un'immagine rappresentativa è raffigurata nella Figura 1A. Il potenziale dell'elettrodo è stato impostato da un circuito di morsetto di tensione controllato da computer (Figura 1B) e l'elettrodo è stato immerso in una soluzione di polidopamina prodotta in PBS. La polidopamina è stata elettrodepositata sulla punta dell'elettro.......
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Discussione
Il presente protocollo descrive la produzione e la sperimentazione di un'immunosonda capacitiva (sonda CI) in grado di rilevare e misurare biomarcatori di interesse sia in vitro che in vivo . Il rilevamento si ottiene intrappolando il biomarcatore sulla punta dell'elettrodo. L'evento di intrappolamento altera la giunzione capacitiva tra un'immunosonda capacitiva a filo di platino e l'ambiente fluido conduttivo circostante, misurato come un cambiamento nella corrente di carica in risposta a un potenziale.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse, finanziari o di altro tipo.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Olu Ajijola (UCLA Cardiac Arrhythmia Center) per il supporto di esperti per gli esperimenti in vivo . Questo lavoro è stato supportato da NIH U01 EB025138 (JLA, CS).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Elettrodo a disco AgCl | Warner Instruments (Holliston, MA) | 64-1307 | |
| Anticorpo monoclonale anti-NPY | Abcam, (Cambridge, MA) | ab112473 | |
| Amplificatore multicanale personalizzato/ 1 resistore di retroazione MΩ stadio principale multicanale | NPI Electronic, (Tamm, Germania) | NA | Basato sull'amplificatore multicanale NPI VA-10M |
| Dopamina HCl | Sigma Aldrich (St. Louis, MO) | H8502-10G | |
| Pin connettore maschio placcato oro | AMP-TE Connettività (Amplimite) | 6-66506-1 | |
| HEKA LIH 8+8 analogico-digitale/digitale-analogico | HEKA Elektronik, (Holliston, MA) | NA | |
| Software di acquisizione dati Igor Pro, v. 7.08 | WaveMetrics, (Lake Oswego, OR) | Il software di pilotaggio del potenziale di comando e l'acquisizione dei dati sono stati scritti su misura | |
| Pompa peristaltica digitale Masterflex L/S Standard | Cole Palmer, (Vernon Hills, IL) | ||
| Filo di platino rivestito in PFA | A-M Systems, (Sequim, WA) | 773000 | 0,005" di diametro nudo, 0,008" di diametro rivestito |
| Elastomero siliconico | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | SYLG184 | |
| Peptide sintetico suino NPY | Bachem (Torrance, CA) | ||
| Peptide sintetico suino NPY | Bachem (Torrance, CA | 4011654 |
Riferimenti
- Chow, S. L., et al. Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).
- Goldstein, D. S.
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Ristampe e permessi
