Bioreattore di perfusione multi-stream integrato con frazionamento in uscita per colture cellulari dinamiche

Sommario

Questo documento presenta un metodo per costruire e gestire un sistema di coltura cellulare a perfusione multicanale a basso costo per misurare la dinamica dei tassi di secrezione e assorbimento dei soluti nei processi cellulari. Il sistema può anche esporre le cellule a profili di stimolo dinamici.

Abstract

Alcune funzioni cellulari e tissutali operano all'interno della scala temporale dinamica da minuti a ore che sono scarsamente risolte dai sistemi di coltura convenzionali. Questo lavoro ha sviluppato un sistema di bioreattori a perfusione a basso costo che consente di perfondere continuamente il terreno di coltura in un modulo di coltura cellulare e frazionato in un modulo a valle per misurare la dinamica su questa scala. Il sistema è costruito quasi interamente da parti disponibili in commercio e può essere parallelizzato per condurre esperimenti indipendenti in piastre di coltura cellulare multi-pozzo convenzionali contemporaneamente. Questo articolo video illustra come assemblare la configurazione di base, che richiede solo una singola pompa a siringa multicanale e un collettore di frazioni modificato per perfondere fino a sei colture in parallelo. Vengono inoltre presentate varianti utili sul design modulare che consentono dinamiche di stimolazione controllate, come impulsi di soluto o profili simili a farmacocinetici. È importante sottolineare che, poiché i segnali dei soluti viaggiano attraverso il sistema, vengono distorti a causa della dispersione del soluto. Inoltre, viene descritto un metodo per misurare le distribuzioni del tempo di residenza (RTD) dei componenti della configurazione della perfusione con un tracciante utilizzando MATLAB. Gli RTD sono utili per calcolare come i segnali dei soluti sono distorti dal flusso nel sistema multi-compartimento. Questo sistema è altamente robusto e riproducibile, quindi i ricercatori di base possono facilmente adottarlo senza la necessità di strutture di fabbricazione specializzate.

Introduzione

Molti importanti processi biologici si verificano in colture cellulari e tissutali sulla scala temporale da minuti a ore ^1,2,3. Mentre alcuni di questi fenomeni possono essere osservati e registrati in modo automatizzato utilizzando la microscopia time-lapse⁴, la bioluminescenza¹ o altri metodi, gli esperimenti che coinvolgono la raccolta di campioni di surnatante di coltura per l'analisi chimica vengono spesso eseguiti manualmente in colture cellulari statiche. Il campionamento manuale limita la fattibilità di alcuni studi a ca....

Protocollo

1. Preparare le parti per la perfusione della piastra del pozzo

1. Preparare i tubi
   1. Tagliare due lunghezze di tubi in silicone (diametro interno 1,6 mm) per ogni coltura cellulare da perfusare. Assicurarsi che il pezzo utilizzato come tubo a monte sia abbastanza lungo da raggiungere dalla pompa della siringa alla coltura cellulare all'interno dell'incubatore e che il pezzo a valle possa raggiungere dalla coltura cellulare alla posizione più estesa del collettore di frazione.
   2. Dai a ogni pezzo di tubo un'etichetta unica su entrambe le estremità con nastro adesivo.
2. Preparare i tappi per il piatto del pozzo....

Risultati

Il sistema di perfusione con più sorgenti medie della sezione 5 del protocollo è stato utilizzato per misurare le dinamiche di espressione di un gene reporter guidato dal fattore nucleare kappa-light-chain-enhancer del fattore di trascrizione delle cellule B attivate (NF-κB) nelle cellule del rene embrionale umano 293 (HEK293) in risposta a un impulso di 1,5 ore del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α). Le cellule HEK293 sono state stabilmente trasdotte utilizzando vettori lentivirali con un costrutto genico contenen.......

Discussione

Questo lavoro descrive l'assemblaggio e il funzionamento di un sistema di coltura cellulare a perfusione con più sorgenti medie dimostrate con un esempio specifico in cui sono state misurate le dinamiche dell'espressione genica guidata da NF-κB in risposta a un impulso transitorio di TNF-α. Gli RTD dei componenti del sistema di perfusione sono stati misurati e modellati e la convoluzione del segnale è stata utilizzata per prevedere sia l'esposizione delle cellule all'impulso TNF-α sia la distribuzione TNF-α nelle frazion.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ago sonda monouso calibro 18 1 1/2 per l'uso con siringhe e macchine erogatrici	Grainger	5FVK2
293T Celle	ATCC	CRL-3216	HEK 293T utilizzate nell'esperimento dei risultati rappresentativi.
Piastre inferiori trasparenti a 96 pozzetti, piastre Corning	VWR	89091-010	per la misurazione delle concentrazioni di colorante negli esperimenti RTD e GLuc negli esperimenti con risultati rappresentativi.
BD  Siringhe monouso con punte Luer-Lok, 5 mL	Fisher Scientific	14-829-45
BioFrac Fraction Collector	Bio-Rad	7410002	collettore di frazioni che può essere utilizzato per un singolo flusso o modificato utilizzando il nostro metodo per consentire la raccolta da più flussi.
Acrilico trasparente ad alta resistenza resistente ai raggi UV 12" x 12" x 1/8"	McMaster-Carr	4615T93	Questo foglio viene tagliato utilizzando una taglierina laser secondo il file DXF nei materiali supplementari per produrre l'erogatore multitesta che può essere collegato al collettore di frazioni BioFrac.
Substrato nativo della colenteterazina	NanoLight Technology	303	utilizzato nel saggio di bioluminescenza della luciferasi Gaussia in risultati rappresentativi.
Piastre a pozzetti multipli Corning Costar con trattamento TC, misura 48  pozzetti, piastre di polistirene, pozzetti a fondo piatto	Millipore Sigma	CLS3548	Utilizzato per coltivare e perfondere le cellule 293T in risultati rappresentativi.
Corning  Piastre per colture cellulari a fondo piatto Costar, dimensione 12 pozzetti	Fisher Scientific	720081	Può essere tappato e utilizzato come serbatoio agitato per produrre profili farmacocinetici in perfusione. Può contenere anche cellule per la perfusione.
DMEM, alto contenuto di glucosio	ThermoFisher Scientific	11965126
Epilog Zing 24 Laser	Cutting Edge Systems	Epilog Zing 24	Taglierina laser utilizzata per produrre dispenser multitesta da lastra acrilica. Possono essere utilizzati altri laser cutter.
Fisherbrand Siringhe sterili monouso, Luer-lock, 20 mL	Fisher Scientific	14-955-460
Fisherbrand Siringhe sterili monouso, Luer-Lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461
Fisherbrand Provette per microcentrifuga Premium: 1,5 mL	Scientific	05-408-129	Provette per microcentrifuga per la raccolta delle frazioni.
Fisherbrand  Tubi in vetro borosilicato monouso a fondo tondo con estremità liscia	Fisher Scientific	14-961-26	Tubi in vetro per la raccolta di frazioni.
Fisherbrand  Puntali per pipette SureOne Micropoint, universali, non filtrati	Fisher Scientific	2707410	puntali per pipette da 300 ul che si adattano al meglio all'erogatore multitesta e al tubo per fungere da puntali di erogazione.
Gibco  DPBS, polvere, senza calcio, senza magnesio	Fisher Scientific	21600010	soluzione salina tamponata con fosfato.
Labline 4625 Titer Shaker	Marshall Scientific	Labline 4625 Titer Shaker Agitatore	orbitale utilizzato per mantenere mescolati i serbatoi agitati.
Raccordo Masterflex, policarbonato, rubinetto a quattro vie, Luer lock maschio, non sterile; 10/PK	Cole-Parmer	EW-30600-04	Utilizzato per unire più flussi di ingresso per esperimenti RTD ed esperimenti di coltura cellulare.
Raccordo Masterflex, policarbonato, diritto, femmina Luer x Cap; 25/PK	Masterflex	UX-45501-28
Raccordo Masterflex, polipropilene, diritto, femmina Luer a portagomma, 1/16"	Cole-Parmer	EW-45508-00
Raccordo Masterflex, polipropilene, diritto, maschio Luer lock a portagomma, 1/16" ID	Cole-Parmer	EW-45518-00
Raccordo Masterflex, polipropilene, diritto, adattatore Luer lock maschio a spina; 25/PK	Masterflex	EW-30800-30
Tubo per pompa di precisione Masterflex L/S, silicone polimerizzato al platino, L/S 14; 25 piedi	Masterflex	EW-96410-14
MATLAB	MathWorks	R2019b	Versione R2019b. Possono essere utilizzate anche versioni più recenti. Alcune versioni precedenti potrebbero funzionare.
NE-1600 Pompa a siringa programmabile a sei canali	pompaggio New Era	NE-1600
Set di rack F1	Bio-Rad	7410010	Rack per contenere i tubi di raccolta nel collettore di frazioni.
Proteina ricombinante umana TNF-alfa (espressa da HEK293), CF	Bio-Techne	10291-TA-020	Citochina utilizzata per stimolare le cellule 293T in risultati rappresentativi.
Tappi solidi Saint Gobain, silicone versilico, misura: 00, fondo 10,5 mm	Saint Gobain	DX263015-50	Adatto a piastre da 48 pozzetti.
Tappi solidi Saint Gobain, silicone versilico, dimensioni: 4 fondo 21 mm	Saint Gobain	DX263027-10	Adatto a piastre a 12 pozzetti.
Idrossido di sodio, soluzione acquosa 10,0 N APHA; 1 L	Spectrum Chemicals	S-395-1LT
SolidWorks	Dassault Systems	Software	CAD SolidWorks utilizzato per creare il file DXF dell'erogatore multitesta.
Lettore di micropiastre multimodale Varioskan LUX	ThermoFisher Scientific	VL0000D0	Lettore di piastre.
Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue	Michaels	10404779	Colorante alimentare Blue contenente Brilliant Blue FCF, utilizzato come tracciante negli esperimenti RTD. Lo spettro di assorbanza raggiunge picchi a 628 nm.

Fisher Sistemi di ,