Articolo metodologico

Un metodo di compensazione dei tessuti per l'imaging neuronale dalle scale mesoscopiche a quelle microscopiche

DOI:

10.3791/63941

⸱

10 maggio 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroanatomy, Juntendo University Graduate School of Medicine, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Juntendo University Graduate School of Medicine, 3Advanced Research Institute for Health Sciences, Juntendo University, 4Department of Neuroscience, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Japan Society for the Promotion of Science, 6Department of Oral Anatomy and Neurobiology, Graduate School of Dentistry, Osaka University, 7Department of Multi-Scale Brain Structure Imaging, Juntendo University Graduate School of Medicine

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo fornisce un metodo dettagliato di imaging neuronale nella fetta di cervello utilizzando un metodo di compensazione dei tessuti, ScaleSF. Il protocollo include la preparazione del tessuto cerebrale, la chiarificazione dei tessuti, la manipolazione di fette ripulite e l'imaging al microscopio a scansione laser confocale di strutture neuronali da mesoscopiche a livelli microscopici.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui viene fornito un protocollo dettagliato per visualizzare le strutture neuronali dai livelli mesoscopici a quelli microscopici nei tessuti cerebrali. Le strutture neuronali che vanno dai circuiti neurali alle strutture neuronali subcellulari sono visualizzate in fette di cervello di topo otticamente cancellate con ScaleSF. Questo metodo di compensazione è una versione modificata di ScaleS ed è un metodo di compensazione del tessuto idrofilo per fette di tessuto che raggiunge una potente capacità di compensazione e un alto livello di conservazione dei segnali di fluorescenza e integrità strutturale. Una camera di imaging tridimensionale (3D) personalizzabile è progettata per il montaggio affidabile di tessuti cerebrali eliminati. I cervelli di topo iniettati con un vettore virale adeno-associato che trasporta un gene proteico fluorescente verde potenziato sono stati fissati con paraformaldeide al 4% e tagliati in fette di spessore di 1 mm con un'affettatrice di tessuto vibrante. Le fette di cervello sono state eliminate seguendo il protocollo di compensazione, che include incubazioni sequenziali in tre soluzioni, vale a dire, soluzione ScaleS0, soluzione salina tampone fosfato (–) e soluzione ScaleS4, per un totale di 10,5-14,5 ore. Le fette di cervello eliminate sono state montate sulla camera di imaging e incorporate in gel di agarosio all'1,5% disciolto nella soluzione ScaleS4D25(0). L'acquisizione dell'immagine 3D delle fette è stata effettuata utilizzando un microscopio a scansione laser confocale dotato di una lente obiettivo multi-immersione di una lunga distanza di lavoro. Iniziando con l'imaging neuronale mesoscopico, siamo riusciti a visualizzare le strutture neuronali subcellulari fini, come le spine dendritiche e i bouton assonali, nelle fette di cervello otticamente cancellate. Questo protocollo faciliterebbe la comprensione delle strutture neuronali dalle scale dei circuiti ai componenti subcellulari.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I metodi di compensazione dei tessuti hanno migliorato l'imaging indipendente dalla profondità di campioni biologici e clinici con microscopia ottica, consentendo l'estrazione di informazioni strutturali su tessuti intatti 1,2. Le tecniche di compensazione ottica potrebbero anche potenzialmente accelerare e ridurre i costi per l'analisi istologica. Attualmente, sono disponibili tre principali approcci di compensazione: metodi idrofili, idrofobici e a base di idrogel 1,2. Gli approcci idrofili superano nel preservare i segnali di fluorescenza e l'integr....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali dell'Università juntendo (approvazione n. 2021245, 2021246) ed eseguiti in conformità con le linee guida fondamentali per una corretta conduzione degli esperimenti sugli animali dal Consiglio scientifico del Giappone (2006). Qui sono stati utilizzati topi maschi C57BL / 6J iniettati con vettore AAV che trasporta il gene della proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) e parvalbumina (PV) / miristoilazione-EGFP-recettore delle lipoproteine a bassa densità C-terminale cromosoma artificiale batterico (BAC) topi transgenici (topi PV-FGL)9 . I ....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La compensazione ottica di una fetta di cervello di topo di 1 mm di spessore è stata ottenuta utilizzando questo protocollo. La Figura 1B rappresenta le immagini di trasmissione di una fetta di cervello di topo prima e dopo il trattamento di compensazione. Il metodo di pulizia dei tessuti ha reso trasparente una fetta di cervello di topo spessa 1 mm. Una leggera espansione nelle dimensioni finali delle fette di cervello è stata trovata dopo l'incubazione nella soluzione di compensazione per 12 ore (espan.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Passaggi critici all'interno del protocollo
Ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo che dovrebbero essere condotti con la massima cautela per ottenere risultati significativi. La fissazione uniforme dei campioni è indispensabile per l'imaging 3D all'interno di tessuti su larga scala. La lente dell'obiettivo, il campione e il fluido di immersione devono avere RI corrispondente. La mancata corrispondenza ri tra loro porterà a un'imaging altamente disturbato delle cellule che esprimono EGFP all'in.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano Yoko Ishida (Juntendo University) per la produzione di vettori AAV e Kisara Hoshino (Juntendo University) per l'assistenza tecnica. Questo studio è stato supportato da JSPS KAKENHI (JP20K07231 to K.Y.; JP21H03529 a T.F.; JP20K07743 a M.K.; JP21H02592 a H.H.) e Ricerca Scientifica sull'Area Innovativa "Risonanza Bio" (jp18H04743 a H.H.). Questo studio è stato supportato anche dall'Agenzia giapponese per la ricerca e lo sviluppo medico (AMED) (JP21dm0207112 a T.F. e H.H.), Moonshot R& D della Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 a H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) da JST (JPMJFR204D a H....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Obiettivo multi-immersione 16xLeica MicrosystemsHC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
AgarNacalai Tesque01028-85
AgarosioTaKaRa BioL03
Dimetil solfossidoNacalai Tesque13407-45
D-SorbitoloNacalai Tesque06286-55
γ- ciclodestrinaWako Pure Chemical Industries037-10643
GliceroloSigma-AldrichG9012
HuygensEssential Scientific Volume Imagingver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
ImarisBitplanever. 9.0.0
Leica Application Suite XLeica MicrosystemsLAS X, ver. 3.5.5.19976
Metile-beta;-ciclodestrinaTokyo Chemical IndustryM1356
ParaformaldeideMerck Millipore1.04005.1000
Soluzione salina tamponata con fosfato (10x; pH 7.4)Nacalai Tesque27575-3110x PBS(–)
Sodio azideNacalai Tesque31233-55
Sodio pentobarbitalKyoritsu SeiyakuN/A
TCS SP8Leica MicrosystemsN/A
Triton X-100Nacalai Tesque35501-15
UreaNacalai Tesque35940-65
Affettatrice vibrante per tessutiDosaka EMPRO7N

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  2. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Fette di cervelloMicroscopia confocaleClearing otticoRicostruzione 3DSpine dendriticheBouton assonaliPreservazione della fluorescenzaCamera di imaging

Articoli correlati