Un approccio fotodinamico per studiare la funzione della rottura della vescicola intracellulare

Sommario

L'inattivazione laser assistita da cromoforo mediata da AlPcS_2a (CALI) è un potente strumento per studiare il danno spaziotemporale delle vescicole intracellulari (IV) nelle cellule vive.

Abstract

Le vescicole intracellulari (IV) si formano attraverso l'endocitosi delle vescicole nel citoplasma. La formazione IV è coinvolta nell'attivazione di varie vie di segnale attraverso la permeabilizzazione delle membrane IV e la formazione di endosomi e lisosomi. Un metodo chiamato inattivazione laser assistita da cromoforo (CALI) viene applicato per studiare la formazione di IV e i materiali nel controllo della regolazione IV. CALI è una metodologia fotodinamica basata sull'imaging per studiare la via di segnalazione indotta dalla permeabilizzazione della membrana. Il metodo consente la manipolazione spaziotemporale dell'organello selezionato da permeabilizzare in una cellula. Il metodo CALI è stato applicato per osservare e monitorare molecole specifiche attraverso la permeabilizzazione di endosomi e lisosomi. La rottura della membrana delle flebo è nota per reclutare selettivamente proteine leganti i glicani, come la galectina-3. Qui, il protocollo descrive l'induzione della rottura IV da parte di AlPcS_2a e l'uso della galectina-3 come marcatore per marcare i lisosomi alterati, che è utile nello studio degli effetti a valle della rottura della membrana IV e dei loro effetti a valle in varie situazioni.

Introduzione

Gli endosomi, un tipo di vescicola intracellulare (IV), sono formati dall'endocitosi e poi maturano in lisosomi. Varie vie di segnale intracellulare sono coinvolte nella formazione delle flebo; inoltre, diversi stimoli intrinseci ed estrinseci possono danneggiare le flebo (ad esempio, i patogeni possono sfuggire dalla membrana limitata durante l'infezione ed entrare nel citoplasma¹). Questo di solito è accompagnato dalla rottura delle vescicole endocitotiche². Pertanto, le tecniche per colpire e danneggiare le flebo possono essere utilizzate in studi correlati³.

La terapia fotodinamica (PDT) è una terapia dipendente dalla luce per combattere le malattie uccidendo tumori o agenti patogeni⁴. Nella PDT, le cellule bersaglio sono marcate con cromofori non tossici, chiamati fotosensibilizzatori, che possono essere attivati localmente dall'illuminazione della luce ^5,6. I fotosensibilizzatori assorbono energia dalla luce e si trasformano in uno stato di singoletto eccitato, portando allo stato di tripletta eccitata di lunga durata. I fotosensibilizzatori dello stato di tripletto possono subire un trasferimento di elettroni o energia e formare specie reattive dell'ossigeno (ROS) in presenza di ossigeno e possono distruggere spazialmente le cellule marcate all'interno della regione di illuminazione⁷. La conseguenza varia a seconda della potenza della luce⁸. Controllando la concentrazione di fotosensibilizzatori e l'intensità dell'illuminazione della luce, le biomolecole mirate possono essere inattivate selettivamente senza lisi cellulare, definita come inattivazione della luce assistita da cromofori (CALI)⁹. Con il significativo sviluppo di fotosensibilizzatori in grado di marcare selettivamente vari bersagli subcellulari, CALI è diventato uno strumento prezioso per controllare l'inattivazione mediata dalla luce di biomolecole per piccole biomolecole come nucleotidi e proteine, nonché organelli come mitocondri ed endolisosomi 3,10,11,12,13.

Rispetto al CALI, vengono utilizzati anche metodi chimici o fisici per compromettere le membrane, come la tossina batterica ^14,15 e il trattamento Leu-Leu-OMe¹⁶ per il danno lisosomiale. Tuttavia, questi metodi mostrano una compromissione di massa delle flebo all'interno delle cellule. Fotosensibilizzanti robusti (cioè acido disolfonico cloruro di ftalocianina Al(III) (AlPcS_2a)) sono utilizzati in CALI; AlPcS_2a, che colpisce i lisosomi attraverso l'endocitosi, viene utilizzato per rompere endosomi o lisosomi in una regione controllata¹⁷. AlPcS_2a è un cromoforo a base di ftalocianina impermeabile alla membrana cellulare che si lega ai lipidi sulla membrana plasmatica e viene internalizzato attraverso l'endocitosi e alla fine si accumula all'interno del lisosoma attraverso la via endocitica¹⁸. Assorbe la luce all'interno di una regione spettrale del vicino infrarosso e genera ossigeno singoletto, un importante ROS generato da AlPcS_2a¹⁸ eccitato. Il decadimento dell'ossigeno singoletto limita rapidamente la sua diffusione e distanza di reazione all'interno di una piccola regione nelle cellule (circa 10-20 nm)¹⁹. Regolando la durata dell'incubazione di AlPcS_2a e l'illuminazione della luce, è consentito il controllo spaziotemporale del danno delle flebo all'interno di un'area subcellulare. CALI diventa quindi un potente strumento per esaminare le conseguenze del danno IV e la formazione e la regolazione delle IV.

In questo studio, viene affrontato un protocollo specifico di CALI che utilizza AlPcS_2a come fotosensibilizzatore. Questo protocollo può essere applicato a vari tipi di flebo, inclusi endosomi e lisosomi, e utilizzato per esaminare le risposte di follow-up dopo la rottura della membrana. Le cellule HeLa che esprimono galectina-3 coniugata con fluorofori ^16,20 rivelate dopo la rottura del lisosoma sono utilizzate per dimostrare questo protocollo.

Protocollo

1. Preparazione delle scorte AlPcS_2a

1. Sciogliere 10 mg di AlPcS_2a in 400 μL di 0,1 M NaOH. Per migliorare la solubilità, riscaldare la soluzione a 50 °C e vortice.
2. Mescolare la soluzione con 4 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Quindi, filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 μm per rimuovere i precipitati insolubili.
3. Misurare la concentrazione della soluzione attraverso uno spettrofotometro UV-Vis. Il coefficiente di estinzione di AlPcS_2a a 672 nm è 4 x 10⁴ cm-1 ^M-1. Diluire la soluzione AlPcS_2a con PBS per ottenere una soluzione da 1 mM. Preparare 1 mL di aliquote e conservare a -20 °C.

2. Trasfezione

NOTA: Gal3-GFP viene applicato come indicatore per l'imaging delle cellule vive della rottura lisosomiale.

1. Mantenere la coltura cellulare HeLa in DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS). Dopo aver lavato le cellule con PBS, tripsinizzare le cellule, quindi risospendere le cellule in DMEM integrato con FBS al 10%.
   NOTA: il metodo è applicabile alla maggior parte delle linee cellulari collegate, comprese le linee cellulari HeLa e A549. In linea di principio, nonostante non si verifichino le celle in sospensione, i test CALI potrebbero essere eseguiti con esse.
2. Diluire 300 ng di plasmide Gal3-GFP in 25 μL di mezzo sierico ridotto, quindi aggiungere 0,6 μL di reagente P3000. Mescolare delicatamente. Diluire 0,45 μL di reagente Lipofectamine 3000 in 25 μL di terreno sierico ridotto. Mescolare delicatamente.
3. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Mescolare DNA diluito e Lipofectamine 3000 diluito, quindi incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
4. Mescolare la miscela DNA-Lipofectamina, 3 x 10⁵ cellule HeLa sospese e 200 μL di DMEM + 10% FBS, quindi seminare le cellule sulla regione centrale del vetro di un pulsante di vetro da 35 mm.

3. Colorazione AlPcS2a

1. Per consentire l'attacco della cella, incubare le cellule a 37 °C nell'incubatore alimentato con il 5% di CO₂ per almeno 4 ore.
2. Diluire AlPcS_2a in DMEM integrato con FBS al 10% per ottenere una soluzione di AlPcS_2a da 1 μM. Preriscaldare il mezzo contenente AlPcS_2a a bagnomaria a 37 °C. Sostituire il terreno di coltura con il terreno contenente AlPcS_2a.
3. Incubare le cellule a 37 °C nell'incubatore alimentato con il 5% di CO₂ durante la notte (16-18 h).
4. Il giorno seguente, lavare le cellule due volte con PBS per rimuovere AlPcS2a extracellulare. Sostituire il terreno con terreno fresco, quindi incubare a 37 °C per 4 ore per consentire al colorante residuo lungo la via endocitica di accumularsi nei lisosomi.
   NOTA: Per colorare gli endosomi, incubare le cellule in 1 μM AlPcS_2a in DMEM contenente il 10% di FBS per 15 minuti a 37 °C. Quindi, lavare le cellule due volte con PBS e incubarle in un mezzo preriscaldato prima dell'imaging .

Figura 1. Una figura schematica che rappresenta il danno IV selettivo con AlPcS_2a. La figura mostra gli schemi del danno IV selettivo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2. Colorazione lisosomiale con AlPcS2a. I lisosomi marcati durante la notte con 1 μM AlPcS_2a nelle cellule HeLa sono colorati positivamente con colorante fluorescente verde 50 nM. Barra scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Imaging del campione e illuminazione della luce

NOTA: È possibile eseguire danni IV all'interno di una regione subcellulare di una singola cellula o di tutte le cellule marcate con AlPcS_2a in un piatto di coltura. L'illuminazione di massa dell'intero piatto di coltura consente lo studio quantitativo di questo danno, compresi gli studi biochimici.

1. Manipolare singole cellule danneggiando i lisosomi all'interno di una singola cellula, come descritto di seguito.
   1. Posiziona il piatto di cultura sul palcoscenico di un microscopio confocale. Utilizzare i laser a 488 nm e 561 nm per emozionare GFP e AlPcS2a, rispettivamente.
   2. Cerchiare una regione di interesse (ROI) 5 x 5 μm² sulle vescicole marcate AlPcS_2a selezionate per essere danneggiate.
   3. Pulse illumina il ROI con un laser a 633 nm da 0,21 mW per 70 ripetizioni. Monitorare la formazione di Gal3 puncta come indicatore di permeabilizzazione della membrana lisosomiale.
2. Danneggiare tutte le cellule etichettate in un piatto di coltura come descritto di seguito.
   1. Posiziona il piatto di cultura su una piattaforma. Illuminare il piatto con 660 nm di luce LED collimata (la luce nel vicino infrarosso è la base ideale sullo spettro di eccitazione di AlPcS2a).
   2. Posizionare il piatto di coltura sul microscopio e monitorare gli indicatori di permeabilizzazione della membrana come indicato al punto 4.1.3.
3. Valutare le lesioni delle flebo utilizzando i seguenti indicatori.
   1. Il contenuto dell'endosoma o del lisosoma è più altamente glicosilato, che sono esposti al citosol dopo la rottura IV. Etichettarli rapidamente usando galectine leganti i glicani citosolici, tra cui galectina-1, galectina-3, galectina-8 e galectina-9^16,20.
   2. La dimensione della ferita può essere determinata dal rilascio di colorante impermeabile alla membrana come descritto in²¹.
   3. La differenza tra endosomi e lisosomi è il loro valore di pH luminale. La rottura lisosomiale perturba il pH luminale, che può essere misurato utilizzando coloranti sensibili al pH, come il FITC-destrano³.

Figura 3. Il CALI mediato da AlPcS_2a induce il reclutamento locale di TagRFP-galectina-3 (Gal3) nei lisosomi all'interno della regione di illuminazione. I lisosomi nelle cellule HeLa espresse da TagRFP-galectina-3 sono stati colorati durante la notte con 1 μM AlPcS_2a, seguiti dall'illuminazione focalizzata con luce nel vicino infrarosso (633 nm) all'interno del quadrato giallo. Il segnale AlPcS_2a all'interno del quadrato giallo viene fotosbiancato, accompagnato dalla formazione di TagRFP-galectina-3 puncta. Barra scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati

È stata mostrata una figura schematica che rappresenta il danno IV indotto da AlPcS_2a, inclusi endosoma e lisosoma (Figura 1).

I marcatori disponibili in commercio possono essere utilizzati per determinare le condizioni di colorazione di AlPcS_2a . Ad esempio, AlPcS_2a puncta e colorante fluorescente verde²² colocalizzazione (Figura 2).

La galectina-3 m...

Discussione

AlPcS_2a si lega alla membrana plasmatica, quindi viene internalizzato dall'endocitosi e alla fine si accumula nei lisosomi. AlPcS_2a può quindi essere localizzato nei compartimenti subcellulari regolando la durata dell'incubazione. Una limitazione di questa metodologia è che solo una sottopopolazione di IV potrebbe essere marcata da AlPcS_2a attraverso l'endocitosi perché ci sono molte altre fonti di membrana di IV, come l'apparato ER e di Golgi. Inoltre, la marcatura selettiva di AlPcS

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagente
Al(III) Cloruro di ftalocianina Acido disolfonico (AlPcS2a)	Frontier Scientific	P40632
Piatto di coltura	ibidi	812128-200
Terreno			DMEM integrato con il 10% di FBS e 100 U/mL di penicillina G e 100 mg/mL di streptomicina
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Thermo Fisher Scientific	A4736301
Gal3-GFP plasmide	addgene
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher Scientific	L3000008
LysoTracker verde DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526	colorante fluorescente verde
Piastra alveolare multiparete	perkinelmer	PK-6005550
NaOH	Thermo Fisher Scientific	Q15895
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific 31985070
Penicillina-streptomicina	Gibco	15140163
soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco	21600-069	137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4
Linea cellulare
Linea cellulare HeLa	ATCC	CCL-2	I metodi sono applicabili alla maggior parte delle linee cellulari collegate. Le condizioni devono essere determinate individualmente.
Equipments
0.22 µ m Filtro	Merck	SLGV013SL
Luce LED collimata  (660 nm)	Thorlabs	M660L3-C1 e DC2100	è la base ideale per lo spettro di eccitazione di AlPcS2a.
Microscopia confocale	Carl Zeiss	LSM 780	Per l'imaging a lungo termine è necessario un sistema di incubazione.
Spettrofotometri NanoDrop 2000/2000c	Thermo Fisher Scientific
Luce LED rossa	Tholabs	M660L4-C1