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Articolo metodologico

Somministrazione intracerebroventricolare di metaboliti microbici derivati dall'intestino in topi che si muovono liberamente

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⸱

DOI:

10.3791/63972

⸱

2 giugno 2022

 ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I metaboliti microbici derivati dall'intestino hanno effetti sfaccettati che portano a comportamenti complessi negli animali. Miriamo a fornire un metodo passo-passo per delineare gli effetti dei metaboliti microbici derivati dall'intestino nel cervello attraverso la somministrazione intracerebroventricolare tramite una cannula guida.

Abstract

L'impatto del microbiota intestinale e dei suoi metaboliti sulla fisiologia e sul comportamento dell'ospite è stato ampiamente studiato in questo decennio. Numerosi studi hanno rivelato che i metaboliti derivati dal microbiota intestinale modulano le funzioni fisiologiche mediate dal cervello attraverso intricati percorsi intestino-cervello nell'ospite. Gli acidi grassi a catena corta (SCFA) sono i principali metaboliti derivati dai batteri prodotti durante la fermentazione delle fibre alimentari dal microbioma intestinale. Gli SCFA secreti dall'intestino possono agire in più siti nella periferia, influenzando le risposte immunitarie, endocrine e neurali a causa della vasta distribuzione dei recettori SCFA. Pertanto, è difficile differenziare gli effetti centrali e periferici degli SCFA attraverso la somministrazione orale e intraperitoneale di SCFA. Questo articolo presenta un metodo basato su video per interrogare il ruolo funzionale degli SCFA nel cervello tramite una cannula guida in topi che si muovono liberamente. La quantità e il tipo di SCFA nel cervello possono essere regolati controllando il volume e la velocità di infusione. Questo metodo può fornire agli scienziati un modo per apprezzare il ruolo dei metaboliti derivati dall'intestino nel cervello.

Introduzione

Il tratto gastrointestinale umano ospita diversi microrganismi che colpiscono l'ospite 1,2,3. Questi batteri intestinali possono secernere metaboliti derivati dall'intestino durante il loro utilizzo di componenti dietetici consumati dall'ospite 4,5. È interessante notare che i metaboliti intestinali non metabolizzati nella periferia possono essere trasportati ad altri organi attraverso la circolazione6. Da notare, questi metaboliti secreti possono servire come mediatori per l'asse intestino-cervello, definito come la comunicazione bidirezionale tra il sistema nervoso centrale e l'intestino7. Studi precedenti hanno dimostrato che i metaboliti derivati dall'intestino possono modulare il comportamento complesso e le emozioni negli animali 8,9,10,11.

Gli acidi grassi a catena corta (SCFA) sono i principali metaboliti prodotti dal microbiota intestinale durante la fermentazione della fibra alimentare e dei carboidrati indigeribili6. Acetato, propionato e butirrato sono gli SCFA più abbondanti nell'intestino12. Gli SCFA servono come fonte di energia per le cellule del tratto gastrointestinale. Gli SCFA non metabolizzati nell'intestino possono essere trasportati al cervello attraverso la vena porta, modulando così il cervello e il comportamento 6,12. Studi precedenti hanno suggerito che gli SCFA potrebbero svolgere un ruolo critico nei disturbi neuropsichiatrici 6,12. Ad esempio, l'iniezione intraperitoneale di butirrato nei topi BTBR T + Itpr3tf / J (BTBR), un modello animale di disturbo dello spettro autistico (ASD), ha salvato i loro deficit sociali13. I ratti trattati con antibiotici che ricevevano microbiota da soggetti depressivi hanno mostrato un aumento dei comportamenti ansiosi e degli SCFA fecali14. Clinicamente, sono state osservate alterazioni dei livelli di SCFA fecale nelle persone con ASD rispetto ai controlli tipicamente in via di sviluppo15,16. Le persone con depressione hanno livelli di SCFA fecali più bassi rispetto ai soggetti sani17,18. Questi studi hanno suggerito che gli SCFA possono alterare il comportamento negli animali e negli esseri umani attraverso vari percorsi.

I metaboliti microbici esercitano diversi effetti su più siti nel corpo, influenzando la fisiologia e i comportamenti dell'ospite 4,19, tra cui il tratto gastrointestinale, il nervo vago e il nervo simpatico. È difficile individuare il ruolo preciso dei metaboliti derivati dall'intestino nel cervello quando si somministrano i metaboliti per vie periferiche. Questo articolo presenta un protocollo basato su video per studiare gli effetti dei metaboliti derivati dall'intestino nel cervello di un topo che si muove liberamente (Figura 1). Abbiamo dimostrato che gli SCFA potrebbero essere somministrati acutamente attraverso la cannula guida durante i test comportamentali. Il tipo, il volume e la velocità di infusione dei metaboliti possono essere modificati a seconda dello scopo. Il sito di incannulizzazione può essere regolato per esplorare l'impatto dei metaboliti intestinali in una specifica regione del cervello. Miriamo a fornire agli scienziati un metodo per esplorare il potenziale impatto dei metaboliti microbici derivati dall'intestino sul cervello e sul comportamento.

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Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali e la cura degli animali sono stati approvati dal National Cheng Kung University (NCKU) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Preparazione per l'animale da esperimento

  1. Ottieni topi maschi selvatici C57BL / 6JNarl di 6-8 settimane da un fornitore.
  2. Ospitare i topi in una gabbia per topi standard con mouse chow standard e acqua sterilizzata ad libitum.
    NOTA: Le condizioni di alloggio per il Laboratory Animal Center di NCKU sono 22 ± 1 ° C di temperatura, 55% ± 10% di umidità e un ciclo di luce / buio di 13 ore / 11 ore.

2. Chirurgia stereotassica

  1. Preparare e sterilizzare lo strumento stereotassico, gli strumenti chirurgici e gli oggetti correlati.
    NOTA: Tutti gli articoli che entreranno direttamente in contatto con il sito chirurgico devono essere sterilizzati per evitare l'infezione.
  2. Anestetizzare il topo mettendolo nella gabbia di plexiglas con isoflurano all'1%-5% in ossigeno.
    NOTA: Osservare attentamente il mouse per assicurarsi che la frequenza respiratoria sia mantenuta a circa un respiro al secondo.
  3. Togliere il mouse dalla camera di anestesia. Rasare il sito chirurgico (testa di topo) con un trimmer per animali domestici. Posizionare il mouse sul telaio stereotassico fissando gli incisivi del mouse sulla barra incisiva nel supporto dell'incisivo stereotassico. Coprire il naso con la maschera nasale.
  4. Anestetizzare il topo con isoflurano all'1% -2,5% in ossigeno durante l'intervento chirurgico stereotassico. Valutare la nocicezione del topo attraverso il riflesso del pizzicamento della punta e garantire una frequenza respiratoria costante prima di incidere il sito chirurgico.
  5. Posizionare una piastra riscaldante (37,0 °C) sotto il mouse sul telaio stereotassico per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico. In alternativa, mantenere la temperatura interna con l'aiuto di una sonda termica rettale che collega il riscaldatore programmato e il termoforo.
  6. Rimuovere la pelliccia tagliata sulla testa usando del nastro adesivo. Iniettare nel topo Ketoprofene analgesico (5 mg/kg) per via sottocutanea per alleviare il dolore. Applicare unguento per gli occhi per evitare secchezza oculare.
  7. Inserire la barra auricolare appuntita nel condotto uditivo per fissare la testa.
  8. Centrare la testa regolando la scala della barra auricolare.
  9. Stringere il morsetto del naso sul supporto dell'incisivo per evitare movimenti verticali. Premere delicatamente la testa per verificare che la testa sia fissa ed evitare che la testa si allenti durante l'intervento chirurgico successivo.
  10. Disinfettare il cuoio capelluto con tre scrub alternati di clorexidina usando un batuffolo di cotone. Inizia ogni scrub dal centro verso il lato esterno (dall'area centrale più disinfettata all'area meno disinfettata).
    NOTA: L'uso di scrub dal centro verso l'esterno potrebbe aiutare gli scienziati a ridurre al minimo l'infezione e la contaminazione dalla pelliccia. L'area esterna è vicina alla regione della testa non rasata, che ha ancora una grande quantità di pelliccia e non è facile da disinfettare a fondo.
  11. Incidere il cuoio capelluto in modo anteriore/posteriore (<1 cm) utilizzando una lama chirurgica. Aprire l'incisione e pulire il cranio con un batuffolo di cotone tenuto da una pinza microdissecante.
    NOTA: La pinza microdissecante, la lama chirurgica e i tamponi di cotone devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'intervento chirurgico. Durante il processo chirurgico, sterilizzare tutte le attrezzature chirurgiche utilizzando uno sterilizzatore a perline di vetro (150 °C) per almeno 5 secondi prima e dopo ogni animale. Preparare un becher sterilizzato per contenere la lama chirurgica e la pinza durante il processo chirurgico e tra gli animali.
  12. Identifica il Bregma e la Lambda sul cranio. Utilizzare il Bregma come riferimento per individuare la regione di interesse.
    1. Facoltativo: montare il trapano stereotassico sul supporto del trapano stereotassico e utilizzare la punta del trapano per puntare Bregma come riferimento. Sterilizzare il trapano stereotassico utilizzando lo sterilizzatore a perline di vetro (150 °C) per almeno 5 s.
  13. Calibrare e allineare il piano orizzontale del cranio piatto nei piani sinistro/destro e anteriore/posteriore di Bregma/Lambda.
    NOTA: se non su un piano orizzontale corretto, rimontare il mouse sullo strumento stereotassico.

3. Impianto di cannule guida personalizzata commerciale

  1. Identificare ed etichettare la posizione del ventricolo laterale destro, in base alle coordinate stereotassiche: Distanza da Bregma, anteriore/posteriore (A/P): 0,26 mm, mediale/laterale (M/L): -1,0 mm, dorsale/ventrale (D/V): -2,0 mm20.
    NOTA: Le coordinate possono essere modificate in base alla regione di interesse. Le coordinate per il ventricolo laterale erano basate su topi adulti C57BL / 6J con un intervallo di peso di 26-30 g. Se vengono utilizzati topi più giovani, fare riferimento alla discussione.
  2. Praticare un foro (diametro = 1,5 mm) attraverso il cranio nel sito etichettato utilizzando un trapano stereotassico per l'impianto di una cannula guida commerciale.
  3. Praticare da due a quattro fori in più (diametro = 1,5 mm) sul cranio utilizzando un trapano stereotassico per il montaggio di viti in acciaio inossidabile.
    NOTA: Sterilizzare il trapano stereotassico utilizzando uno sterilizzatore a perline di vetro (150 °C) per almeno 5 secondi prima e dopo ogni animale.
  4. Pulire gli scarti ossei e smettere di sanguinare con un batuffolo di cotone.
  5. Pulire il cranio con Lidocaina (1 mg/kg) usando un batuffolo di cotone per effetti anestetici locali, antipruriginosi e antidolorifici. Se il sanguinamento non si ferma dopo la perforazione, posizionare delicatamente un batuffolo di cotone sul foro per l'emostasi.
  6. Montare da due a quattro viti in acciaio inossidabile sui fori per fornire ancoraggi per acrilico dentale.
  7. Posizionare la cannula guida commerciale sul supporto della cannula stereotassica e disinfettare con lo sterilizzatore a perline di vetro (150 °C).
    NOTA: La cannula guida commerciale, il manichino commerciale e l'iniettore commerciale (Figura 2A) sono stati personalizzati con le specifiche mostrate nella tabella dei materiali.
  8. Spostare il supporto della cannula stereotassica sul foro praticato per il ventricolo laterale e inserire lentamente la cannula di guida commerciale nel foro fino alla profondità desiderata (2,5 mm).
    NOTA: La coordinata dorsale/ventrale può essere definita impostando la punta della cannula di guida commerciale come riferimento quando la punta è appena inserita nel foro.
  9. Applicare 10 μL di adesivo n-butile cianoacrilato (colla adesiva per tessuti) per fissare la cannula guida commerciale nel foro praticato e attendere 3-4 minuti. Rilasciare delicatamente la cannula guida commerciale dal supporto della cannula stereotassica e allontanare il supporto.
  10. Applicare l'acrilico dentale sul cuoio capelluto inciso per fissare la cannula della guida commerciale e attendere almeno 5 minuti. Impiantare il manichino commerciale nella cannula guida commerciale per evitare l'intasamento della cannula da parte del sangue o del fluido corporeo (Figura 2B).
  11. Rilasciare la barra auricolare dal condotto uditivo e rimuovere il mouse dal telaio stereotassico.
  12. Posizionare il topo in una nuova gabbia con una piastra riscaldante sotto per il recupero dall'anestesia e osservare continuamente fino a quando il topo non si risveglia completamente.
    NOTA: Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la recumenza sternale. Un animale che ha subito un intervento chirurgico non dovrebbe tornare in compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
  13. Riportare il mouse in alloggiamento singolo o di gruppo, a seconda del protocollo IACUC istituzionale e del disegno sperimentale. Per gli alloggi di gruppo, assicurarsi che meno topi siano alloggiati in una gabbia per ridurre al minimo le lesioni indesiderate o il distacco della cannula.
  14. Somministrare ibuprofene (0,2 mg/ml) nell'acqua potabile per almeno 3 giorni per le cure postoperatorie e monitorare due volte al giorno i segni di dolore e angoscia per almeno 3 giorni.
    1. Durante la cura postoperatoria, applicare l'unguento alla roxitromicina sulla pelle per prevenire l'infiammazione e l'infezione nei topi.
    2. Continuare a monitorare lo stato dell'animale e somministrare un'iniezione intraperitoneale tempestiva di glucosio al 5% e/o cloruro di sodio allo 0,9% per fornire energia sufficiente.
    3. Se lo stato di dolore, angoscia o infezione si deteriora costantemente, eutanasia il topo per inalazione di CO2 .
  15. Attendere 1 settimana dopo l'operazione affinché il topo sia pronto per la consegna intracerebroventricolare di SCFA e test comportamentali.

4. Preparazione degli SCFA

  1. Sciogliere l'acetato di sodio, il butirrato di sodio e il propionato di sodio nel liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) (vedere la tabella dei materiali).
  2. Assicurarsi che le sostanze chimiche siano completamente sciolte, quindi regolare il pH a 7,4 e filtrare la miscela SCFA attraverso un filtro da 0,22 μm per la sterilizzazione.

5. Impostare il sistema di infusione per la somministrazione intracerebroventricolare di SCFA durante i test comportamentali

  1. Montare una telecamera a soffitto per registrare il comportamento. Collegare la fotocamera a un computer per controllare il software di registrazione video (Figura 3).
  2. Riempire una siringa da 10 μL con acqua distillata.
    NOTA: Evitare bolle d'aria nella siringa da microlitri.
  3. Collegare una pompa di microiniezione con il controller di microiniezione.
  4. Montare la siringa da microlitro sulla pompa di microiniezione. Per installare la siringa, premere il pulsante per allentare il morsetto e installare la siringa nella posizione corrispondente. Chiudere il morsetto e serrare la vite di ritenuta dello stantuffo sulla pompa di microiniezione (Figura 4A).
  5. Inserire l'iniettore commerciale nel tubo di polietilene (Figura 2A).
  6. Appendere il tubo di polietilene alla telecamera a soffitto sopra l'arena di prova.
  7. Riempire il tubo di polietilene con acqua distillata utilizzando una siringa da insulina. Collegare la siringa da microlitri al tubo di polietilene sospeso.
    NOTA: Assicurarsi che il tubo in polietilene sia abbastanza lungo da consentire al mouse di muoversi liberamente in tutta l'arena di prova.

6. Impostazioni di sistema del controller di microiniezione

  1. Accendere il controller di microiniezione e premere Display All Channels (Visualizza tutti i canali) per accedere alla schermata di comando (Figura 4C). Premere Configurazione e impostare Volume Target su 9.800 nL con Delivery Rate su 100 nL/s. Infondere 9.800 nL di acqua distillata dal tubo di polietilene collegato alla siringa da microlitri (premere Direzione per passare alla modalità Infusione e premere RUN) (vedere quadrati rossi nella schermata di comando della Figura 4C).
  2. Premere Configurazione e impostare Volume Target su 3.000 nL con Delivery Rate su 100 nL/s. Prelevare 3.000 nL di olio minerale (premere Direzione per passare alla modalità Prelievo e premere ESEGUI) (vedere i quadrati rossi nella schermata di comando della Figura 4C).
    NOTA: Sul tubo di polietilene deve essere osservata una netta separazione di fase olio-acqua.
  3. Smontare il tubo di polietilene dall'ago della siringa da microlitri. Sputare 3.000 nL di acqua distillata dall'ago della siringa da microlitri (premere Direzione per passare alla modalità Infusione e premere RUN).
  4. Inserire nuovamente la siringa da microlitro nel tubo di polietilene. Premere Configurazione e impostare Volume Target su 9.500 nL con Delivery Rate su 100 nL/s. Prelevare 9.500 nL di SCFA (premere Direzione per passare alla modalità di prelievo e premere RUN). Etichettare la fase degli SCFA dell'olio per verificare se gli SCFA sono stati infusi correttamente.
  5. Premere Configuration e impostare il Volume Target desiderato con Delivery Rate su 7 nL/s. Premere Direzione per passare alla modalità Infuse (vedere i quadrati rossi nella schermata di comando della Figura 4C).
    NOTA: Determinare il volume in base al tempo di infusione. Ad esempio, se il tempo di infusione è di 3 minuti per la velocità di erogazione di 7 nL/s, volume target = 1.260 nL.
  6. Premere RUN per infondere la siringa da microlitro in avanti fino a quando il liquido esce all'estremità anteriore dell'iniettore commerciale prima di inserire l'iniettore nella cannula per l'iniezione di SCFA.

7. Infusione di SCFA nel ventricolo laterale attraverso la cannula guida commerciale nel topo che si muove liberamente

  1. Anestetizzare il topo mettendolo nella gabbia di plexiglas con isoflurano all'1%-5% in ossigeno.
    NOTA: Osservare attentamente il mouse per assicurarsi che la frequenza respiratoria sia mantenuta a circa un respiro al secondo.
  2. Collottola e inserire l'iniettore commerciale nella cannula guida commerciale (Figura 4B).
    NOTA: Se la cannula della guida commerciale è ostruita dal sangue o dal fluido corporeo, aprirla delicatamente con una pinzetta.
  3. Consentire al topo di riprendersi dall'anestesia per 15 minuti in una gabbia prima del test comportamentale.
  4. Per il test di locomozione di base, posizionare il topo in una nuova gabbia e lasciarlo esplorare liberamente per 35 minuti. Infondere SCFA utilizzando una velocità di consegna di 7 nL/s per un volume target di 2.100 nL nei primi 5 minuti (premere Direzione per la modalità di infusione e premere RUN).
    NOTA: La locomozione nella nuova gabbia può essere analizzata utilizzando il software di tracciamento video del comportamento animale21,22.
  5. Anestetizzare il mouse (ripetendo il passaggio 7.1) e rimuovere l'iniettore commerciale dalla cannula della guida commerciale.
    NOTA: Il topo può essere iniettato ripetutamente con diversi controlli/metaboliti dopo aver dato il tempo appropriato per lavare l'iniezione precedente. Finché la cannula è fissata sulla testa del topo, il topo può essere ripetutamente testato con diversi metaboliti.

8. Ripristino del sistema di microiniezione

  1. Smontare il tubo di polietilene dalla siringa da microlitri.
  2. Iniettare aria nel tubo usando la siringa da insulina per eliminare l'acqua distillata nel tubo di polietilene. Svuotare la siringa da microlitri.
  3. Premere Reset Pos nella schermata Configuration (Configurazione per aprire la schermata Syringe Stop Definition ) (Figura 4C).
  4. Premere Ritira fino a quando non si verifica un segnale acustico per ripristinare la pompa di microiniezione nella posizione completamente ritirata (Figura 4C).
  5. Tornare alla schermata di comando e spegnere il controller di microiniezione se è presente un segno ** END REACH** su questa schermata (Figura 4C).

9. Facoltativo: Validazione dell'iniezione intracerebroventricolare mediante tracciante neurale

  1. Infondere 2.100 nL del tracciante neurale con la velocità di erogazione di 7 nL/s per verificare il sito di infusione.
    NOTA: Lasciare l'iniettore nella cannula guida per 5 minuti per evitare il riflusso.
  2. Anestetizzare il topo con un sovradosaggio di isoflurano (5%) 30 minuti dopo l'infusione del tracciante neurale.
  3. Controllare la frequenza respiratoria e il riflesso di pizzicamento coda/zampa nel mouse anestetizzato.
    NOTA: i mouse devono non rispondere prima del passaggio successivo.
  4. Fai un'incisione di 4-5 cm attraverso la pelle, i muscoli e la parete addominale sotto la gabbia toracica.
  5. Allontanare leggermente il fegato dal diaframma con attenzione.
  6. Incidi il diaframma per esporre il cuore del mouse.
  7. Perfondere il topo attraverso il cuore con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e paraformaldeide ghiacciata al 4% in PBS.
  8. Decapitare il topo e sezionare attentamente il cervello con una pinza microdissecante e forbici microdissecanti per eliminare l'intero cervello23. Posizionare i campioni di cervello in paraformaldeide ghiacciata al 4% in PBS per 3-4 giorni e lavarli 3 x 5 minuti con PBS.
  9. Tagliare il cervello in due parti nel supporto della fetta di cervello del topo all'ottavo taglio del supporto della fetta di cervello del topo (1 mm / sezione) dalla direzione anteriore a quella posteriore. Posizionare il cervello nello stampo incorporato e incorporare i campioni di cervello nell'agarosio a basso punto di fusione (4% in PBS).
  10. Incolla il cervello incorporato nell'agarosio sul palco del vibratomo usando la supercolla. Sezionare il cervello coronalmente in fette cerebrali da 50 μm usando il vibratomo.
  11. Incubare le fette di cervello nell'anticorpo che prende di mira il tracciante neurale diluito nel tampone bloccante (diluizione 1:1.000) durante la notte a temperatura ambiente.
    NOTA: il tampone bloccante conteneva il 10% di siero di cavallo, lo 0,1% di Triton X-100 e lo 0,02% di azoturo di sodio.
  12. Lavare le fette 3 x 5 minuti con PBST (PBS con 0,1% triton X-100).
  13. Incubare le fette di cervello in anticorpi secondari coniugati con colorante fluorescenza diluiti in tampone bloccante (diluizione 1:500) per 2 ore a temperatura ambiente.
  14. Lavare le fette 3 x 5 minuti con PBS.
  15. Montare le fette di cervello sul vetrino con un supporto di montaggio contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
  16. Coprire il vetrino con un coprivetrino del microscopio.
  17. Applicare lo smalto sul bordo della slitta per evitare perdite del mezzo di montaggio.
  18. Dopo l'incubazione notturna a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, visualizzare il segnale di fluorescenza nel sito di infusione utilizzando un microscopio a fluorescenza.

10. Facoltativo: infusione di metaboliti attraverso una cannula guida personalizzata in acciaio inossidabile nel ventricolo laterale nei topi

  1. Seguire le sezioni 1-8 del protocollo e sostituire la cannula di guida commerciale con una cannula di guida in acciaio inossidabile per infondere sostanze chimiche attraverso un iniettore in acciaio inossidabile nel mouse.
    NOTA: I pro e i contro delle diverse cannule commerciali e in acciaio inossidabile sono elaborati nella sezione di discussione.
  2. Eseguire il protocollo chirurgico nello stesso modo descritto nelle sezioni 2 e 3 del protocollo, tranne che ricordarsi di sostituire la cannula guida commerciale con una cannula di guida in acciaio inossidabile (Figura 5B).
    NOTA: La cannula di guida in acciaio inossidabile, il manichino in acciaio inossidabile e l'iniettore in acciaio inossidabile (Figura 5A) sono stati personalizzati con le specifiche mostrate nella tabella dei materiali. Inserire la cannula di guida personalizzata in acciaio inox nel foro fino alla profondità desiderata (2,0 mm).
  3. Infondere gli SCFA tramite la cannula di guida in acciaio inossidabile utilizzando il sistema di microiniezione costituito dal controller di microiniezione e dalla pompa di microiniezione (Figura 4B) (come le sezioni 4-7 del protocollo). Per il manichino in acciaio inossidabile della cannula di guida in acciaio inossidabile, piegare delicatamente un lato dell'iniettore in acciaio inossidabile fino a quando la punta dell'altro lato è 1 mm più lunga della cannula di guida in acciaio inossidabile.
  4. Infondere 2.100 nL del tracciante neurale attraverso la cannula guida in acciaio inossidabile nel ventricolo laterale nei topi (come nella sezione 9 del protocollo).
  5. Raccogliere il campione per 30 minuti dopo l'infusione del tracciante neurale (come nella sezione 9 del protocollo).
  6. Eseguire l'acquisizione di immagini nelle fette di cervello infuse con tracciante neurale (come la sezione 9 del protocollo).

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Risultati

Il topo è stato infuso con SCFA 1 settimana dopo il recupero dall'impianto della cannula guida per valutare l'attività locomotoria in una nuova gabbia. Il topo è stato posto in una nuova gabbia e infuso con 2.100 nL di SCFA o ACSF nei primi 5 minuti (velocità di consegna di 7 nL / s) nel cervello attraverso la cannula guida commerciale impiantata nel ventricolo laterale del cervello. L'attività locomotoria in una nuova gabbia è stata registrata per altri 30 minuti dopo l'infusione. Nessuna differenza è stata osservata ne...

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Discussione

I metaboliti derivati dall'intestino sono stati associati a malattie mediate dal cervello senza un meccanismo molto preciso, in parte a causa dei loro molteplici siti di legame nel corpo 6,12,24. Rapporti precedenti hanno indicato che gli SCFA potrebbero servire come ligandi per i recettori accoppiati alle proteine G, regolatori epigenetici e fonti per la produzione di energia in più siti nel corpo 6...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse relativi a questo lavoro.

Ringraziamenti

Riconosciamo il personale del Laboratory Animal Center della National Cheng Kung University (NCKU) per la cura degli animali. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio del Prof. Kun-Yen Huang Education Fund della CHENG-HSING Medical Foundation a C.-W.L.; i fondi del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST) di Taiwan: (Ricerca universitaria MOST 109-2813-C-006-095-B) a T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) a W.-L.W.; e l'Higher Education Sprout Project, Ministero della Pubblica Istruzione alla sede dell'avanzamento universitario presso NCKU a W.-L.W.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiale
Advil Liqui-Gels Ibuprofene solubilizzato A2:D41Pfizern/a
Alexa Fluor 488 asino anti-coniglioThermoFisher ScientificA-21206
Anti-Fluorescent Gold (coniglio policlonale)MilliporeAB153-I
Filtro sottovuoto per bottiglie, 500 mL, 0,22 μ m, PES, nido sterile121921LA01
CaCl2 Sigma-AldrichC1016ACSF: 0,14 g/L
di scrub alla clorexidina 2%PhoenixNDC 57319-611-09
Soluzione di clorexidinaPhoenixNDC 57319-599-09
Manichino commercialeRWD Life Science62004Single_OD 0,20 mm/ M3,5/G = 0,5 mm
Cannul guida commercialeRWD Life Science62104Single_OD 0,41 mm-27G/ M3,5/C = 2,5 mm 
Iniettore commercialeRWD Life Science62204Single_OD 0,21 mm-33G/ Si accoppia con M3,5/C = 3,5 mm/G = 0,5 mm
D-(+)-GlucosioSigma-AldrichG8270ACSF: 0,61 g/L
Acrilico dentaleHYGENICn/a
Viti di fissaggioRWD Life Science62521
Mezzo di montaggio Fluoroshield con DAPIAbcamAB104139
Siero di cavalloThermoFisher Scientific16050130
Siringhe da insulinaBBraunXG-LBB-9151133S-1BX1 mL
di isoflurano Panion & BF biotechDG-4900-250D
KCl Sigma-AldrichP3911ACSF: 0,19 g/L
ketoprofeneSwiss Pharmaceuticaln/a
Lidocaina AstraZenecan/a
Basso punto di fusione agarosioInvitrogen16520
MgCl2 Sigma-AldrichM8266ACSF: 0,19 g/L
Vetrini coprimicroscopioMARIENFELD101242
Vetrini per microscopioThermoFisher Scientific4951PLUS-001E
Olio minerale leggero, bianco NFMacron Fine ChemicalsMA-6358-04
NaCl Sigma-AldrichS9888ACSF: 7,46 g/L
NaH2PO4 Sigma-AldrichS8282ACSF: 0,18 g/L
NaHCO3 Sigma-AldrichS5761ACSF: 1,76 g/L
di adesivo n-butil cianoacrilato (colla adesiva tissutale)3M1469SB3M Vetbond
Neural tracer Santa CruzSC-358883FluoroGold
ParaformaldeideSigma-AldrichP6148
Tubo in polietileneRWD Life Science62329OD 1.50, ID 0.50 mm e OD 1.09, ID 0.38 mm
Puralube Vet (occhio) UnguentoDechra 
Acetato di sodioSigma-AldrichS2889SCFA: 13,5 mM
di azoturo di sodio Sigma-AldrichS2002
Butirrato di sodio Sigma-AldrichB5887SCFA: 8 mM
di propionato di sodio Sigma-AldrichP1880SCFA: 5,18 mM
Cannula guida in acciaio inossidabileChun Ta impresa CO., LTD.n/aOD 0,63 mm; Fornitore locale
Iniettore in acciaio inossidabileChun Ta impresa in acciaio inossidabile CO., LTD.n/aOD 0,3 mm; il manichino è ricavato dall'iniettore; fornitore locale
SupercollaKrazy GlueKG94548R
Triton X-100Merck1.08603.1000
Equipment
Supporto per cannulaRWD Life ScienceB485-68217
Telecamera da soffittoFOSCAMR2
Strumenti stereotassici digitaliStoelting51730D
Microscopio da dissezioneINNOVIEWSEM-HT/TW
Sterilizzatore di perline di vetroRWD Life ScienceRS1501
Pad riscaldanteStoelting53800M
Microscopio Leica LeicaDM2500
Pinza per microdissezioneROBOZRS-5136seghettata, curva leggera; Extra delicato; Larghezza della punta di 0,5 mm; Lunghezza 4"
Forbici per microdissezioneROBOZRS-5918affilato angolato da 4,5"
World Precision Instruments (WPI)MICRO2TController SMARTouch
Pompa a siringa per microiniezioneWorld Precision Instruments (WPI)UMP3T-1UltraMicroPump3   
Siringa da microlitriHamilton8001410 µ L
Fibra ottica Luce fredda con doppia fibra StepLGY-150Fornitore locale
Tagliabordi per animali domesticiWAHL09962-2018
Vaporizzatore per isofluranoStepAS-01Fornitore locale
VibratomeLeicaVT1000S
Software
Video sul comportamento animale software di tracciamentoNoldusEthoVisionVersione: 15.0.1416
Leica Application Suite X softwareLeicaLASXVersione: 3.7.2.22383
di 12920060 Controller per microiniezione

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