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Articolo metodologico

Adipociti di topo differenziati in coltura primaria: un modello di insulino-resistenza

4K visualizzazioni

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DOI:

10.3791/63979

⸱

17 febbraio 2023

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'isolamento dei preadipociti di topo dal grasso sottocutaneo, la loro differenziazione in adipociti maturi e l'induzione della resistenza all'insulina. L'azione dell'insulina viene valutata mediante fosforilazione/attivazione dei membri della via di segnalazione dell'insulina attraverso il western blot. Questo metodo consente la determinazione diretta della resistenza/sensibilità all'insulina negli adipociti primari.

Abstract

La resistenza all'insulina è un effetto ridotto dell'insulina sulle sue cellule bersaglio, di solito derivato dalla diminuzione della segnalazione del recettore dell'insulina. La resistenza all'insulina contribuisce allo sviluppo del diabete di tipo 2 (T2D) e di altre malattie derivate dall'obesità ad alta prevalenza in tutto il mondo. Pertanto, comprendere i meccanismi alla base della resistenza all'insulina è di grande rilevanza. Diversi modelli sono stati utilizzati per studiare la resistenza all'insulina sia in vivo che in vitro; Gli adipociti primari rappresentano un'opzione interessante per studiare i meccanismi di insulino-resistenza e identificare le molecole che contrastano questa condizione e i bersagli molecolari dei farmaci insulino-sensibilizzanti. Qui, abbiamo stabilito un modello di insulino-resistenza utilizzando adipociti primari in coltura trattata con fattore di necrosi tumorale α (TNF-α).

Le cellule precursori degli adipociti (APC), isolate dal tessuto adiposo sottocutaneo sottocutaneo di topo digerito con collagenasi mediante tecnologia di separazione cellulare magnetica, sono differenziate in adipociti primari. La resistenza all'insulina viene quindi indotta dal trattamento con TNF-α, una citochina proinfiammatoria che riduce la fosforilazione/attivazione della tirosina dei membri della cascata di segnalazione dell'insulina. La diminuzione della fosforilazione del recettore dell'insulina (IR), del substrato del recettore dell'insulina (IRS-1) e della proteina chinasi B (AKT) è quantificata dal western blot. Questo metodo fornisce un ottimo strumento per studiare i meccanismi che mediano l'insulino-resistenza nel tessuto adiposo.

Introduzione

L'insulina è un ormone anabolizzante prodotto dalle cellule β delle isole pancreatiche e il regolatore chiave del metabolismo del glucosio e dei lipidi. Tra le sue numerose funzioni, l'insulina regola l'assorbimento del glucosio, la sintesi del glicogeno, la gluconeogenesi, la sintesi proteica, la lipogenesi e la lipolisi1. Il segnale molecolare iniziale dopo l'interazione dell'insulina con il suo recettore (IR) è l'attivazione dell'attività intrinseca della proteina chinasi tirosina di IR2, con conseguente autofosforilazione3 e successiva attivazione di una famiglia di proteine note come substrati del recettore dell'insulina (IRS), che si lega alle proteine adattatrici portando all'attivazione di una cascata di protein chinasi4 . L'insulina attiva due principali vie di segnalazione: fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K)-proteina chinasi B (AKT) e Ras-mitogen-activated protein chinasi (MAPK). Il primo costituisce un importante punto di diramazione o nodo 4,5 per l'attivazione di numerosi effettori a valle coinvolti in diverse funzioni fisiologiche, tra cui la regolazione dell'omeostasi del combustibile, mentre il secondo regola la crescita e la differenziazione cellulare 4,6. Le azioni dell'insulina dipendono in ultima analisi dal tipo di cellula e dal contesto fisiologico7.

Uno dei principali tessuti metabolici insulino-sensibili è il tessuto adiposo. Il tessuto adiposo bianco è il tipo di grasso più abbondante nell'uomo e nei roditori, distribuito all'interno del grasso sottocutaneo (tra la pelle e i muscoli) e del grasso viscerale (intorno agli organi nella cavità addominale). Dato il loro grande volume, gli adipociti o le cellule adipose sono il tipo di cellula più abbondante nel tessuto adiposo. Queste cellule adipose possono essere marroni / beige (termogeniche), rosa (nella ghiandola mammaria) e bianco 8,9. Gli adipociti bianchi mantengono le principali riserve energetiche nel corpo sotto forma di trigliceridi, un processo insulino-dipendente. L'insulina favorisce il trasporto del glucosio e la lipogenesi, mentre inibisce la lipolisi o la degradazione dei lipidi 7,10. Facilita anche la differenziazione dei preadipociti in adipociti - le cellule mature che immagazzinano il grasso11.

La resistenza all'insulina si verifica quando un livello normale di insulina produce una risposta biologica attenuata, con conseguente iperinsulinemia compensatoria12. La resistenza all'insulina è una condizione associata a sovrappeso e obesità5, che quando combinata porta al diabete di tipo 2 (T2D) e ad altre malattie metaboliche13. L'iperinsulinemia compensa la resistenza all'insulina nei tessuti periferici per mantenere normali livelli di glucosio nel sangue14. Tuttavia, l'eventuale perdita o esaurimento delle cellule β, insieme all'esacerbata resistenza all'insulina, porta a livelli elevati di glucosio nel sangue coerenti con T2D5. Pertanto, l'insulino-resistenza e l'iperinsulinemia possono contribuire allo sviluppo di malattie metaboliche derivate dall'obesità15. Inoltre, l'obesità può causare infiammazione locale cronica di basso grado promuovendo la resistenza all'insulina nel tessuto adiposo15,16,17. Inoltre, le alterazioni derivate dall'obesità nel tessuto adiposo, come la fibrosi, l'infiammazione e la riduzione dell'angiogenesi e dell'adipogenesi, portano a livelli sierici di adiponectina più bassi (un sensibilizzante dell'insulina) e ad un aumento della secrezione di fattori come l'inibitore dell'attivatore del plasminogeno 1 (PAI-1), acidi grassi liberi ed esosomi nel flusso sanguigno, esacerbando la resistenza all'insulina17.

Molti aspetti alla base della resistenza all'insulina rimangono sconosciuti. Sono stati sviluppati modelli in vitro e in vivo per studiare i meccanismi che mediano la resistenza all'insulina nei principali tessuti bersaglio, incluso il tessuto adiposo. Il vantaggio dei modelli in vitro è che i ricercatori hanno un maggiore controllo delle condizioni ambientali e possono valutare la resistenza all'insulina in specifici tipi di cellule. In particolare, le cellule precursori degli adipociti (APC) hanno il fenotipo individuale del tessuto donatore, che potrebbe riflettere meglio la fisiologia rispetto alle linee cellulari adipocitarie. Uno dei principali fattori che inducono insulino-resistenza in vitro è il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α). Il TNF-α è una citochina proinfiammatoria secreta dagli adipociti e dai macrofagi nel tessuto adiposo18. Mentre è necessario per il corretto rimodellamento ed espansione del tessuto adiposo19, l'esposizione a lungo termine al TNF-α induce insulino-resistenza nel tessuto adiposo in vivo e negli adipociti in vitro20. Il trattamento cronico con TNF-α di diversi tipi cellulari porta ad un aumento della fosforilazione della serina sia di IR che di IRS-1, promuovendo così una diminuzione della fosforilazione della tirosina21. L'aumento della fosforilazione di IRS-1 sui residui di serina inibisce l'attività della tirosin-chinasi IR e può essere uno dei meccanismi chiave attraverso i quali il trattamento cronico con TNF-α altera l'azione dell'insulina22,23. Il TNF-α attiva vie che coinvolgono l'inibitore della serina/treonina chinasi del fattore nucleare ĸB chinasi β (IKKβ) e della chinasi terminale c-Jun N (JNK)24. JNK induce un complesso programma trascrizionale proinfiammatorio ma fosforila direttamente IRS-16.

Comprendere la patogenesi dell'insulino-resistenza è diventato sempre più importante per guidare lo sviluppo di future terapie contro il T2D. Le APC hanno dimostrato di essere un modello eccellente per lo studio della biologia delle cellule adipose, compresa la sensibilità e la resistenza all'insulina, e per identificare le proprietà intrinseche degli adipociti indipendenti dall'ambiente sistemico. Le APC possono essere facilmente ottenute da diversi depositi adiposi e, nelle condizioni appropriate, differenziate in adipociti maturi. Con questo metodo, gli effetti diretti sulla resistenza/sensibilità all'insulina possono essere valutati negli adipociti.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sui roditori sono stati approvati dal Comitato di Bioetica dell'Istituto di Neurobiologia dell'UNAM, numero di protocollo 075.

1. Isolamento delle cellule precursori degli adipociti di topo

  1. Eutanasia di topi maschi C57BL/6 di 8-10 settimane (ad esempio, per inalazione di CO2 e successiva lussazione cervicale) (quattro animali per isolamento). Disinfettare i topi strofinando con etanolo al 70% e ottenere il tessuto adiposo subito dopo il sacrificio.
    NOTA: Dopo l'eutanasia dei roditori, isolare immediatamente il tessuto adiposo ed eseguire tutti i passaggi all'interno di una cappa a flusso laminare sterile. I topi sono tenuti sotto cicli luce/buio di 12 ore con libero accesso al cibo e all'acqua.
  2. Sezionare il tessuto adiposo sottocutaneo inguinale da ciascun topo. Rimuovere solo il tessuto adiposo, evitando la rimozione di muscoli, pelle o qualsiasi altro tessuto, e raccoglierlo in un tubo conico da 50 ml contenente 15 ml di soluzione di collagenasi di tipo 1 (1,5 mg / ml) su ghiaccio. Sciogliere la collagenasi di tipo 1 nella Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco ad alto glucosio-1% di albumina bovina (BSA) e filtrare attraverso filtri a siringa da 0,2 μm.
  3. Tagliare il tessuto adiposo in piccoli pezzi con forbici chirurgiche sterili e digerire i campioni mediante incubazione con soluzione di collagenasi di tipo 1 a 37 °C in uno shaker orbitale (150 rpm) per 30 minuti (posizionare il tubo contenente grasso e collagenasi in posizione orizzontale per una maggiore superficie di agitazione). Controllare la digestione ogni 10 minuti per assicurarsi che funzioni (la degradazione dei tessuti è visibile) e per prevenire la sovradigestione (vedere Figura supplementare S1).
  4. Filtrare utilizzando una siringa a rete da 200 μm (precedentemente autoclavata) per eliminare il tessuto non digerito con collagenasi. Passare il filtro sul bordo del tubo per drenare il maggior numero possibile di celle nella soluzione. Aggiungere 15 mL di DMEM-1% BSA freddo per interrompere la digestione e centrifugare a 400 × g per 10 minuti a 4 °C.
  5. Aspirare lo strato superiore contenente adipociti maturi e la maggior parte dello strato liquido; Evitare di toccare o disturbare il pellet. Aggiungere 20 ml di siero bovino fetale (FBS) tamponato con fosfato freddo (PBS)-2% e risospendere il pellet. Centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.
  6. Rimuovere il surnatante, aspirando prima lo strato superiore per eliminare i rimanenti adipociti e grasso. Risospendere il pellet in 1 ml di tampone lisante di cloruro di ammonio potassio (ACK) (per lisare i globuli rossi) e incubare su ghiaccio per 5 minuti. Aggiungere 10 mL di PBS-2% FBS, miscelare e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.
  7. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 200 μL di soluzione anti-Fc (CD16/CD32 purificato anti-topo di ratto diluito in PBS-2% FBS [1:150]) per ridurre il legame mediato dal recettore Fc da parte degli anticorpi di interesse. Incubare su ghiaccio per 5 min. Trasferire la sospensione della cella in un tubo da 5 mL che si inserisce nelle rack prerefrigerate di un separatore magnetico e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.
  8. Eliminare il surnatante, aggiungere 200 μL della miscela di CD31(PECAM-1) anticorpo monoclonale (390)-biotina (1:100) e CD45 monoclonale anticorpo (30-F11)-biotina (1:100), mescolare bene e incubare su ghiaccio per 15 minuti (preparare diluizioni anticorpali in soluzione anti-Fc; vedere Tabella 1). Aggiungere 400 μL di PBS-2% FBS e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.
    NOTA: CD31 e CD45 sono marcatori rispettivamente delle cellule endoteliali e delle cellule ematopoietiche.
  9. Aspirare il surnatante e incubare in 100 μL di microsfere anti-biotina (1:5) per 15 minuti su ghiaccio (preparare diluizioni anticorpali in soluzione anti-Fc, vedere Tabella 1). Aggiungere 400 μL di PBS-2% FBS e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.
  10. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 350 μL di PBS-2% FBS. Rimuovere gli aggregati cellulari o le particelle di grandi dimensioni dalle sospensioni a cella singola con un filtro di preseparazione (70 μm). Innanzitutto, attivare il filtro con 100 μL di PBS-2% FBS, passare la sospensione cellulare attraverso il filtro (raccogliere in un tubo pulito) e infine lavare il filtro con 100 μL di PBS-2% FBS.
  11. Eseguire la separazione magnetica delle celle utilizzando la strategia di separazione negativa con un separatore di celle magnetico.
    1. Posizionare il campione nella posizione A del refrigeratore (assicurarsi che il rack sia preraffreddato) e due tubi vuoti in posizione B e C per recuperare rispettivamente le celle non marcate ed etichettate.
    2. Caricare il tampone di lavaggio e il buffer di funzionamento nelle bottiglie corrispondenti prima di accendere l'apparecchiatura. Programmare l'apparecchiatura per eseguire la separazione magnetica delle celle con il protocollo DEPLEME .
      NOTA: Questo protocollo è per l'esaurimento in modalità standard per la rimozione di cellule con espressione dell'antigene normale (in questo caso, cellule etichettate con anti-CD31 e anti-CD45), se il recupero è la massima priorità.
    3. Nella sezione di separazione, selezionare il numero di campioni da separare e selezionare il protocollo DEPLEME. Premere Esegui e avviare la separazione. Al termine del programma, recuperare le cellule non marcate e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.
  12. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL di terreno di coltura (Tabella 1).
  13. Seminare gli APC in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti precedentemente rivestita con una matrice di membrana basale al 2,5% (si ottengono circa 50.000-75.000 cellule). Aggiungere 400 μL di matrice a membrana basale al 2,5% per coprire l'intera superficie di ciascun pozzetto. Immediatamente dopo aver rimosso la soluzione in eccesso e aver lasciato solo un piccolo strato, lasciare asciugare la piastra (senza coperchio) all'interno della cappa a flusso laminare per almeno 1 ora. Incubare a 37 °C in atmosfera al 5% di CO2 . Cambiare il mezzo ogni 48 ore fino a quando le celle raggiungono l'80% di confluenza.
  14. All'80% di confluenza, rimuovere completamente il mezzo e lavare con 350 μL di PBS-2% FBS. Raccogliere le cellule con 350 μL di tripsina-EDTA allo 0,05% per 2 minuti a 37 °C. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura e raccogliere le cellule in un nuovo tubo conico da 50 ml, quindi centrifugare a 400 × g per 5 minuti.
  15. Far passare gli APC su piastre da 12 pozzetti (10.000-20.000 celle per pozzetto) precedentemente rivestite con matrice di membrana basale al 2,5%. Incubare a 37 °C con il 5% di CO2. Cambiare il mezzo ogni 48 ore fino a quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza.
    NOTA: gli APC possono essere passati una sola volta. Successivamente, perdono la loro capacità di proliferare e differenziarsi. Vedere il flusso di lavoro per il processo di isolamento degli APC nella figura supplementare S2.

2. Differenziazione degli adipociti e induzione dell'insulino-resistenza

NOTA: Mantenere le cellule a 37 °C in 5% di CO2 ed eseguire passaggi che comportano il cambiamento del terreno e trattamenti con TNF-α e insulina all'interno di una cappa sterile.

  1. All'80% di confluenza, inizia il processo di differenziazione; aspirare qualsiasi mezzo di crescita e sostituirlo con 500 μL di terreno di differenziazione (Tabella 1) contenente 3,3 nM di proteina morfogenetica ossea (BMP4) in ciascun pozzetto.
  2. Dopo 48 ore, sostituire il mezzo con il mezzo di differenziazione (500 μL per pozzetto) e il cocktail di differenziazione (Tabella 1).
  3. Rimuovere il terreno 72 ore dopo e aggiungere 100 nM di insulina in 500 μL di terreno di differenziazione fresco.
    NOTA: Le cellule iniziano a mostrare un aspetto rotondo con piccole goccioline lipidiche all'interno.
  4. Aspirare qualsiasi mezzo di differenziazione e sostituirlo con 500 μL di semplice mezzo 2% FBS (Tabella 1) 48 ore dopo. Indurre insulino-resistenza con 4 ng/ml di TNF-α. Includere pozzetti di controllo senza trattamento con TNF-α.
  5. Dopo 24 ore di incubazione, aggiungere 4 ng/mL di TNF-α in semplice medio-0% FBS (Tabella 1). Mantenere i pozzetti di controllo senza trattamento con TNF-α.
  6. Attivare la via di segnalazione dell'insulina 24 ore dopo aggiungendo insulina 100 nM e incubare per 15 minuti a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%. Rimuovere il mezzo e lavare con 500 μL di PBS. Includere pozzetti di controllo senza trattamento insulinico.

3. Valutazione della via di segnalazione dell'insulina mediante western blot

  1. Estrazione e quantificazione delle proteine
    1. Lavare ogni pozzetto di cellule con 500 μL di PBS e tenerlo in ghiaccio per lisare le cellule in 50 μL di tampone RIPA (Tabella 1) contenente cocktail di inibitori della proteasi all'1% aggiunti appena prima dell'isolamento del campione. Raschiare l'intera superficie del pozzetto con una punta e trasferire il lisato in una provetta da microcentrifuga da 0,6 mL (tenere in ghiaccio).
    2. Incubare per 1 ora a 4 °C in uno shaker rotante, mescolare a vortice e centrifugare a 8.000 × g per 15 minuti a 4 °C e recuperare il surnatante (mantenere in ghiaccio).
    3. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il saggio di Bradford (non diluire il campione per quantificare).
    4. Prelevare il volume necessario corrispondente a 40-60 μg e denaturare con 6x tampone Laemmli (Tabella 1) incubando a 97 °C per 15 minuti agitando a 550 giri/min. Congelare fino all'uso.
  2. Elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS
    1. Eseguire l'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS (SDS-PAGE) con un gel di poliacrilammide al 7,5% di spessore 1,5 mm. Inserire il gel nel serbatoio e riempire con tampone corrente (Tabella 1).
    2. Aggiungere 3 μL di proteine standard prestained al primo pozzetto del gel e caricare ogni campione nei pozzetti successivi.
    3. Eseguire il gel a 80 V per circa 15 minuti per assicurarsi che il campione entri nella matrice del gel concentratore di poliacrilammide. Successivamente, aumentare la tensione a 90 V per 2,5 ore o fino a quando il marcatore di peso molecolare da 37 kDa può essere visto sul bordo inferiore del gel.
    4. Trasferire le proteine dal gel a una membrana di nitrocellulosa in una camera semi-asciutta per 35 minuti a 25 V. In precedenza, immergere il gel, la membrana e i filtri nel tampone di trasferimento (Tabella 1) per alcuni minuti.
  3. Macchia occidentale
    1. Dopo il trasferimento, lavare la membrana con soluzione salina tamponata Tris (TBS) contenente 0,1% Tween 20 (TBS-T 0,1%) (Tabella 1) per 3 minuti agitando a 30 giri / min.
    2. Bloccare la membrana con soluzione bloccante (Tabella 1) a 4 °C per 1 ora in rotazione costante.
    3. Tagliare la membrana in tre parti secondo il marcatore di peso molecolare per incubare durante la notte con diversi anticorpi primari (diluiti in soluzione bloccante) a 4 °C in rotazione costante: anticorpo Phospho-IRS1 (Tyr608) (1:1.000), banda prevista a 180 kDa; Recettore della fosfo-insulina β anticorpo (Tyr1150/1151) (1:1.000), banda prevista a 95 kDa; Anticorpo Phospho-Akt (Ser473) (1:1.000), banda prevista a 60 kDa.
    4. Lavare le membrane 5 volte per 5 minuti ciascuna con TBS-T 0,1%.
    5. Incubare le membrane con il corrispondente anticorpo secondario accoppiato alla perossidasi (diluito in soluzione bloccante) per 2 ore a temperatura ambiente in rotazione costante: perossidasi affiniPure donkey anti-rabbit IgG (H+L) (1:5.000).
    6. Lavare le membrane 5 volte per 5 minuti ciascuna con TBS-T 0,1%.
    7. Rilevare le proteine utilizzando il sistema di rilevamento a chemiluminescenza. Preparare il substrato secondo le istruzioni del produttore.
    8. Posizionare la macchia in un sacchetto di plastica e aggiungere 200 μL di substrato chemiluminescente per coprire completamente la membrana. Drenare il substrato in eccesso e rimuovere eventuali bolle d'aria.
    9. Esporre ogni macchia per 30-60 s in un sistema di imaging ad alte prestazioni compatibile con la chemiluminescenza.
    10. Spogliare le membrane (passaggi 10-13 della sezione western blot) per rompere le interazioni anticorpo-antigene e quindi consentire alle membrane nitrocellulosa di essere nuovamente cancellate. Recuperare le membrane e lavare 3 volte per 5 minuti ciascuna con TBS-T 1% a 50 giri/min.
    11. Incubare per 7 minuti con 10 ml di 0,2 M NaOH a 50 giri/min.
    12. Lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno con acqua di rubinetto a 50 giri / min.
    13. Lavare per 10 minuti con TBS-T 1% a 50 giri/min.
    14. Ripetere i passaggi 2-9 della sezione western blot per incubare la membrana con tubulina anti-beta (55 kDa) come controllo di carico utilizzando la diluizione 1:1.000.
    15. Eseguire l'analisi densitometrica25 per ogni proteina utilizzando il software ImageJ (https://imagej.nih.gov/).

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Risultati

Negli ultimi anni, l'aumento della prevalenza di obesità e T2D ha stimolato un'intensa ricerca dei meccanismi che mediano l'insulino-resistenza nel tessuto adiposo. Con il protocollo qui descritto, le APC possono essere differenziate in adipociti maturi per valutare la resistenza e la sensibilità all'insulina. Una volta che le APC raggiungono la confluenza, ci vogliono 10 giorni per completare la loro differenziazione in adipociti maturi e la loro induzione di insulino-resistenza mediata da TNF-α (Fi...

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Discussione

Questo articolo fornisce un metodo per studiare la resistenza all'insulina che utilizza adipociti primari in coltura trattata con TNF-α. Questo modello ha il vantaggio che gli adipociti primari possono essere coltivati in condizioni definite per lunghi periodi di tempo con uno stretto controllo dei fattori ambientali cellulari26. La durata del test è di 15-20 giorni, anche se possono verificarsi variazioni nella percentuale di adipociti differenziati tra gli esperimenti. Gli adipociti primari hann...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Ringraziamo Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla e María Antonieta Carbajo per la loro assistenza tecnica, e Jessica Gonzalez Norris per aver curato criticamente il manoscritto. Questo protocollo è stato sostenuto dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (to Y.M.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1. Isolamento delle cellule precursori degli adipociti di topo
LONZA10-548E
Microsfere anti-biotina Miltenyi130-090-485
Anti-CD31eBioscience13-0311-85
Separatore AutoMACS ProMiltenyi
Matrice della membrana basale (matrigel)Corning354234
bFGFSigmaF0291Fattore di crescita
BSAEquitech-Bio, Inc.BAC63-1000
CD45 Anticorpo monoclonale (30-F11) - BiotinaeBioscience13-0451-85
Collagenasi, Tipo 1Worthington BiochemLS004197
DesametasoneSigmaD1756
DMEMGIBCO12800017
DMEM a basso contenuto di glucosioGIBCO31600-034
EGFPeprotech315-09Fattore
di crescita FBSGIBCO26140-079
ITS mixSigmaI3146
Acido L-ascorbico 2-fosfatoSigmaA8960
LIFMilliporeESG1107Fattore di crescita
Acido linoleico-albuminaSigmaL9530
MCDB 201 medioSigmaM6770
NormocinInvivoGenant-nr-2
PDGF-BB Peprotech315-18Fattore di crescita
Penicilina-StreptomicinaBioWestL0022-100
Filtri di pre-separazione (70 µ m)Miltenyi130-095-823
Ratto purificato anti-topo CD16 / CD32 BD Pharmingen553142
Tripsina-EDTA GIBCO25300062
2. Differenziazione degli adipociti e induzione dell'insulino-resistenza
3-Isobutil-1-metilxantina [IBMX]SigmaI5879Cocktail di differenziazione
BMP4R& D Systems5020-BP-010Cocktail di differenziazione
DesametasoneSigmaD1756Cocktail di differenziazione
InsulinaSigmaI9278
RosiglitazoneCayman71742Cocktail di differenziazione
TNFαR& D Systems210-TA-005 
3. Valutazione della via di segnalazione dell'insulina mediante western blot
Anti-beta tubulina anticorpoAbcamab6046
Blu di bromofenoloBioRad161-0404Tampone Laemmli
EDTASigmaE5134Tampone RIPA
EGTASigmaE4378Tampone RIPA
SistemaFluorChem EProteinSimple
GlycerolSigmaG6279Tampone Laemmli
GlycineSigmaG7126Tampone di corsa e trasferimento
IgepalSigmaI3021Tampone RIPA
2- mercaptoetanoloSigmaM3148Tampone Laemmli
MetanoloJT Baker907007Tampone
di trasferimentoNaClJT Baker3624-05TBS-T
NaFSigma77F-0379tampone RIPA
NaOH JT Baker3722-19
Na4P2O7Sigma114F-0762Tampone RIPA
Na3VO4SigmaS6508Tampone RIPA
Membrana in nitrocellulosa BioRad1620112
Latte in polvere scrematoBioRad1706404Soluzione bloccante
Proteine prestate standard BioRad1610395
Cocktail di inibitori della proteasiSigmaP8340-5ML
Perossidasi AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch711-035-132
Recettore della fosfo-insulina &;  Segnalazione cellulare3024
Fosfo-Akt (Ser473) AnticorpoSegnalazione cellulare9271
Fosfo-IRS1 (Tyr608) anticorpoMillipore9432
SaccarosioJT Baker407205tampone RIPA
SDSBioRad1610302Tampone per il funzionamento e il laemmli
SuperSignal West Pico PLUS Substrato chemiluminescenteThermo Scientific34577
Tris-basePromegaH5135Tampone per il funzionamento, il trasferimento e il laemmli
Tris-HClJT Baker4103-02Tampone RIPA - TBS
Tween 20SigmaP1379TBS-T

Riferimenti

  1. Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
  2. Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
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