Colorazione tridimensionale a rene intero con CUBIC

Sommario

Il presente protocollo descrive un metodo di pulizia dei tessuti e una colorazione immunofluorescente a montaggio intero per l'imaging renale tridimensionale (3D). Questa tecnica può offrire prospettive macroscopiche nella patologia renale, portando a nuove scoperte biologiche.

Abstract

Sebbene la patologia convenzionale fornisse numerose informazioni sulla microstruttura renale, era difficile conoscere la struttura precisa dei vasi sanguigni, dei tubuli prossimali, dei dotti collettivi, dei glomeruli e dei nervi simpatici nel rene a causa della mancanza di informazioni tridimensionali (3D). La compensazione ottica è una buona strategia per superare questo grande ostacolo. Più cellule in un intero organo possono essere analizzate alla risoluzione di una singola cellula combinando la pulizia dei tessuti e la tecnica di imaging 3D. Tuttavia, i metodi di etichettatura cellulare per l'imaging dell'intero organo rimangono sottosviluppati. In particolare, la colorazione dell'intero organo è difficile a causa della difficoltà nella penetrazione degli anticorpi. Il presente protocollo ha sviluppato una colorazione renale di topo a montaggio intero per l'imaging 3D con il metodo di pulizia dei tessuti CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). Il protocollo ha permesso di visualizzare la denervazione simpatica renale dopo danno da ischemia-riperfusione e glomerulomegalia nella fase iniziale della malattia renale diabetica da un punto di vista completo. Pertanto, questa tecnica può portare a nuove scoperte nella ricerca sui reni fornendo una prospettiva macroscopica.

Introduzione

Il rene è composto da varie popolazioni cellulari. Sebbene la patologia convenzionale ci fornisca molte informazioni sul microambiente renale, è necessaria l'imaging tridimensionale (3D) per comprendere con precisione la diafonia intercellulare durante la progressione della malattia renale. In passato, era necessario eseguire un numero enorme di sezionamenti seriali e ricostruzione delle immagini per l'imaging 3D dell'intero organo¹. Tuttavia, questo metodo richiedeva troppo sforzo e presentava problemi in termini di riproducibilità.

La compensazione ottica è una buona strategia per superare questo ostacolo ^2,3. L'opacità tissutale è dovuta principalmente alla diffusione e all'assorbimento della luce perché ogni organo è costituito da varie sostanze, tra cui acqua, proteine e lipidi. Pertanto, la strategia di base della pulizia dei tessuti consiste nel sostituire l'acqua e i lipidi nei tessuti con reagenti corrispondenti all'indice di rifrazione (RI) che hanno le stesse proprietà ottiche delle proteine⁴. Per osservare un campione trasparente, è utile una microscopia fluorescente a foglio di luce⁵. I fogli luminosi illuminano il campione trasparente dal lato e i segnali di eccitazione vengono acquisiti attraverso la lente dell'obiettivo situata in posizione verticale⁶. Questa microscopia ottiene informazioni di sezione trasversale in un singolo sweep, che è diverso dalla microscopia fluorescente confocale o multifotone. Pertanto, può acquisire rapidamente immagini z-stack con un basso livello di photobleaching.

Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) è uno dei metodi di pulizia dei tessuti che consente l'imaging dell'intero organo mediante microscopia fluorescente a foglio luminoso ^2,7,8. La colorazione immunofluorescente CUBIC e a montaggio intero è ottimizzata nel presente studio per visualizzare le strutture 3D del rene di topo 9,10,11. Utilizzando questo metodo di colorazione a montaggio intero, l'alterazione dei nervi simpatici renali viene visualizzata dopo il danno da ischemia-riperfusione 9,10 e la glomerulomegalia nella fase iniziale della malattia renale diabetica ¹¹, così come i vasi sanguigni^, i tubuli prossimali e i dotti collettori in un rene intero⁹.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Institutional Review Board dell'Università di Tokyo. Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo le linee guida del National Institutes of Health. Topi maschi C57BL / 6NJcl, di 8 settimane, sono stati utilizzati per il presente studio. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione animale e fissazione dei reni

1. Eseguire la fissazione della perfusione seguendo i passaggi seguenti.
   1. Anestetizzare il topo per inalazione di isoflurano (3%, 2,0 L/min) e somministrazione intraperitoneale di medetomidina cloridrato (0,3 mg/kg), butorfanolo tartrato (5 mg/kg) e midazolam (4 mg/kg) (vedere Tabella dei materiali).
   2. Perfondere l'animale con 20 mL di PBS (pH 7,4) e 30 mL di PFA al 4% in tampone fosfato (PB) attraverso il ventricolo sinistro del cuore¹².
2. Eseguire la fissazione per immersione subito dopo la fissazione della perfusione e il prelievo renale⁹.
   1. Immergere il rene in PFA al 4% a 4 °C per altre 16 ore, quindi lavarlo con PBS per 2 ore (tre volte)⁹ (Figura 1).
      ATTENZIONE: Formaldeide e paraformaldeide sono irritanti tossici. Maneggiare i reagenti in una cappa aspirante con adeguati dispositivi di protezione individuale.

2. Decolorazione e delipidazione

1. Preparare CUBIC-L per la decolorazione e la delipidazione costituito dal 10% in peso di Triton X-100 e dal 10% in peso di N-butildietanolammina (vedere Tabella dei materiali), seguendo i rapporti precedentemente pubblicati ^4,8,9.
2. Eseguire la decolorazione e la delipidazione mediante CUBIC-L seguendo i passaggi seguenti.
   1. Immergere il rene fisso in 7 mL di 50% (v/v) CUBIC-L (miscela 1:1 di acqua e CUBIC-L) in un tubo inferiore rotondo da 14 mL (vedi Tabella dei materiali) agitando delicatamente a temperatura ambiente per 6 ore (Figura 2A). Quindi, immergerlo in 7 ml di CUBIC-L in un tubo inferiore rotondo da 14 mL agitando delicatamente a 37 °C per 5 giorni.
   2. Aggiornare CUBIC-L ogni giorno durante questo processo. Dopo il processo di decolorazione e delipidazione, lavare il rene con PBS a temperatura ambiente per 2 ore (tre volte)⁹ (Figura 1). Utilizzare un cucchiaio dosatore per la manipolazione del campione (Figura 2B).

3. Colorazione immunofluorescente a montaggio intero

1. Preparare i tamponi di colorazione.
   1. Preparare il tampone colorante per gli anticorpi primari mescolando lo 0,5% (v / v) Triton X-100, lo 0,5% di caseina in PBS e lo 0,05% di azoturo di sodio⁹.
   2. Preparare il tampone colorante per gli anticorpi secondari mescolando lo 0,5% (v/v) di Triton X-100, lo 0,1% di caseina in PBS e lo 0,05% di azoturo di sodio⁹.
2. Eseguire la colorazione con anticorpi primari.
   1. Immunocolorare il rene delipidizzato con anticorpi primari (1:100 o 1:200, vedere Tabella dei materiali) nel tampone colorante a 37 °C agitando delicatamente per 7 giorni.
      NOTA: La quantità di tampone colorante necessaria per un rene è 500-600 μL (Figura 2C).
   2. Lavare il rene con Triton X-100 allo 0,5% (v/v) in PBS (PBST) a temperatura ambiente per 1 giorno⁹ (Figura 1).
3. Eseguire la colorazione con anticorpi secondari.
   1. Immunocolorare il rene con anticorpi secondari (1:100 o 1:200, vedere Tabella dei materiali) nel tampone colorante a 37 °C agitando delicatamente per 7 giorni. Lavare il rene con PBST a temperatura ambiente per 1 giorno⁹ (Figura 1).
   2. Dopo la fissazione⁹, immergere il rene in formaldeide all'1% in PB (miscela 1:36 di formaldeide al 37% e PB) per 3 ore e lavarlo con PBS a temperatura ambiente per 6 ore (Figura 1).

4. Corrispondenza dell'indice di rifrazione (RI)

1. Preparare CUBIC-R+.
   1. Preparare CUBIC-R miscelando il 45% in peso di 2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolone/antipirina e il 30% in peso di nicotinamide (vedere Tabella dei materiali).
   2. Preparare CUBIC-R+ per la corrispondenza dell'indice di rifrazione (RI) aggiungendo 0,5 v% di N-butildietanolammina a CUBIC-R seguendo i rapporti precedentemente pubblicati ^4,8,9.
2. Eseguire la corrispondenza RI.
   1. Immergere il rene in 7 mL di CUBIC-R+ (miscela 1:1 di acqua e CUBIC-R+) in un tubo inferiore rotondo da 14 mL agitando delicatamente a temperatura ambiente per 1 giorno. Quindi, immergerlo in 7 ml di CUBIC-R+ in un tubo inferiore rotondo da 14 ml agitando delicatamente a temperatura ambiente per 2 giorni⁹ (Figura 1).
      NOTA: Sebbene il rene fluttui nel 50% di CUBIC-R+ all'inizio della corrispondenza RI, affonda e diventa trasparente in CUBIC-R+ alla fine del processo (Figura 2D).

5. Acquisizione e ricostruzione delle immagini

1. Immergere il rene corrispondente a RI in una miscela di olio di silicio (RI = 1.555) e olio minerale (RI = 1.467) (55:45) durante l'acquisizione dell'immagine (RI = 1.51)⁵ (Figura 3).
2. Acquisire immagini 3D dell'intero rene con un microscopio fluorescente a⁹ fogli di luce personalizzato (vedi Tabella dei materiali). Raccogliete tutti i dati delle immagini raw in un formato TIFF a 16 bit. Visualizza e cattura le immagini renderizzate in 3D con il software di analisi delle immagini (Imaris, vedi Tabella dei materiali).

Risultati

Utilizzando questo metodo di colorazione, sono stati visualizzati i nervi simpatici [anticorpo anti-tirosina idrossilasi (TH)] e le arterie [anticorpo anti-α-actina del muscolo liscio (αSMA)] in un rene intero (Figura 4A, B e Video 1). Sono stati visualizzati anche nervi simpatici renali anomali dopo ischemia/danno da riperfusione (IRI)^9,10 (Figura 4C

Discussione

Il presente protocollo ha permesso l'imaging 3D dell'intero rene di varie strutture come nervi simpatici, dotti collettivi, arterie, tubuli prossimali e glomeruli 9,10,11. Questo metodo di colorazione ha offerto un'osservazione macroscopica e ha portato a nuove scoperte biologiche, visualizzando l'alterazione dei nervi simpatici renali dopo danno da ischemia-riperfusione ^9,10 e glomerulomegalia...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta in PP ad alta trasparenza a fondo rotondo da 14 ml	Falcon	352059	Chiarimento, colorazione, lavaggio
2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolone/antipirina	Tokyo Chemical Industry	D1876	CUBIC-R+
37%-Soluzione di formaldeide	Nacalai Tesque	16223-55	Post fissazione
4%-Paraformaldeide Phosphate Soluzione tampone	Nacalai Tesque	09154-85	Fissazione dei reni
Alexa Flour 555-coniugato asino anti-pecora Anticorpo IgG	Invitrogen	A-21436	Anticorpo secondario (1:100)
Alexa Flour 647-coniugato asino anti-coniglio Anticorpo IgG	Invitrogen	A-31573	Anticorpo secondario (1:200)
Anticorpo anti-acquaporina 2 (AQP2)	Abcam	ab199975	Anticorpo primario (1:100)
Anticorpo anti-podocina	Anticorpo primario Sigma-Aldrich	P0372	(1:100)
Anticorpo anti-cotrasportatore di glucosio sodio 2 (SGLT2)	Abcam	ab85626	Anticorpo primario (1:100)
Anticorpo anti-tirosina idrossilasi (TH)	Abcam	ab113	Anticorpo primario (1:100)
Anticorpo anti-actina muscolare liscia (&alfa;-SMA)	Abcam	ab5694	Anticorpo primario (1:200)
Caseina bloccante in PBS	Thermo Fisher Scientific	37528	Tampone di colorazione
Butorphanolo Tartrato	Meiji 005526		Anestetico
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	N/A	Ceppo di topo
Imaris	Bitplane	N/A	Software di analisi di imaging
Microscopio macro-zoom	OLYMPUS	MVX10	L'unità di osservazione del microscopio su misura
Medetomidina cloridrato	Kyoritsu-Seiyaku	008656	Anestetico
Midazolam	SANDOZ	27803229	Olio minerale anestetico
	Sigma-Aldrich	M8410	Olio da immersione
N-butildietanolammina	Tokyo Industria chimica	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
Nicotinamide	Tokyo Industria chimica	N0078	CUBIC-R +
Polietilenglicole mono-p-isoottilfenil etere / Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
Olio siliconico HIVAC-F4	Shin-Etsu Chemical	50449832	Olio da immersione
Azoturo di sodio	Wako	195-11092	Tampone di colorazione