Gli organoidi cerebrali offrono opportunità senza precedenti per lo studio dello sviluppo degli organi e della patologia delle malattie umane. Sebbene sia stato ottenuto un grande successo con i sistemi di coltura di organoidi cerebrali, ci sono ancora difficoltà operative nell'applicazione di questa tecnologia. Il presente protocollo descrive una procedura organoide cerebrale che facilita il cambiamento del mezzo e il trasferimento degli organoidi.
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Articolo metodologico
Facilitare la coltura di organoidi cerebrali tramite illuminazione laterale a luce soffusa
In questo articolo
Sommario
Abstract
Allo stato attuale, la tecnologia di coltura degli organoidi cerebrali è ancora complicata da utilizzare e difficile da applicare su larga scala. È necessario trovare una soluzione semplice e pratica. Pertanto, nel presente studio viene proposto un protocollo organoide cerebrale più fattibile. Per risolvere l'inevitabile inconveniente nel cambio del mezzo e nel trasferimento degli organoidi nella fase iniziale, la ricerca attuale ottimizza la tecnologia operativa applicando il principio ingegneristico. Una lampada a luce morbida è stata adottata per illuminare lateralmente i campioni del corpo embrionale (EB), consentendo agli EB di essere visti ad occhio nudo attraverso l'effetto di riflessione diffusa potenziato. Utilizzando il principio del flusso secondario generato dalla rotazione, gli organoidi si raccolgono verso il centro del pozzo, il che facilita l'operazione di cambio medio o trasferimento organoide. Rispetto alla cellula dispersa, il corpo embrioide si deposita più velocemente nella pipetta. Utilizzando questo fenomeno, la maggior parte delle cellule libere e dei frammenti di cellule morte possono essere efficacemente rimossi in modo semplice, impedendo agli EB di incorrere in danni da centrifugazione. Questo studio facilita il funzionamento della coltura di organoidi cerebrali e aiuta a promuovere l'applicazione di organoidi cerebrali.
Introduzione
Rispetto ai sistemi di coltura bidimensionali (2D), i sistemi di coltura tridimensionali (3D) presentano diversi vantaggi, tra cui la replica autentica e la riproduzione efficiente di strutture complesse di alcuni organi1. Pertanto, gli organoidi cerebrali sono uno degli importanti metodi ausiliari per i campi di ricerca dello sviluppo del cervello umano e della malattia2, dello screening farmacologico e della terapia cellulare.
La coltura di organoidi cerebrali con il metodo della sospensione rotante favorisce il loro sviluppo e la loro maturazione3. Sebbene i sistemi ....
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Protocollo
Il protocollo è stato condotto a seguito della Dichiarazione di Helsinki. L'approvazione è stata concessa dal Comitato Etico del Terzo Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina di Guangzhou (Revisione medica ed etica [2021] n. 022). Prima dell'esperimento, ogni mezzo è stato preparato secondo la formula12 di Juergen A. Knoblich (tabelle supplementari 1-4), oppure è stato utilizzato un kit di organoidi cerebrali disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali). Le iPSC utilizzate in questo studio sono state precedentemente stabilite dal nostro laboratorio e hanno ottenuto un'esenzione informata. Le SCA....
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Risultati
Il presente studio ha indotto iPSC (Figura 2B) in organoidi cerebrali (Figura 2C). Gli EB coltivati nella fase iniziale esprimevano il marcatore OCT4 (Figura 2A), che indicava una buona pluripotenza. Nella fase successiva, gli EB si sono sviluppati in organoidi cerebrali maturi (Figura 2D). La ricerca ha coltivato iPSC da individui sani normali e pazienti SCA3 in organoidi cerebrali (
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Discussione
Gli organoidi cerebrali aprono nuove strade per la ricerca medica. Molte applicazioni utili di questa tecnologia stanno solo iniziando ad essere esplorate28. Questa ricerca ha scoperto che i risultati del sequenziamento del trascrittoma di organoidi cerebrali geneticamente malati e normali organoidi cerebrali possono riflettere le differenze tra malattia e salute. Ad esempio, i risultati dell'analisi dei dati RNA-seq (Figura 3B) sono coerenti con molti studi riportati.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato dalla Natural Science Foundation della provincia del Guangdong (grant n. 2020A0505100062), dal Guangzhou City Science and Technology Key Topics Project (Grant No. 201904020025), dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31872800, 32070582, 82101937) e dal guangzhou City Postdoctoral Research Grant project (a Bangzhu Chen).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,2 μ m Filtro | NEST Biotechnology, Cina | 331001 | |
| 1000 μ L puntale per pipette a foro largo | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μ L punta per pipetta a foro largo | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Merck, Germania | 8057400005 | |
| 4% di paraformaldeide | Servicebio, Cina | G1101 | |
| Piastra a 6 pozzetti a bassa adesione | NEST Biotechnology, Cina | 703011 | Viene utilizzato per le colture di sospensioni EB |
| Soluzione di distacco cellulare Aaccute | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | Viene utilizzato per digerire le iPSC in singole cellule. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Piastra di coltura microporosa per la preparazione di EBs. |
| Soluzione di risciacquo antiaderente | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Soluzione di risciacquo per colture per prevenire l'adesione cellulare |
| B27-vit. Un integratore | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, Cina | ST025 | |
| Centrifuga | Eppendorf, Germania | 5810 R | Può essere utilizzato per la centrifugazione di vari tipi di provette da centrifuga, flaconi di reagenti e piastre di lavoro. |
| Attrezzatura da laboratorio Shitai | in vetro di copertura | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, Cina | C1002 | Utilizzato per la colorazione nucleare. Dopo che DAPI è stato combinato con DNA a doppio filamento, la lunghezza d'onda massima di eccitazione era di 364 nm e la lunghezza d'onda massima di emissione era di 454 nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| qualità ES FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico secondo il metodo Ficoll-Paque. |
| Gelatina | Sangon Bioteach, Cina | A609764 | |
| Integratore di Glutamax | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Integratore di Glutamax | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Anticorpo secondario IgY di Capra | Abcam, Regno Unito | ab150171 | IgG anti-Pollo di capra. Coniugazione: Alexa Fluor 647. Es: 652 nm, Em: 668 nm. Utilizzare alla diluizione 1:500. |
| Anticorpo secondario IgG di capra Abcam | , Regno Unito | ab150120 | IgG anti-topo di capra. Coniugazione: Alexa Fluor 594. Es: 590 nm, Em: 617 nm. Utilizzare alla diluizione 1:500. |
| Anticorpo secondario IgG anti-coniglio di capra | Abcam, Regno Unito | ab150077 | IgG anti-coniglio di capra. Coniugazione: Alexa Fluor 488. Es: 495 nm, Em: 519 nm. Utilizzare alla diluizione 1:500. |
| Eparina | Merck, Germania | H3149 | |
| Agitatore orizzontale | Servicebio, Cina | DS-H200 | La forza centrifuga relativa (RCF) di 0,11808 x g è più appropriata, secondo il produttore INFORS HT (Svizzera). |
| Insulina | Merck, Germania | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel solidificherà nell'ambiente a una temperatura superiore a 4 gradi C, quindi dovrebbe essere sottoimballato a bassa temperatura. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | Integratore di N2 per terreno di coltura iPSC |
| Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | ||
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| anticorpo primario OCT4 | Abcam, UK | ab19857 | Ospite: Coniglio. Sciogliere con 500 μ L PBS. Utilizzare in diluizione 1:200. |
| Affettatrice congelata patologica | Leica, Germania | Leica CM1860 | |
| PAX6 anticorpo primario | Abcam, Regno Unito | ab78545 | Ospite: Topo. Utilizzare in diluizione 1:100. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillina-Streptomicina | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| Soluzione di dissociazione PSC | Beijing Saibei Biotechnology, Cina | CA3001500 | La soluzione di dissociazione priva di enzimi può essere utilizzata per la digestione e il passaggio di iPSC. |
| Kit di riprogrammazione Sendai | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Stabilire iPSC secondo il protocollo del kit di riprogrammazione Sendai. |
| Vetrino | Shitai Laboratory Equipment, Cina | 188105W | |
| Lampada a luce soffusa | NUT | NUT | Un semplice dispositivo autocostruito, fare riferimento alla figura supplementare 2 per la preparazione. |
| Kit di organoidi cerebrali STEMdiff STEMCELL | Technologies, Canada | 8570 | Contengono: 1. Terreno di formazione EB; 2. Mezzo di induzione; 3. Mezzo di espansione; 4. Mezzo di maturazione. |
| Kit di maturazione degli organoidi cerebrali STEMdiff STEMCELL | Technologies, Canada | 8571 | Media di maturazione |
| Saccarosio | Sangon Bioteach, Cina | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germania | X100 | |
| TUJ1 anticorpo primario | Abcam, Regno Unito | ab41489 | Ospite: Pollo. Utilizzare alla diluizione 1:1000. |
| Vaselina | Sangon Bioteach, Cina | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Preparare una soluzione madre da 5 mM in PBS, risospendere 1 mg in 624 & micro; L di PBS. |
| Weblink | |||
| Dati grezzi di sequenziamento | Archivio delle sequenze del genoma (Genomica, Proteomica & Bioinformatica 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of | Sciences GSA-Human: | HRA002430 https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
Riferimenti
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature.
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Ristampe e permessi
