Test di adesione ed invasione di Agar in S. cerevisiae

Sommario

Descriviamo un test qualitativo per l'adesione lievito e l'invasione agar come misura di differenziazione invasiva e pseudohyphal. Questo semplice test può essere utilizzato per valutare il fenotipo invasivo di vari mutanti così come i segnali effetti ambientali e vie di segnalazione sulla differenziazione lievito.

Abstract

I lieviti si trovano in biofilm naturali, dove molti microrganismi colonizzano superfici. In ambienti artificiali, come le superfici di oggetti artificiali, biofilm può ridurre la produttività industriale, distruggere le strutture, e minacciano la vita umana. 1-3 D'altra parte, sfruttando la potenza dei biofilm può aiutare a pulire l'ambiente e la produzione di energia sostenibile. 4-8 La capacità di S. cerevisiae per colonizzare superfici e partecipare a biofilm complesso è stato per lo più ignorata fino alla riscoperta dei programmi di differenziazione attivati ​​da varie vie di segnalazione e stimoli ambientali in questo organismo. 9, 10 L'interesse di continuare ad utilizzare S. cerevisiae come organismo modello per comprendere l'interazione e la convergenza delle vie di segnalazione, come il Ras-PKA, MAPK Kss1 e Hog1 percorsi osmolarità, messo rapidamente S. cerevisiae nella giunzione di biofilm la biologia e la trasduzione del segnale di ricerca. 11-20 A tal fine, la differenziazione delle cellule di lievito in lungo, adesivi, filamenti pseudohyphal divenne una lettura utile per l'attivazione di vie di trasduzione del segnale su vari cambiamenti ambientali. Tuttavia, filamentazione è una raccolta di fenotipi complessi, il che rende il saggio di esso come se fosse un fenotipo semplice fuorviante. Negli ultimi dieci anni, alcuni saggi sono stati adottati con successo da studi biofilm batterici alla ricerca di lievito, come ad esempio la formazione MAT test per misurare la diffusione colonie su agar morbido e colorazione viola di cristallo per misurare quantitativamente superficie cellulare aderenza. 12, 21 Tuttavia, c'è stata una certa confusione nei test sviluppato per valutare qualitativamente i fenotipi adesivo e invasiva di lievito in agar. Qui, vi presentiamo un metodo semplice e affidabile per valutare la qualità adesiva e invasiva di ceppi di lievito di facile comprensione passi per isolare la valutazione di adesione dalla valutazione invasione. Il nostro metodo, adottato da studi precedenti, 10, 16 coinvolge le cellule crescono in mezzi liquidi e placcatura sul differenziale condizioni nutrienti per la crescita di grandi macchie, che poi lavare con acqua per valutare l'adesione e strofinare le cellule completamente dalla superficie agar per valutare l'invasione in l'agar. Si eliminano la necessità di striature cellule su agar, che colpisce l'invasione delle cellule in agar. In generale, abbiamo osservato che ceppi aploidi che invadono agar sono sempre adesivo, ma non tutti i ceppi adesivo può invadere il terreno di coltura. Il nostro approccio può essere utilizzato in combinazione con altri test per analizzare con attenzione i passi differenziazione e le esigenze della trasduzione del segnale di lievito, la differenziazione, quorum sensing, e formazione di biofilm.

Protocollo

1. Mettere 200ul di culture crescente di interessi sul sintetico piastre media con le condizioni di fame richiesti (SC con 2% di glucosio rispetto a SC di 0,2% di glucosio, per esempio) Se la densità di culture sono troppo diverse l'una dall'altra, regolare conteggio delle cellule per coltura 200ul così ogni goccia ha all'incirca la stessa quantità di cellule.
2. Assicurati di tenere un registro di cui goccia sui piatti che è la cultura.
3. Tenere socchiusa la piastra coperchio e lasciare a temperatura ambiente oa 30 ° C fino gocce sono asciutti.
4. Piastre di tenuta con parafilm e guaina plastica (opzionale) e lasciare a 30 ° C per 3-7 giorni.

Discussione

Cellule di lievito differenziazione diverse modalità di visualizzazione a seconda della disponibilità di nutrienti e condizioni ambientali, compresa la formazione di spore in condizioni di fame e di stress, filamentazione sotto varie sollecitazioni dei nutrienti, e flocculazione. Lieviti, tra cui S. cerevisiae e C. albicans, si possono trovare anche nel biofilm formato da un insieme diversificato di microrganismi. Anche se vi è una certa correlazione con filamentazione e comportamento invasivo, non è chiaro esattamente come filamentazione p.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Moticam 350	Telecamera	Motic	fuori produzione (nuovo modello: Moticam 352)	Una telecamera relativamente economica che si collega agli oculari dei microscopi e acquisisce immagini digitali per PC o Mac.