Il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) ha approvato tutti i protocolli sperimentali e gli animali sono stati trattati in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Per questo protocollo sono stati utilizzati suini maschi o femmine di 3-4 mesi di 3-4 mesi del peso di 50-60 kg. Le dimensioni degli animali possono variare in base agli obiettivi sperimentali dei ricercatori.
1. Preparazione animale e induzione anestetica
- Premedicare l'animale usando un'iniezione intramuscolare di atropina (0,04 mg/kg), midazolam (0,3 mg/kg) e ketamina (20 mg/kg). Somministrare isoflurano ad una concentrazione corrente finale dell'1%-3% in 3 L/min O2, utilizzando una maschera facciale per l'induzione e il mantenimento dell'anestesia.
- Confermare un'anestesia adeguata testando un tono rilassato della mascella e l'assenza di dolore usando la risposta al pizzico della punta. Assicurarsi che l'animale sia posto in posizione di decubito dorsale e mantenuto in normotermia usando una coperta riscaldante.
- Dopo aver confermato l'adeguatezza anestetica, eseguire un'intubazione orotracheale utilizzando un tubo endotracheale di 6,5-8 mm come descritto al punto 10.
- Posizionare il monitor di saturazione dell'ossigeno sull'orecchio o sul labbro inferiore dell'animale per un monitoraggio continuo. Regolare la ventilazione a una pressione positiva di fine espirazione (PEEP) di 5 cm H 2 O, una pressione inspiratoria di picco (PIP) di 15 cm H 2 O, una frazione di ossigeno inspirato (FIO 2) di 0,5 e una frequenza respiratoria (RR) di 15 respirazioni / min che raggiunge un volume corrente (TV) di 6-8 ml / kg e una normale pressione parziale di O 2 e CO 2. Regolare l'RR per mantenere un livello di CO2 di fine marea di 35-45 mmHg.
- Ottenere un accesso endovenoso periferico attraverso la vena dell'orecchio utilizzando un catetere da 20 G. Iniziare un'infusione di mantenimento della normale soluzione salina (0,9% NaCl) e somministrare 2 g di solfato di magnesio (MgSO4) come bolo endovenoso per prevenire le aritmie.
- Preparare i siti chirurgici radendo adeguatamente e strofinando il torace e l'inguine. Disinfettare l'inguine e il collo con clorexidina e drappeggiare in modo appropriato fornendo accesso venoso e arterioso.
- Posizionare il cuscinetto dell'elettrodo di cauterizzazione sulla schiena dell'animale. Posizionare l'animale in posizione Trendelenburg per facilitare l'accesso venoso centrale.
- Individuare la vena giugulare destra utilizzando un'ecografia. Una volta individuato, utilizzando un ago, inserire la pelle con un angolo di 45 ° fino a quando non si vede il sangue e l'ago viene visto nella vena sull'ecografia.
- Posizionare il filo guida nell'ago e quindi inserire un introduttore di guaina venosa centrale percutanea 7 Fr sopra il filo guida.
- Rimuovere il filo guida mantenendo l'introduttore della guaina in posizione, quindi inserire un catetere Swans-Ganz per garantire misurazioni della gittata cardiaca e cateterismo cardiaco destro.
NOTA: La vena giugulare sinistra può essere utilizzata al posto di quella destra. Se l'accesso non è possibile, inserire la guaina direttamente nella vena giugulare interna (sinistra o destra) dopo la sternotomia della linea mediana. In tal caso, assicurati di sezionare la vena.
- Utilizzando la stessa tecnica, inserire un catetere venoso centrale (ad esempio, doppio lume) nella vena giugulare sinistra.
- Inserire un altro introduttore della guaina venosa centrale percutanea 7 Fr nella vena femorale destra utilizzando la tecnica Seldinger come descritto nei punti 1.7. a 1.10., per l'introduzione di un catetere di conduttanza nel ventricolo destro (RV). Questo può essere fatto per via percutanea con eco-guida, o dopo sternotomia della linea mediana.
- Consentire un periodo di stabilità per 10 minuti dopo l'intubazione e la manipolazione, quindi misurare i parametri emodinamici e di funzione cardiaca al basale, comprese le pressioni polmonari e sistemiche, la gittata cardiaca, i loop pressione-volume RV e LV e l'ecocardiografia transtoracica.
2. Stabilire l'accesso chirurgico
- Utilizzando una penna per cauterizzazione, eseguire un'incisione della linea mediana dalla regione medio-cervicale allo xifoide. Successivamente, dividere il grasso sottocutaneo, strato per strato, lungo la linea mediana usando l'elettrocauterizzazione per raggiungere il peri-sterno.
- Tagliare intorno alla tacca sternale e usare un dito per ritrarre e spazzare i tessuti molli da sotto lo sterno. Aprire lo sterno con una sega ossea e assicurarsi che lo sterno sia completamente diviso facendo attenzione con la vena sotto la parte superiore dell'osso sternale. Cauterizzare lo sterno e/o applicare cera ossea per garantire un'adeguata emostasi.
- Usando l'elettrocauterizzazione, sezionare e rimuovere il timo sollevandolo dal pericardio. Cauterizzare i vasi che forniscono il timo dall'aorta e la vena cava superiore (SVC) per prevenire il sanguinamento.
- Tagliare con cura il pericardio aperto con il cauterizzazione. Inserire le dita sotto il pericardio durante il taglio per evitare lesioni al cuore.
- Somministrare 300 unità/kg di eparina IV per ottenere un anticoagulante sistemico. Se il test è disponibile, assicurarsi che il tempo di coagulazione attivato (ACT) ˃ 300 s.
3. Ritiro delle terapie di sostegno vitale e dichiarazione di morte
- Somministrare un bolo di 3 mg/kg di propofol IV, quindi interrompere la ventilazione meccanica e scollegare il tubo endotracheale.
NOTA: Questo passaggio corrisponde a "Ritiro del supporto vitale" per avviare la perfusione regionale Normothermica. Per le condizioni di eutanasia, fare riferimento alla sezione 8.
- Monitorare la pressione arteriosa e la saturazione periferica di O2 . Iniziare il tempo di ischemia calda funzionale quando la pressione sistolica < 50 mmHg.
- Stabilire l'arresto circolatorio quando c'è asistolia (o fibrillazione ventricolare) e assenza di pulsatilità arteriosa. Avviare una fase di osservazione minima di 5 minuti dopo l'arresto circolatorio (periodo di stand-off) e successivamente dichiarare la morte dell'animale.
4. Posizionamento della perfusione regionale normotermica toracoaddominale
- Usando il cauterizzazione, sezionare attentamente lo spazio aortopolmonare. Ritrarre il tratto di deflusso del RV in modo inferiore, l'arteria polmonare a sinistra e l'aorta a destra per evitare lesioni dirette a quest'ultimo. Prendi un aiuto di assistenti se necessario durante questo passaggio.
- Sezionare e ligare i vasi sovra-aortici per evitare ed escludere la perfusione cerebrale. In alternativa, applicare un grande morsetto incrociato sui vasi.
- Inserire due cateteri da 18 G nelle carotidi bilateralmente distalmente all'occlusione per valutare il potenziale flusso sanguigno al cervello. Raccogliere e misurare il sangue durante l'esperimento e reinfonderlo tramite il circuito NRP.
- Utilizzando il metzenbaum e il forcipe ad angolo retto, sezionare delicatamente tra l'SVC e l'arteria innominata e tra l'IVC e il pericardio. Circondare SVC e IVC usando un nastro ombelicale o una semplice sutura di seta 0 e fissarli con un laccio emostatico.
- Usando una sutura 3-0, posizionare due suture concentriche sull'avventizia dell'aorta ascendente distale; Evitare suture a tutto spessore. Posizionare una sutura a corda di borsa sull'atrio destro (RA). Fissare tutti i punti di sutura con un laccio emostatico.
- Impostare e innescare il sistema NRP in base alle esigenze sperimentali e degli investigatori. Per questo protocollo, utilizzare un circuito ECMO con una pompa centrifuga, innescato con 2 L di soluzione cristallina contenente 500 mg di Solumedrol, 200 mL di bicarbonato di sodio (NaOH) all'8,4%, 300 unità / kg di eparina e 2 g di MgSO4.
NOTA: La configurazione utilizzata qui è simile a quella utilizzata dai perfusionisti dell'istituzione presso la divisione di cardiochirurgia.
- Utilizzando una cannula arteriosa da 17 a 21 F, cannulare l'aorta, quindi stringere il laccio emostatico tenendo la sutura del cordone della borsa per fissare la cannula in posizione.
NOTA: In alternativa, inserire una cannula ossigenatore a membrana extracorporea (ECMO) utilizzando la tecnica Seldinger per ridurre al minimo la perdita di sangue. Un altro metodo consiste nell'utilizzare una cannula arteriosa di bypass standard. La cannula aortica viene quindi collegata alla linea arteriosa del circuito NRP utilizzando un connettore 3/8-3/8; Garantire la completa deaerazione per evitare l'embolia aerea.
- Crea un'incisione di 5 mm al centro del cordone della borsa sul RA, quindi dilatala usando uno strumento ad angolo piccolo come un angolo retto o uno snap. Coprire l'incisione con un dito per evitare un eccessivo sanguinamento.
- Utilizzare una cannula venosa a doppio stadio per cannulare l'AR, quindi stringere le suture del cordone della borsa usando un laccio emostatico per fissare la cannula in posizione.
- Collegare le cannule alla linea venosa del circuito NRP utilizzando un connettore 1/2-3/8 e garantire la completa deaerazione per evitare una camera di equilibrio nel sistema.
- Assicurarsi che sia trascorso un minimo di 15 minuti tra la dichiarazione di morte e l'inizio della PNR per comprendere il tempo necessario nella preparazione della pratica clinica, nel drappeggio e nell'accesso al cuore.
- Iniziare la PNR 15 minuti dopo l'inizio del tempo di ischemia calda funzionale. Mantenere la normotermia durante tutta la procedura. Regolare progressivamente le portate per raggiungere un indice di perfusione di 2,5 L/min/m2. Riavviare la ventilazione meccanica con un FIO2 del 50% e un televisore di 6 ml/kg.
Nota : modificare queste impostazioni in base alla progettazione sperimentale.
- Infondere continuamente 10 μg/kg/min di dopamina e 4 unità/min di vasopressina IV. Utilizzare epinefrina e noradrenalina durante la perfusione iniziale e quindi titolarle secondo necessità per aiutare nella regolazione della pressione mantenendo la pressione arteriosa superiore a 50 mmHg.
5. Mantenimento della riperfusione e target per lo svezzamento
- Riperfondere il cuore per 30 minuti prima di tentare di svezzare per NRP. Se lo svezzamento non ha successo, eseguire altri 15 minuti di riperfusione per supportare con NRP prima di tentare di svezzare nuovamente per un tempo di riperfusione massimo totale di 180 minuti.
- Procedere alla valutazione cardiaca dopo lo svezzamento riuscito. Se lo svezzamento non viene raggiunto dopo questo tempo, interrompere l'esperimento e segnalare il problema.
NOTA: Questo dovrebbe essere adattato agli obiettivi di ciascun investigatore.
- Valutare i criteri di svezzamento dei PNR e assicurarsi che tutti i criteri siano soddisfatti come dettagliato nella Tabella 1.
6. Valutazione del recupero cardiaco
- Genera analisi del ciclo pressione-volume (PV) per misurare la contrattilità cardiaca. Il catetere di conduttanza consente misurazioni continue delle relazioni LV-PV.
- Ottieni registrazioni stazionarie per generare parametri dipendenti dal volume, lavoro di corsa e pressione sviluppata e occludi l'IVC con un nastro ombelicale per generare parametri indipendenti dal volume attraverso l'occlusione, vale a dire il lavoro di precarico reclutabile dell'ictus.
- Misurare la pressione venosa centrale, la pressione dell'arteria polmonare, la gittata cardiaca, la pressione RV e la pressione del cuneo capillare polmonare utilizzando il catetere Swans-Ganz introdotto all'inizio dell'esperimento.
- Analizzare la funzione cardiaca attraverso l'ecocardiografia utilizzando una sonda transesofagea standard e una sonda transtoracica posizionata direttamente sul cuore.
- Eseguire valutazioni metaboliche raccogliendo campioni di sangue arterioso e venoso per le analisi. Prelevare il sangue direttamente dal seno coronarico per valutare specificamente la funzione metabolica del cuore. Analizzare i gas del sangue e i livelli di lattato.
- Inoltre, raccogliere biopsie miocardiche dal camper e LV, se necessario. Ottenere campioni da altri organi trapiantabili di interesse (ad esempio, polmoni, fegato, reni), a seconda degli obiettivi dello sperimentatore.
7. Rimozione della PNR e valutazione cardiaca
- Quando i criteri di svezzamento sono soddisfatti, interrompere il PNR. Rimuovere la cannula dalla RA e stringere rapidamente la sutura del cordone della borsa per ridurre al minimo la perdita di sangue. Fissare la sutura con nodi e seguire la stessa procedura per rimuovere la cannula aortica.
- Valutare la funzione cardiaca ogni 30 minuti per 2 ore dopo l'interruzione della PNR come descritto nei passaggi 6.1. al punto 6.4.
8. Terminazione dell'esperimento
- Dopo 2 ore, posizionare un catetere cardioplegia da 16 G o 18 G nell'aorta ascendente. Collegare la cannula al circuito NRP.
- Successivamente, decomprimere le cavità cardiache destra incidendo l'IVC e le cavità sinistre incidendo l'atrio sinistro usando il cauterizzazione.
- Bloccare l'aorta ascendente dopo l'inserimento della cannula e somministrare 1,5 L di soluzione di cardioplegia Del Nido a 4 °C al cuore. Assicurarsi che la pressione di perfusione sia di 50 mmHg.
- Interrompere la ventilazione meccanica e posizionare la granita di ghiaccio (0,9% NaCl) nella cavità toracica dopo l'inizio della cardioplegia per il raffreddamento. Procedere con la cardiectomia in modo tradizionale una volta completata l'infusione di cardioplegia.
- Utilizzare il cuore raccolto per ottenere ampie biopsie miocardiche per la valutazione e la valutazione. Eseguire altre biopsie da altri organi (ad esempio, polmoni, fegato, reni) a seconda del disegno sperimentale e dell'obiettivo dei ricercatori
NOTA: la Figura 1 fornisce un riepilogo dei passaggi del protocollo illustrati e la Tabella 1 fornisce la definizione dei parametri e dei criteri utilizzati in questo studio.

Figura 1: Riassunto schematico del protocollo sperimentale. Abbreviazioni: NRP = Normothermic Regional Perfusion. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Definizione/Criteri |
| Periodo di ischemia calda funzionale | Periodo che inizia quando la pressione sistolica < 50 mmHg e termina quando viene iniziato il NRP. In questo protocollo, questo periodo è di 15 minuti |
| Arresto circolatorio | Si stabilisce quando il cuore è in asistolia o in fibrillazione ventricolare |
| Periodo di stand-off | Periodo che inizia con l'arresto circolatorio e termina con la dichiarazione di morte. In questo protocollo, questo periodo è di 5 minuti |
| Svezzamento di successo del PNR | Uso minimo di inotropi e vasopressori |
| CI > 2,2 L/min/m2 |
| MAPPA > 55 mmHg |
| RAP < 15 mmHg |
| PCWP < 15 mmHg |
| Normale funzione LV e RV |
Tabella 1: Definizione rappresentativa dei parametri e dei criteri utilizzati in questo protocollo. Abbreviazioni: CI = Indice cardiaco; MAP = pressione arteriosa media; NRP = Perfusione regionale normadremica; PCWP = Pressione del cuneo capillare polmonare; RAP = Pressione atriale destra.