Questo articolo descrive una tecnica per il sezionamento rapido dell'osso temporale umano che utilizza una microsega con due dischi diamantati per generare fette sottili per una rapida decalcificazione e analisi dell'immunoistochimica ossea temporale.
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Articolo metodologico
Sezionamento dell'osso temporale umano ad alta velocità per la valutazione della patologia dell'orecchio medio associata a COVID-19
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'analisi istopatologica delle sezioni ossee temporali umane è una tecnica fondamentale per lo studio della patologia dell'orecchio interno e medio. Le sezioni ossee temporali sono preparate mediante raccolta ossea temporale post-mortem, fissazione, decalcificazione, incorporamento e colorazione. A causa della densità dell'osso temporale, la decalcificazione è un processo che richiede tempo e risorse; la preparazione completa dei tessuti può richiedere in media 9-10 mesi. Ciò rallenta la ricerca otopatologica e ostacola gli studi sensibili al fattore tempo, come quelli rilevanti per la pandemia di COVID-19. Questo documento descrive una tecnica per la rapida preparazione e decalcificazione delle sezioni ossee temporali per accelerare l'elaborazione dei tessuti.
Le ossa temporali sono state raccolte post mortem utilizzando tecniche standard e fissate in formalina al 10%. Una microsega di precisione con due lame diamantate è stata utilizzata per tagliare ogni sezione in tre sezioni spesse. Sezioni ossee temporali spesse sono state poi decalcificate in soluzione decalcificante per 7-10 giorni prima di essere incorporate nella paraffina, sezionate in sezioni sottili (10 μm) usando un criotomo e montate su vetrini non caricati. I campioni di tessuto sono stati quindi deparaffinati e reidratati per la colorazione degli anticorpi (ACE2, TMPRSS2, Furin) e ripresi. Questa tecnica ha ridotto il tempo dalla raccolta all'analisi dei tessuti da 9-10 mesi a 10-14 giorni. Il sezionamento osseo temporale ad alta velocità può aumentare la velocità della ricerca otopatologica e ridurre le risorse necessarie per la preparazione dei tessuti, facilitando al contempo studi sensibili al tempo come quelli relativi a COVID-19.
Introduzione
La ricerca sull'osso temporale umano fornisce una risorsa inestimabile per studiare la patologia e la fisiopatologia dell'orecchio interno e medio. Prima del 19 ° secolo, si sapeva poco per quanto riguarda la malattiaotologica 1,2,3. Per comprendere meglio la malattia otologica e "salvare la chirurgia uditiva dalle mani dei ciarlatani", Joseph Toynbee (1815-1866) sviluppò metodi per studiare le sezioni istologiche dell'osso temporale umano3. Questo lavoro è stato promosso da Adam Politzer (1835-1920) a Vienna e altri in tutta Europa durante il resto de....
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Protocollo
Questo protocollo è stato sviluppato con l'approvazione IRB (IRB00250002) e in conformità con le politiche istituzionali per l'uso di tessuti umani e materiale infettivo. Ogni donatore di ossa temporali ha fornito il consenso scritto prima della morte, o il consenso è stato ottenuto postumo dalla famiglia del donatore. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, le attrezzature e il software utilizzati in questo protocollo.
1. Raccolta ossea temporale
- Ottenere l'approvazione del consiglio di revisione istituzionale locale (IRB), rivedere le politiche istituzionali per l'us....
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Risultati
La colorazione di ematossilina ed eosina della mucosa dell'orecchio medio e della tromba di Eustachio ha mostrato la conservazione della mucosa dell'orecchio medio e del tessuto dell'orecchio medio sottomucoso dopo l'elaborazione (Figura 1). Le immagini immunoistochimiche hanno mostrato l'espressione delle proteine ACE2, TMPRSS2 e Furin all'interno della mucosa dell'orecchio medio e della tromba di Eustachio (Figura 1). La presenza di queste proteine all'interno.......
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Discussione
La ricerca sull'osso temporale umano è fondamentale per lo studio della patologia dell'orecchio interno e medio, ma rimane uno sforzo ad alta intensità di tempo e risorse. Questo documento descrive una tecnica che utilizza una microsega diamanta per generare sezioni ossee temporali spesse che possono essere rapidamente decalcificate prima di ulteriori sezioni in modo che il tempo dalla raccolta dei tessuti allo studio possa essere ridotto da 9-10 mesi a 10-14 giorni. Questa tecnica può ridurre le risorse necessarie per l.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Mohamed Lehar per la sua assistenza in questo progetto. Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-ACE-2 (diluizione applicata 1:50) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anticorpo anti-furina (diluizione 1:250) | Anticorpo anti-TMPRSS2 Abcam | EPR 14674 | |
| (diluizione 1:1.000) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Sistema manuale Microscopio | Olympus Life Science | ||
| Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet - Fotocamera | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 | Blocco enzimatico | ||
| (soluzione di blocco commerciale) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Soluzione di formalina, neutra tamponato 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcificante (soluzione decalcificante dell'acido formico) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Colorazione dell'ematossilina | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (diluizione 1:100) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Kit di rilevamento delle igG anti-capra per cavalli, perossidasi (1:100 Vector | Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw Pace | Technologies | PICO 155P | microsega |
| NIS Elements Versione software 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffina |
| Vetrini per microscopio caricati positivi con estremità smerigliata bianca | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | criotomo |
| Triology Pretreatment Solution (soluzione di pretrattamento commerciale) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
Riferimenti
- Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
- Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery
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Ristampe e permessi
