Articolo metodologico

Studiare i driver dell'antiricompensa nel comportamento di dipendenza con metodi di espressione genica anatomicamente specifici a singola cellula

DOI:

10.3791/64014

⸱

4 agosto 2022

 ,  ,  , 
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La combinazione di microdissezione a cattura laser e RT-qPCR microfluidica fornisce specificità anatomiche e biotecniche nella misurazione del trascrittoma nei singoli neuroni e glia. L'applicazione di metodi creativi con l'approccio biologico di un sistema alle malattie psichiatriche può portare a scoperte nella comprensione e nel trattamento come l'ipotesi dell'antiricompensa della neuroinfiammazione nella dipendenza.

Abstract

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L'aumento dei tassi di comportamento di dipendenza ha motivato ricercatori e medici di salute mentale a comprendere l'antiricompensa e il recupero. Questo allontanamento dalla ricompensa e dall'inizio richiede nuove prospettive, paradigmi e ipotesi insieme a un'espansione dei metodi applicati per indagare la dipendenza. Qui, forniamo un esempio: un approccio di biologia dei sistemi per studiare l'antiricompensa che combina la microdissezione a cattura laser (LCM) e le reazioni a catena quantitativa della polimerasi a trascrizione inversa microfluidica ad alto rendimento (RT-qPCR). Sono state misurate le dinamiche della rete di espressione genica ed è stato identificato un fattore chiave della disregolazione neuroviscerale nell'astinenza da alcol e oppioidi, la neuroinfiammazione. Questa combinazione di tecnologie fornisce specificità anatomica e fenotipica a risoluzione di una singola cellula con sensibilità ad alto rendimento e misure specifiche di espressione genica che producono sia set di dati che generano ipotesi che possibilità meccanicistiche che generano opportunità per nuove intuizioni e trattamenti.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La dipendenza rimane una sfida crescente nel mondo sviluppato 1,2. Nonostante i grandi progressi scientifici e clinici, i tassi di dipendenza continuano ad aumentare mentre l'efficacia dei trattamenti consolidati rimane stabile nel migliore dei casi 3,4,5. Tuttavia, i progressi nella biotecnologia e negli approcci scientifici hanno portato a nuovi metodi e ipotesi per indagare ulteriormente la fisiopatologia della dipendenza da sostanze 6,7,8. In effetti, i recenti sviluppi suggeriscono che nuovi concetti e paradigmi di trattamento possono portare a scoperte con conseguenze sociali, economiche e politiche 9,10,11,12.

Abbiamo studiato l'antiricompensa nella sospensione della dipendenza da alcol e oppioidi13,14,15,16. I metodi sono centrali in questo paradigma17,18. La microdissezione a cattura laser (LCM) può selezionare singole cellule con elevata specificità anatomica. Questa funzionalità è parte integrante dell'ipotesi dell'antiricompensa della neuroinfiammazione in quanto sia la glia che i neuroni possono essere raccolti e analizzati dallo stesso sottonucleo neuronale nello stesso animale 13,14,15,16,19. Una porzione rilevante del trascrittoma di cellule selezionate può quindi essere misurata con reazioni a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa microfluidica ad alto rendimento (RT-qPCR) fornendo set di dati ad alta dimensione per l'analisi computazionale che fornisce approfondimenti sulle reti funzionali20,21.

La misurazione di un sottoinsieme del trascrittoma nei neuroni e nella glia in uno specifico nucleo cerebrale genera un set di dati che è robusto sia nel numero di campioni che nei geni misurati ed è sensibile e specifico. Questi strumenti sono ottimali per l'approccio neuroscientifico di un sistema alle malattie psichiatriche perché la glia, principalmente astrociti e microglia, ha dimostrato un ruolo centrale nelle malattie neurologiche e psichiatriche negli ultimi dieci anni22,23. Il nostro approccio può misurare la risposta espressiva di glia e neuroni in concomitanza attraverso numerosi recettori e ligandi coinvolti nella segnalazione paracrina locale. In effetti, la segnalazione può essere dedotta da questi set di dati utilizzando vari metodi quantitativi come la logica fuzzy24. Inoltre, l'identificazione dei sottofenotipi cellulari nei neuroni o nella glia e la loro funzione può fornire informazioni su come le cellule cerebrali in nuclei specifici organizzano, rispondono e disregolano a livello di singola cellula. La dinamica di questo sistema funzionale può anche essere modellata con esperimenti di serie temporali16. Infine, i modelli animali possono essere perturbati anatomicamente o farmacologicamente per dare una condizione meccanicistica all'approccio di questo sistema.

Esperimento rappresentativo:
Di seguito, forniamo un esempio dell'applicazione di questi metodi. Questo studio ha studiato l'espressione genica neuronale e microglia del ratto nel nucleo solitario (NTS) in risposta alla dipendenza da alcol e alla successiva sospensione16. Le coorti di ratti comprendevano 1) Controllo, 2) Etanolo-dipendente (EtOH), 3) 8 ore di prelievo (Wd), 4) 32 ore Wd e 5) 176 h Wd (Figura 1A). Dopo una rapida decapitazione, i tronchi cerebrali sono stati separati dal proencefalo e criosezionati, e le fette sono state colorate per i neuroni e la microglia positivi alla tirosina idrossilasi (TH +) (Figura 1B). LCM è stato utilizzato per raccogliere sia i neuroni TH+ che TH- e la microglia. Tutte le cellule provenivano dall'NTS e analizzate come campioni di pool di 10 cellule. Quattro array dinamici microfluidici RT-qPCR 96 x 96 sono stati eseguiti sulla piattaforma RT-qPCR che misura 65 geni (Figura 1B-C). I dati sono stati normalizzati utilizzando un metodo -ΔΔCt e analizzati utilizzando R, e la selezione di singole cellule è stata convalidata con marcatori molecolari (Figura 1D-E). La convalida tecnica è stata ulteriormente verificata da repliche tecniche analizzate all'interno di un singolo lotto e tra lotti (Figura 2 e Figura 3). Neuroni TH+ e TH- organizzati in diversi sottofenotipi con cluster di geni infiammatori simili ma diversi cluster del recettore (R) dell'acido γ-aminobutirrico (GABA) (Figura 4 e Figura 5). I sottofenotipi che avevano un'elevata espressione di cluster genici infiammatori erano sovrarappresentati a 32 h Wd mentre l'espressione del recettore GABA (GABAR) è rimasta bassa nell'astinenza prolungata da alcol (176 h Wd). Questo lavoro contribuisce all'ipotesi antiricompensa della dipendenza da alcol e oppioidi che ipotizza che il feedback intercettivo dai visceri in astinenza contribuisca alla disregolazione dei nuclei neuronali viscerali-emotivi (cioè NTS e amigdala) con conseguente sequele autonomiche ed emotive più gravi, che contribuiscono alla dipendenza da sostanze (Figura 6).

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Protocollo

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Questo studio è stato condotto in conformità con le raccomandazioni del Comitato per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Thomas Jefferson University. Il protocollo è stato approvato dalla Thomas Jefferson University IACUC.

1. Modello animale

  1. Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, USA) tre gemelli di ratto singolarmente con libero accesso a etanolo-chow (2 ratti) o miscela control-chow (1 ratto).
    NOTA: Questo esperimento rappresentativo ha impiegato il protocollo Lieber-DeCarli per studiare la neurobiologia dell'astinenza da alcol25,26. Le triplette di ratto consistono in una coorte di tre ratti da nutrire con lo stesso numero di calorie, ma finiscono in diversi bracci dello studio al sacrificio. I tre bracci per questo studio sono: 1) Controllo, 2) Etanolo-dipendente (EtOH) e 3) Ritiro (Wd) (Figura 1A). Ci sono cinque condizioni totali in questo studio in quanto ci sono tre punti temporali di astinenza da alcol (Figura 1A).
    1. A giorni alterni, misurare la miscela etanolo-chow consumata dal ratto Wd e sostituire la quantità consumata con la stessa quantità di miscela di etanolo all'alimentatore di ratti EtOH. Aggiungere la quantità calorica equivalente della miscela di controllo all'alimentatore del ratto di controllo.
      NOTA: Il consumo medio giornaliero di etanolo è di circa 12-16 g/kg dopo 3 settimane26.
    2. Dopo il consumo stabile di etanolo a lungo termine e la dipendenza (>5 settimane), indurre l'astinenza acuta da alcol nel ratto Wd svuotando il suo contenitore di cibo e riempiendolo con una miscela di controllo. Esegui questo in modo tale che tutti e tre i ratti vengano sacrificati nello stesso punto temporale circadiano21.
    3. Al punto temporale prescelto, sacrificare tutti e tre i ratti nella tripletta allo stesso punto temporale (Control, EtOH e Wd).

2. Raccolta dei campioni

  1. Raccogliere il cervello allo stesso punto temporale circadiano per ogni tripletta di ratto al punto temporale Wd corretto (8 h, 32 h, 176 h).
    1. Preparare un bagno di metanolo e ghiaccio secco per un rapido raffreddamento dei tessuti freschi per preservare l'integrità dell'RNA. Metti da parte.
    2. Mettere il ratto in un serbatoio di isoflurano (5% in ossigeno) per ~ 30 s o fino a quando non si verifica la perdita di coscienza, come indicato dalla ridotta frequenza respiratoria e dall'assenza di attività motoria. Metti la testa del topo in una ghigliottina opportunamente affilata per decapitare rapidamente.
    3. Apri il cranio dell'animale per sezionare il cervello usando una pinza. Rimuovere il cervelletto dal cervello fresco con un rasoio portatile affettandolo grossolanamente e scartarlo. Con incisione trasversale, tagliare il tronco cerebrale dal proencefalo.
      NOTA: Un rasoio portatile può essere utilizzato ulteriormente per semi-sezionare il proencefalo o il tronco cerebrale negli emisferi sinistro e destro secondo il design sperimentale. Ad esempio, per convalidare i risultati di un emisfero con metodi diversi, indagare sulla divergenza sinistra-destra o aumentare il numero del campione.
    4. Aggiungere la temperatura di taglio ottimale (O.C.T.) media a circa 3-4 cm di profondità nello stampo di incorporazione del tessuto in modo che il campione di tessuto possa essere completamente immerso. Posizionare il tessuto, il proencefalo e/o il tronco encefalico, nello stampo di incorporazione del tessuto e aggiungere più O.C.T. per coprire completamente il campione di tessuto.
    5. Aggiungere lo stampo di incorporamento del tessuto plastico contenente il campione di tessuto (proencefalo di ratto) nel bagno di raffreddamento di ghiaccio secco e metanolo per congelare immediatamente il campione di tessuto. Lasciare che il campione di tessuto nello stampo di incorporazione rimanga nel bagno di raffreddamento fino al completamento della raccolta del tessuto, ma non più di 15 minuti.
      NOTA: Fare attenzione a evitare che il metanolo si riversi nel contenitore del tessuto.
    6. Conservare rapidamente i campioni di tessuto a -80 °C.
      NOTA: La RT-qPCR microfluidica misura l'espressione genica amplificando e misurando i trascritti di mRNA. Queste trascrizioni sono relativamente instabili, quindi vengono prese molte misure in questo processo per mantenere il campione il più freddo possibile per prevenire la degradazione dell'mRNA.

3. Criosezione

NOTA: I nuclei neuronali di un ratto sono circa 10 μm. Pertanto, 10 μm è lo spessore ottimale della fetta per questo modello animale. Lo spessore della fetta viene regolato in base al modello animale per lo studio.

  1. Dal congelatore a -80 °C, estrarre lo stampo che incorpora il tessuto che contiene il tronco cerebrale congelato e scongelare il campione a -20 °C in criostato per 5-10 minuti. Eseguire questo congelamento-scongelamento a -20 °C solo una volta per la conservazione dell'mRNA.
  2. Con un rasoio portatile, tagliare verticalmente gli angoli dello stampo di incorporamento in plastica. Rimuovere il tronco cerebrale incorporato in O.C.T. dallo stampo di incorporamento del tessuto plastico. Sul mandrino del criostato fissato a -20 °C, utilizzare il liquido O.C.T. a temperatura ambiente come colla per montare il tronco encefalico nella direzione da rostrale a caudale per la criosezione coronale.
  3. Tagliare le criosezioni coronali da 10 μm nella direzione da rostrale a caudale dal tronco cerebrale del ratto fino a raggiungere le sezioni contenenti la regione di interesse (NTS). L'altezza e la larghezza di queste criosezioni sono ~ 200 mm in base alle dimensioni dello stampo di incorporamento in plastica.
  4. Raccogliere le criosezioni da 10 μm di tessuto del tronco cerebrale che includono l'NTS, o altra regione di interesse in base allo studio, mediante montaggio a scongelamento su vetrini semplici a temperatura ambiente. Rapidamente, posizionare questi vetrini con sezioni in una pentola metallica di raffreddamento situata sopra il ghiaccio secco. Non appena possibile, posizionare i vetrini contenenti criosezioni in un congelatore a -80 °C per la conservazione.
    NOTA: Un singolo vetrino può contenere più criosezioni da 10 μm poiché la larghezza e l'altezza sono ~ 200 mm. Pertanto, lo stesso vetrino può contenere criosezioni colorate per tipi di cellule distinte.
    1. Quando sulla diapositiva sono presenti più sezioni, assicurarsi che siano separate da 100 mm di spazio vuoto. Per creare un bordo tra le criosezioni, utilizzare una penna idrofobica. Ciò consente a diverse soluzioni anticorpali di colorare diversi tipi di cellule sullo stesso vetrino. Mantenere 20 mm di spazio per la criosezione dal bordo del vetrino.

4. Colorazione con immunofluorescenza di singole cellule

  1. Utilizzare il protocollo di immunofluorescenza a colorazione rapida sulle criosezioni cerebrali per etichettare i tipi di cellule cerebrali desiderati (neuroni, microglia, astrociti, ecc.) per la raccolta utilizzando LCM.
    NOTA: Il protocollo di colorazione immunoistochimica utilizzato per questi esperimenti è stato progettato per essere rapido per prevenire la degradazione dell'mRNA in eccesso durante questo processo.
    1. Dal congelatore a -80 °C, estrarre i vetrini contenenti criosezioni da 10 μm di tronco cerebrale di ratto contenenti NTS. Immergere i vetrini per 30 secondi in bagno di etanolo al 75% per fissare il tessuto criosezionato. Rimuovere il liquido in eccesso.
    2. Sul tessuto criosezionato fisso del tronco encefalico, applicare il 2% di albumina sierica bovina (BSA) in soluzione salina tampone fosfato (PBS) per 30 s per bloccare il legame non mirato degli anticorpi. Successivamente, lavare con PBS.
    3. Applicare una quantità sufficiente di soluzione anticorpale primaria per coprire il tessuto criosezionato (ora fissato e bloccato). Incubare la sezione tissutale in soluzione anticorpale primaria per 2 minuti. Lavare il tessuto con una soluzione BSA al 2% una volta. La soluzione anticorpale primaria contiene il 96% della soluzione BSA-PBS per il blocco, il 3% di anticorpi primari e l'1% di inibitori della RNasi. L'anticorpo primario è stato diluito in un rapporto 1:25.
      NOTA: In questo esperimento rappresentativo, gli anticorpi primari sono costituiti da anticorpi anti-NeuN e anticorpi anti-Cd11β. I neuroni sono stati ulteriormente suddivisi in sottogruppi TH+ e TH-, quindi le soluzioni anticorpali primarie per la colorazione neuronale contenevano il 93% della soluzione PBS BSA, il 3% di anticorpi anti-NeuN, il 3% di anticorpi anti-tirosina idrossilasi e l'1% di RNasi Out.
    4. Applicare una quantità sufficiente di soluzione di anticorpi secondari (1:200) per coprire il tessuto del tronco encefalico. Lascia che la soluzione anticorpale secondaria bagni il tessuto. Dopo 3 minuti, lavare il tessuto con una soluzione di BSA al 2% una volta.
      NOTA: La soluzione contenente l'anticorpo secondario era composta da 196,5 μL di BSA al 2%, 1 μL di tag fluorescente anti-topo di capra da 555 nm per il tipo di cellula, 1 μL di asino anti-coniglio Alexa 488 nm per la colorazione TH, 2,5 μL di inibitore della RNasi e 1,3 μL di DAPI (1:10000).

5. Serie standard di disidratazione dei tessuti di etanolo e xilene

  1. Posizionare i vetrini su cui poggia il tessuto criosezionato colorato in un bagno di etanolo al 75% per 30 s, seguito dall'inserimento in bagno di etanolo al 95% per 30 s, un bagno di etanolo al 100% per 30 s e infine un etanolo al 100% entrambi per 30 s (in un secondo contenitore).
  2. Dopo aver completato la serie di disidratazione dell'etanolo, versare due bagni freschi di xilene al 100%. Quindi, posizionare i vetrini nel primo bagno di xilene per 1 minuto. Rimuovere rapidamente e posizionare i vetrini nell'altro bagno di xilene fresco per 4 minuti.
  3. Prendi vetrini contenenti criosezioni di tessuto macchiate e disidratate dallo xilene e mettili in un contenitore buio ma ventilato per 5 minuti ad asciugare all'aria. Dopo l'essiccazione all'aria, posizionare i vetrini in un essiccatore per 5 minuti per l'asciugatura finale.

6. Selezionare singole celle utilizzando la microdissezione a cattura laser (LCM)

  1. Inserire un vetrino contenente criosezioni tissutali colorate, fisse e disidratate nel supporto del campione del microscopio LCM. Utilizzare punti di riferimento anatomici per individuare la regione di interesse da cui verrà eseguita la raccolta delle celle (NTS in questo esempio rappresentativo).
  2. Attiva la fluorescenza del microscopio e trova i tipi di cellule colorate di interesse. Assicurarsi che il nucleo della cellula desiderata si trovi nella regione di interesse e sia isolato dai nuclei di altre cellule da una distanza >3 mm. Identificare e contrassegnare una cella (se l'esperimento è vero a cella singola) o più celle (se l'esperimento richiede campioni a cella singola raggruppati [cioè scala a cella singola] come dimostrato in questo esperimento rappresentativo) da raccogliere utilizzando il software LCM.
    NOTA: In questo esperimento rappresentativo sono stati utilizzati campioni composti da pool di 10 celle. Questo viene fatto per ridurre la variabilità dell'espressione genica tra i campioni e aumentare il numero di singole cellule analizzate, sebbene questo rimanga ancora un esperimento su scala di singola cellula. I veri esperimenti a singola cellula possono essere completati con questo metodo20,27. Inoltre, è possibile selezionare sezioni di tessuto più grandi21.
  3. Dopo aver selezionato le cellule desiderate, utilizzare il braccio robotico LCM, posizionare il cappuccio LCM sulla regione di interesse sulla criosezione tissutale contrassegnata.
  4. Calibra l'intensità e il puntamento del laser a infrarossi (IR) utilizzando scatti di prova.
    NOTA: questa operazione viene eseguita per ogni campione. La calibrazione deve essere eseguita su una sezione del cappuccio che non si trova direttamente sopra il tessuto in modo da non selezionare erroneamente tessuto non sperimentale.
    1. Per calibrare l'intensità, regolare la durata, la forza e le dimensioni del colpo laser IR in modo che un colpo sciolga solo l'adesivo del cappuccio abbastanza da selezionare un singolo nucleo cellulare e sia anche abbastanza forte da fondere il cappuccio alla criosezione sul vetrino. Questi valori saranno diversi per ogni limite.
    2. Calibra il targeting localizzando il mirino laser esattamente dove il laser ha fuso il cappuccio.
  5. Raccogliere le cellule identificate sparando il laser a infrarossi LCM per fondere il cappuccio sul tessuto criosezionato su quelle cellule. Assicurarsi che solo le cellule selezionate siano state sollevate dalla fetta di tessuto utilizzando il braccio robotico per posizionare il cappuccio nell'area di controllo qualità (QC) del microscopio LCM. Per rimuovere eventuali cellule in eccesso sul cappuccio, utilizzare il laser ultravioletto (UV) per cancellare il materiale genetico delle cellule in eccesso.
  6. Registrare la specificità anatomica con la telecamera software LCM. Scatta una foto del tessuto criosezionato da cui sono state rimosse le cellule.
  7. Usa un atlante anatomico (un atlante del proencefalo del ratto in questo esempio) per determinare la distanza di questa fetta di tessuto dal bregma e registra questa informazione come distanza Z28. Determinare la posizione nel piano X e/o Y dalla foto per localizzare completamente la cella selezionata.
  8. Con le mani guantate, rimuovere il cappuccio LCM dall'area QC. Quindi, fissare il dispositivo di estrazione del campione al cappuccio LCM. Utilizzare una pipetta per applicare 5,5 μL di tampone di lisi alle celle selezionate. Questo è ora indicato come il campione.
    NOTA: La soluzione tampone di lisi è composta da 5 μL di tampone di risospensione insieme a 0,5 μL di potenziatore di lisi.
  9. Montare una provetta da microcentrifuga da 0,5 mL sul dispositivo di estrazione del campione collegato al tappo LCM. Posizionare questa disposizione su una piastra riscaldante a 75 °C con il campione e il tampone di lisi più vicini alla piastra. Lasciare riscaldare il campione per 15 minuti.
  10. Utilizzare una centrifuga a bassa velocità a 0,01-0,02 x g per far girare il campione e il tampone di lisi sul fondo della provetta da 0,5 mL di microcentrifuga. Conservare il campione a -80 °C fino alla qPCR microfluidica.

7. Eseguire un chip qPCR su un RT-qPCR microfluidico sulla piattaforma

  1. Per misurare l'espressione genica per campioni di singole cellule, eseguire la pre-amplificazione dell'mRNA come descritto di seguito.
    NOTA: Il protocollo non prevede l'estrazione di mRNA in quanto i campioni sono singole cellule contenenti una quantità molto bassa di RNA (10 pg), che andrà perso durante la fase di isolamento dell'mRNA. Le singole cellule vengono lisate e procedono direttamente per la trascrizione inversa per ridurre al minimo la perdita del campione.
    1. Creare un pool di primer aggiungendo i primer del gene qPCR dell'mRNA (avanti e indietro) per ogni gene analizzato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Assicurarsi che la concentrazione finale di ciascun primer sia di 500 nM. I primer in questo esperimento di esempio sono elencati nella tabella supplementare 116.
    2. Pipetta 1 μL di reazione 5x cDNA si mescola in ogni pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti.
    3. Lasciare scongelare brevemente i campioni monocellulari (2-3 min) rimuovendoli dal congelatore a -80 °C e lasciandoli riposare a temperatura ambiente. Utilizzare una centrifuga a bassa velocità a 0,01-0,02 x g per far girare i campioni per 20-30 s. Pipettare 5,5 μL di ciascun campione a singola cellula in un pozzetto diverso nella piastra PCR a 96 pozzetti.
      NOTA: il numero di campioni e il tipo da inserire in ciascun pozzetto vengono determinati prima di iniziare questo passaggio.
    4. La piastra PCR a 96 pozzetti ora ha il mix di reazione del cDNA e un campione di singola cellula aggiunto a ciascun pozzetto. Posizionare questa piastra in un termociclatore per 1,5 minuti a 65 °C per attivare la miscela di reazione del cDNA. Centrifugare il contenuto utilizzando la centrifugazione ad alta velocità a 1.300 x g per 1 minuto a 4 °C e posizionare la piastra PCR su ghiaccio umido.
    5. In ciascun pozzetto della piastra PCR, pipettare 0,12 μL di proteina T4 Gene 32, 0,73 μL di tampone di sospensione del DNA e 0,15 μL di 10x master mix di sintesi del cDNA. Far passare la piastra PCR attraverso il seguente protocollo nel termociclatore: 25 °C per 5 min, 50 °C per 30 min, 55 °C per 25 min, 60 °C per 5 min, 70 °C per 10 minuti e una tenuta finale a 4 °C.
      NOTA: La proteina T4 Gene 32 (una proteina legante il DNA a singolo filamento (ssDNA)) è necessaria per la replicazione e la riparazione del batteriofago T4. La proteina T4 Gene 32 è stata utilizzata nella fase di trascrizione inversa del protocollo per migliorare la resa e l'efficienza della trascrizione inversa e per aumentare la resa del prodotto PCR.
    6. In ciascun pozzetto nella piastra PCR, pipettare 7,5 μL di miscela principale di polimerasi Taq. Successivamente, in ciascun pozzetto, pipettare 1,5 μL del pool di primer creato al punto 7.1.1. Far passare la piastra PCR attraverso la seguente fase di preamplificazione lineare nel termociclatore: 95 °C per 10 minuti; 22 cicli da: 96 °C per 5 s e 60 °C per 4 min.
    7. In ciascun pozzetto della piastra PCR, pipettare 1,2 μL di esonucleasi I, 4,2 μL di tampone di sospensione del DNA e 0,6 μL di tampone di reazione 10x esonucleasi I. Eseguire la piastra PCR attraverso il seguente protocollo nel termociclatore: 37 °C per 30 min, 80 °C per 15 min.
      NOTA: L'esonucleasi catalizza la rimozione dei nucleotidi dal DNA lineare a singolo filamento nella direzione da 3' a 5'. Utilizziamo l'esonucleasi per la pulizia dei campioni per la rimozione di primer non incorporati e di qualsiasi cDNA a singolo filamento che possa essere presente dopo la pre-amplificazione.
    8. In ciascun pozzetto nella piastra PCR, pipettare 54 μL di tampone TE. Utilizzare una centrifuga ad alta velocità a 1.300 x g per 5 minuti a 4 °C per centrifugare il contenuto della piastra PCR.
    9. Se si prevede di continuare con la fase successiva del protocollo, refrigerare la piastra PCR a 4 °C. Se tra il completamento della fase di preamplificazione e l'inizio della qPCR microfluidica sono trascorse più di 12 ore, coprire la piastra qPCR e metterla in un congelatore a -20 °C.
  2. Realizzare la piastra campione (nuova piastra PCR a 96 pozzetti) per chip qPCR come descritto di seguito.
    1. Se la piastra PCR di pre-amplificazione del punto 7.1 è stata posta in un congelatore a -20 °C, rimuovere e lasciare scongelare a temperatura ambiente per 10 minuti.
    2. In una nuova piastra PCR a 96 pozzetti, pipettare in ciascun pozzetto 4,55 μL di supermix PCR a basso rox e 0,45 μL di colorante legante il DNA 20x. Quindi, pipettare 3 μL di campione preamplificato dalla piastra PCR effettuata al punto 7.1. Utilizzare la centrifugazione ad alta velocità a 1.300 x g per 5 minuti a 4 °C per far girare la piastra PCR e posizionare la piastra campione PCR sul ghiaccio.
  3. Crea una piastra di analisi (una nuova piastra PCR a 96 pozzetti) per chip qPCR come descritto di seguito.
    1. In una nuova piastra PCR a 96 pozzetti, pipettare in ciascun pozzetto 1,25 μL di tampone di sospensione del DNA e 3,75 μL di 2x reagente di carico del test. Quindi, pipettare il corrispondente primer qPCR a 2,5 μL di primer da 10 μM. Utilizzare una centrifuga ad alta velocità a 1.300 x g per 5 minuti a 4 °C per ruotare la piastra PCR e posizionare la piastra di analisi PCR su ghiaccio.
  4. Preparare il chip qPCR per il caricamento nella piattaforma microfluidica RT-qPCR come descritto di seguito.
    NOTA: Il chip qPCR è una piattaforma qPCR in tempo reale che funziona su principi microfluidici. Il chip qPCR è essenzialmente una matrice di 96 canali campione e 96 canali di primer qPCR RNA (cioè saggi) che si intersecano in 9.216 (96 x 96) camere. Un campione e un test specifico sono combinati in ciascuna camera dell'array in cui si verifica una reazione qPCR in tempo reale. La lettura viene generata come valori del ciclo di soglia (Ct) e grafici di amplificazione per i primer utilizzati.
    1. Iniettare il fluido della linea di controllo nel chip qPCR per l'adescamento. Inserire il chip qPCR nel dispositivo di miscelazione microfluidica. Selezionare lo script prime (136x) ed eseguire questo programma.
    2. Quando il programma è completo dopo ~45 minuti, rimuovere il chip qPCR innescato. Nel chip qPCR innescato, pipettare 6 μL della reazione dalla piastra di campionamento PCR nel pozzetto campione corrispondente nel chip qPCR.
    3. Nel chip qPCR innescato, pipettare 6 μL della reazione dalla piastra di analisi PCR nel pozzetto di analisi corrispondente nel chip qPCR.
      NOTA: possono formarsi bolle d'aria sul fondo del campione e pozzetti di analisi nel chip qPCR, che possono impedire alle soluzioni di entrare nei condotti microfluidici. Un ago affilato può essere utilizzato per far scoppiare o rimuovere queste bolle d'aria prima di inserire il chip qPCR nel dispositivo di miscelazione microfluidica.
    4. Inserire il chip qPCR nel dispositivo di miscelazione microfluidica. Selezionare lo script load mix (136x) ed eseguire questo programma.
  5. Caricare il chip qPCR nella piattaforma microfluidica RT-qPCR.
    1. Accendere la piattaforma microfluidica RT-qPCR e riscaldare la lampadina (~20 min). Rimuovere il chip qPCR dal dispositivo di miscelazione microfluidica. Staccare l'adesivo protettivo dalla parte inferiore del chip qPCR.
    2. Aprire la piattaforma microfluidica RT-qPCR e caricare il chip qPCR nella piattaforma microfluidica RT-qPCR. Eseguire il veloce protocollo PCR 96 x 96 (30 cicli) sulla piattaforma microfluidica RT-qPCR.
    3. Avviare il software di raccolta dati: fare clic su Avvia una nuova esecuzione.
    4. Verificare il codice a barre del chip e fare clic su Avanti. Fare clic sul file Chip Run e sfogliare il percorso del file per l'archiviazione della raccolta dati.
    5. Fare clic su Tipo di applicazione e selezionare Espressione genica; selezionare ROX come riferimento passivo, selezionare Sonda singola e selezionare EvaGreen per il tipo di sonda.
    6. Fare clic per selezionare il programma di cicli termici e selezionare il file Biomark HD: GE Fast 96x96 PCR+Melt v2.pcl.

8. Analisi dei dati

  1. Caricare i dati dal chip qPCR eseguito al software di analisi per QC come descritto di seguito.
    1. Scarica il software di analisi dei dati. Questo può essere trovato sul seguente sito Web: https://www.fluidigm.com/products-services/software #. Avviare il software per analizzare l'esperimento microfluidico RT-qPCR.
    2. All'interno del software, aprire Chip Run. Quindi, aprire il file ChipRun.bml creato dall'esperimento. Apparirà una finestra con i dettagli sperimentali, inclusi il riferimento passivo, la sonda e il programma termico PCR.
      NOTA: il controllo qualità (QC) e l'analisi dei dati possono essere eseguiti sul computer collegato alla piattaforma microfluidica RT-qPCR o trasferendo il file .bml su un altro computer tramite un'unità flash o altri mezzi.
  2. Definire la configurazione di esempio come descritto di seguito.
    NOTA: questo passaggio crea un modello etichettato di campioni e saggi (primer qPCR) per le procedure di controllo qualità (QC) e analisi dei dati.
    1. Selezionare Esplora chip > Impostazione piastra campione e creare una nuova piastra campione. Selezionare il tipo di contenitore e il formato di contenitore appropriati (SBS96 per una piastra a 96 pozzetti utilizzata in questo esperimento rappresentativo).
    2. Incollare le etichette di esempio nel foglio di calcolo del software secondo il progetto sperimentale e selezionare Mappa dal menu Attività. Selezionare SBS96-Left.dsp. La configurazione di esempio è ora mappata. Selezionare Visualizzazione dettagli > Analizza per aggiornare le modifiche nel file.
      NOTA: qualsiasi modifica apportata a questo software non verrà salvata finché non si fa clic sul pulsante Analizza .
  3. Definire gli esempi di controllo nel software. Selezionare le celle per i campioni di controllo facendo clic con il pulsante sinistro del mouse e tenendo premuto mentre si trascinano le celle per la selezione. Le singole celle possono essere selezionate tenendo premuto il tasto Ctrl e facendo clic sulle singole celle. Per i campioni standard di RNA (serie di diluizione), inserire il nome del campione e la concentrazione di RNA utilizzata. Fare clic su Analizza per salvare.
  4. Definire la configurazione del rivelatore simile al punto 8.2 precedente ma con i nomi dei saggi RT-qPCR, cioè i nomi dei geni saggiati. Selezionare Detector Plate Setup (Impostazione piastra rivelatore ) e creare una nuova piastra di analisi. Selezionare il tipo e il formato del contenitore appropriato (SBS96 per una piastra da 96 pozzetti). Incollare i nomi dei test secondo il disegno sperimentale e fare clic su Analizza per salvare.
  5. Iniziare il processo di controllo qualità dell'utente (QC) come descritto di seguito.
    NOTA: questo esperimento rappresentativo ha utilizzato un metodo di soglia del tempo di ciclo (Ct). Cioè, i campioni che non hanno raggiunto un segnale di soglia definito dal software (Auto Global) o manualmente (User Global) saranno considerati reazioni non riuscite e non inclusi nel set di dati.
    1. Selezionare Vista analisi > Task Frame. Nel riquadro delle impostazioni di analisi, modificare le impostazioni in Auto globale (calcola automaticamente una soglia applicata all'intero chip) o Globale utente. Impostate la correzione della linea di base su derivata lineare. Se si utilizza User Global, la soglia di errore deve essere determinata manualmente come nell'esperimento rappresentativo.
    2. Questo esperimento rappresentativo ha utilizzato una regola di controllo qualità come segue: se un singolo test o campione aveva un tasso di errore del 70% o superiore, l'intera riga o colonna nel set di dati non è riuscita.
    3. Rivedere manualmente ogni reazione nel chip 96 x 96. Visualizza le curve di amplificazione e le curve di fusione per valutare se ogni reazione ha seguito il modello qPCR previsto. Se la curva di amplificazione o fusione non corrisponde a quanto previsto, fallire quella reazione.
  6. Dopo Controllo qualità, esportare i dati selezionando File > Esporta e salvare il set di dati come file di .csv.
  7. Eliminare il dataset poiché il file .csv esportato ha sia una matrice Pass-Fail che una matrice con valori Ct non elaborati. Utilizzare la matrice Pass-Fail per sostituire eventuali celle guaste nel set di dati con NA.
  8. Scaricare la versione più aggiornata del software R open source, quindi scaricare l'applicazione R-Studio. Caricare il set di dati normalizzato in R. Analizzare i dati idonei allo studio.
  9. Normalizzare il set di dati utilizzando il metodo -ΔΔCt come descritto di seguito.
    NOTA: la normalizzazione del gene di centraggio mediana o di pulizia può essere utilizzata in una riga campione per generareun valore t di -ΔC. Nell'esperimento rappresentativo, la centratura mediana è stata utilizzata e convalidata dalla normalizzazione del gene housekeeping. Questo può essere fatto in .csv formato o caricando su un software di analisi dei dati.
    1. Per la centratura mediana, calcolare il valore Ct mediano calcolato da tutti i valori Ct per un singolo campione (pool a 10 celle). Quindi, sottrarre tutti i singoli valori Ct da questo valore mediano. Questo produceun valore t -ΔC.
    2. Per la normalizzazione dei geni housekeeping, calcolare l'espressione media dei geni housekeeping (Actb, Gapdh e Ldha nell'esperimento rappresentativo) per ciascun campione e utilizzare questo valore come quello da cui sottrarre i singoli valori Ct.
    3. Per generare un valore t -ΔΔC, prendere la mediana di ogni colonna di analisi, che ora contieneil valore t -ΔC. Sottrarre la mediana del saggio da ciascun valore t -ΔC per produrreun valore t -ΔΔC.
  10. Calcola z-score perogni valore t -ΔΔC usando la funzione di scala in R. Utilizzare la funzione mappa di calore R o un software separato per generare una mappa di calore.
  11. Utilizzare la funzione di correlazione di Pearson per calcolare le correlazioni di Pearson tra ciascun gene. Utilizzare la funzione melt in R per organizzare il dataset per altre funzionalità. Esporta questi dati e caricali in un software di rete di correlazione genica.

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Risultati

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La convalida della raccolta a cella singola viene eseguita visivamente durante le procedure LCM. I nuclei cellulari vengono valutati presso la stazione di controllo qualità. Il tipo di cellula può essere determinato mediante emissione di fluoroforo marcato per quel tipo di cellula e la sua morfologia generale. Se sul cappuccio sono state selezionate cellule non desiderate, il loro materiale genetico può essere distrutto con un laser UV presso la stazione di controllo qualità. È inoltre necessaria un'ulteriore convalida m...

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Discussione

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Il disturbo da uso di alcol rimane una malattia difficile da trattare. Il nostro gruppo ha affrontato questo disturbo studiando i processi antiricompensa con una prospettiva di neuroscienza dei sistemi. Abbiamo misurato i cambiamenti di espressione genica nei singoli neuroni NTS e microglia in una serie temporale di astinenzada alcol 16. La NTS è stata scelta per il suo ruolo di primo piano nella disregolazione autonomica che si verifica nella sindrome da astinenza da alcol. Combiniamo LCM con RT-...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il lavoro qui presentato è stato finanziato attraverso NIH HLB U01 HL133360 assegnato a JS e RV, NIDA R21 DA036372 assegnato a JS e EVB, T32 AA-007463 assegnato a Jan Hoek a sostegno di SJO'S e National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
20X DNA BindingDye Fluidigm100-7609NA
2x GE Assay Caricamento reagenteFluidigm85000802-RNA
96.96 Dynamic Array IFC per l'espressione genica (indicato come chip qPCR nel testo)FluidigmBMK-M-96.96NA
Anti-Cd11β AnticorpoGenway BiotechCCEC48Microglia Stain
Anti-NeuN Anticorpo, clone A60EMD MilliporeMAB377Neurnal Stain
, Anticorpo anti-tirosina idrossilasi abcamab112Colorazione per neuroni TH+
ArcturusXT Laser Capture Microdissection SystemArcturusNA
NA Biomark HDFluidigmNART-qPCR piattaforma
Antigene sierico bovinoSigma-AldrichB4287
CapSure Macro LCM CapsThermoFisher Scientific  LCM0211
NA CellDirect One-Step qRT-PCR KitThermoFisher Scientific11753500Componenti della soluzione tampone di lisi
CellsDirect Resuspension & Kit tampone per lisiThermoFisher Scientific11739010Invitrogen
DAPIThermoFisher Scientific62248Tampone
TEKnovaT0221
Anticorpo secondario IgG (H+L) ReadyProbe anti-coniglio d'asino, Anticorpo secondario IgG (H+L) ReadyProbe anti-coniglio d'asino, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificR37118Seconadry Anticorpo
esonucleasi INew Englnad BioLabs, Inc.M0293SNA
ExtracSure Dispositivo di estrazione del campioneThermoFisher ScientificLCM0208NA
FisherbrandTM Superfrost Plus Vetrini per microscopioThermoFisher Scientific22-037-246Vetrini in vetro semplice
GeneAmp Tubo di reazione a parete sottileThermoFisher ScientificN8010611
IgG anti-topo di capra (H+L), anticorpo secondario ricombinante Superclona, Alexa Fluor 555ThermoFisher ScientificA28180Seconadry Anticorpo
IFC ControllerFluidigmNANA
RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen Supermix con Low RoxBio-RadPN 172-5211NA
SuperScript VILO Kit di sintesi cDNAThermoFisher Scientific11754250Contiene VILO e SuperScript
T4 Gene 32 ProteinaNew Englnad BioLabs, Inc.M0300SNA
TaqMan PreAmp Master MixThermoFisher Scientific4391128NA
TE TamponeTEKnovaT0225NA
TempPlate Piastra per PCR a 96 pozzetti semi-bordata, 0,2 mLUSA Scientific1402-9700NA
di sospensione DNA per colorazione del nucleo

Riferimenti

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