La combinazione di microdissezione a cattura laser e RT-qPCR microfluidica fornisce specificità anatomiche e biotecniche nella misurazione del trascrittoma nei singoli neuroni e glia. L'applicazione di metodi creativi con l'approccio biologico di un sistema alle malattie psichiatriche può portare a scoperte nella comprensione e nel trattamento come l'ipotesi dell'antiricompensa della neuroinfiammazione nella dipendenza.
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Articolo metodologico
Studiare i driver dell'antiricompensa nel comportamento di dipendenza con metodi di espressione genica anatomicamente specifici a singola cellula
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'aumento dei tassi di comportamento di dipendenza ha motivato ricercatori e medici di salute mentale a comprendere l'antiricompensa e il recupero. Questo allontanamento dalla ricompensa e dall'inizio richiede nuove prospettive, paradigmi e ipotesi insieme a un'espansione dei metodi applicati per indagare la dipendenza. Qui, forniamo un esempio: un approccio di biologia dei sistemi per studiare l'antiricompensa che combina la microdissezione a cattura laser (LCM) e le reazioni a catena quantitativa della polimerasi a trascrizione inversa microfluidica ad alto rendimento (RT-qPCR). Sono state misurate le dinamiche della rete di espressione genica ed è stato identificato un fattore chiave della disregolazione neuroviscerale nell'astinenza da alcol e oppioidi, la neuroinfiammazione. Questa combinazione di tecnologie fornisce specificità anatomica e fenotipica a risoluzione di una singola cellula con sensibilità ad alto rendimento e misure specifiche di espressione genica che producono sia set di dati che generano ipotesi che possibilità meccanicistiche che generano opportunità per nuove intuizioni e trattamenti.
Introduzione
La dipendenza rimane una sfida crescente nel mondo sviluppato 1,2. Nonostante i grandi progressi scientifici e clinici, i tassi di dipendenza continuano ad aumentare mentre l'efficacia dei trattamenti consolidati rimane stabile nel migliore dei casi 3,4,5. Tuttavia, i progressi nella biotecnologia e negli approcci scientifici hanno portato a nuovi metodi e ipotesi per indagare ulteriormente la fisiopatologia della dipendenza da sostanze 6,7,8....
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Protocollo
Questo studio è stato condotto in conformità con le raccomandazioni del Comitato per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Thomas Jefferson University. Il protocollo è stato approvato dalla Thomas Jefferson University IACUC.
1. Modello animale
- Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, USA) tre gemelli di ratto singolarmente con libero accesso a etanolo-chow (2 ratti) o miscela control-chow (1 ratto).
NOTA: Questo esperimento rappresentativo ha impiegato il protocollo Lieber-DeCarli per studiare la neurobiologia dell'astinenza da alcol25,26....
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Risultati
La convalida della raccolta a cella singola viene eseguita visivamente durante le procedure LCM. I nuclei cellulari vengono valutati presso la stazione di controllo qualità. Il tipo di cellula può essere determinato mediante emissione di fluoroforo marcato per quel tipo di cellula e la sua morfologia generale. Se sul cappuccio sono state selezionate cellule non desiderate, il loro materiale genetico può essere distrutto con un laser UV presso la stazione di controllo qualità. È inoltre necessaria un'ulteriore convalida m.......
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Discussione
Il disturbo da uso di alcol rimane una malattia difficile da trattare. Il nostro gruppo ha affrontato questo disturbo studiando i processi antiricompensa con una prospettiva di neuroscienza dei sistemi. Abbiamo misurato i cambiamenti di espressione genica nei singoli neuroni NTS e microglia in una serie temporale di astinenzada alcol 16. La NTS è stata scelta per il suo ruolo di primo piano nella disregolazione autonomica che si verifica nella sindrome da astinenza da alcol. Combiniamo LCM con RT-.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Il lavoro qui presentato è stato finanziato attraverso NIH HLB U01 HL133360 assegnato a JS e RV, NIDA R21 DA036372 assegnato a JS e EVB, T32 AA-007463 assegnato a Jan Hoek a sostegno di SJO'S e National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 20X DNA Binding | Dye Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Caricamento reagente | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC per l'espressione genica (indicato come chip qPCR nel testo) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Anticorpo | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Anticorpo, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neurnal Stain |
| , Anticorpo anti-tirosina idrossilasi abcam | ab112 | Colorazione per neuroni TH+ | |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | |
| NA Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR piattaforma |
| Antigene sierico bovino | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | |
| NA CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Componenti della soluzione tampone di lisi |
| CellsDirect Resuspension & Kit tampone per lisi | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Tampone |
| TEKnova | T0221 | ||
| Anticorpo secondario IgG (H+L) ReadyProbe anti-coniglio d'asino, Anticorpo secondario IgG (H+L) ReadyProbe anti-coniglio d'asino, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Anticorpo |
| esonucleasi I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Dispositivo di estrazione del campione | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Vetrini per microscopio | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Vetrini in vetro semplice |
| GeneAmp Tubo di reazione a parete sottile | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| IgG anti-topo di capra (H+L), anticorpo secondario ricombinante Superclona, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Anticorpo |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix con Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO Kit di sintesi cDNA | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contiene VILO e SuperScript |
| T4 Gene 32 Proteina | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Tampone | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Piastra per PCR a 96 pozzetti semi-bordata, 0,2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
Riferimenti
- Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020).
- Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020).
- Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence.
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Ristampe e permessi
