Articolo metodologico

Microtrapianto di membrane sinaptiche per riattivare i recettori sinaptici umani per studi funzionali

DOI:

10.3791/64024

⸱

20 luglio 2022

 ,  ,  , 
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo dimostra che eseguendo il microtrapianto di membrane sinaptiche negli ovociti di Xenopus laevis, è possibile registrare risposte coerenti e affidabili dei recettori dell'acido α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolepropionico e dell'acido γ-aminobutirrico.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I recettori ionotropici eccitatori e inibitori sono le principali porte dei flussi ionici che determinano l'attività delle sinapsi durante la fisiologica comunicazione neuronale. Pertanto, alterazioni nella loro abbondanza, funzione e relazioni con altri elementi sinaptici sono state osservate come un importante correlato di alterazioni nella funzione cerebrale e deterioramento cognitivo nelle malattie neurodegenerative e nei disturbi mentali. Comprendere come la funzione dei recettori sinaptici eccitatori e inibitori sia alterata dalla malattia è di fondamentale importanza per lo sviluppo di terapie efficaci. Per ottenere informazioni rilevanti per la malattia, è importante registrare l'attività elettrica dei recettori dei neurotrasmettitori che rimangono funzionali nel cervello umano malato. Finora questo è l'approccio più vicino per valutare le alterazioni patologiche nella funzione dei recettori. In questo lavoro, viene presentata una metodologia per eseguire il microtrapianto di membrane sinaptiche, che consiste nel riattivare le membrane sinaptiche dal tessuto cerebrale umano congelato a scatto contenente recettori umani, mediante la sua iniezione e fusione posteriore nella membrana degli ovociti di Xenopus laevis . Il protocollo fornisce anche la strategia metodologica per ottenere risposte coerenti e affidabili dei recettori dell'acido α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolepropionico (AMPA) e dell'acido γ-aminobutirrico (GABA), nonché nuovi metodi dettagliati che vengono utilizzati per la normalizzazione e l'analisi rigorosa dei dati.

Introduzione

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Le malattie neurodegenerative colpiscono una grande percentuale della popolazione. Sebbene le loro conseguenze devastanti siano ben note, il legame tra le alterazioni funzionali dei recettori dei neurotrasmettitori, che sono fondamentali per la funzione cerebrale, e la loro sintomatologia è ancora poco compreso. Variabilità interindividuale, natura cronica della malattia e insorgenza insidiosa dei sintomi sono solo alcuni dei motivi che hanno ritardato la comprensione dei numerosi disturbi cerebrali in cui gli squilibri chimici sono ben documentati 1,2. I modelli animali hanno generato informazioni preziose e ampliato le nostre conoscenze sui meccanismi alla base della fisiologia e della fisiopatologia nei sistemi evolutivi conservati; tuttavia, diverse differenze interspecie tra roditori e umani precludono l'estrapolazione diretta della funzione del recettore da modelli animali al cervello umano3. Pertanto, gli sforzi iniziali per studiare i recettori umani nativi sono stati sviluppati dal laboratorio di Ricardo Miledi utilizzando tessuto rimosso chirurgicamente e campioni congelati. Questi esperimenti iniziali hanno utilizzato intere membrane che includono recettori sinaptici neuronali e extra sinaptici e recettori neurotrasmettitori non neuronali e, sebbene forniscano importanti informazioni sugli stati patologici, c'è la preoccupazione che il mix di recettori complichi l'interpretazione dei dati 4,5,6,7. È importante sottolineare che le sinapsi sono l'obiettivo principale in molti disturbi neurodegenerativi 8,9; pertanto, i saggi per testare le proprietà funzionali delle sinapsi colpite sono fondamentali per ottenere informazioni sui cambiamenti rilevanti per la malattia che influenzano la comunicazione sinaptica. Qui viene descritta una modifica del metodo originale: microtrapianto di membrane sinaptiche (MSM), che si concentra sulla caratterizzazione fisiologica di preparati proteici sinaptici arricchiti ed è stato applicato con successo per studiare sinaptosomi di ratto e umani 10,11,12,13,14,15 . Con questa metodologia, è possibile trapiantare recettori sinaptici che una volta lavoravano nel cervello umano, incorporati nei propri lipidi nativi e con la propria coorte di proteine associate. Inoltre, poiché i dati MSM sono quantitativi, è possibile utilizzare questi dati per integrarsi con grandi set di dati proteomici o di sequenziamento10.

È importante notare che molte analisi farmacologiche e biofisiche dei recettori sinaptici sono fatte su proteine ricombinanti16,17. Mentre questo approccio fornisce una migliore comprensione delle relazioni struttura-funzione dei recettori, non può fornire informazioni sui complessi complessi di recettori multimerici trovati nei neuroni e sui loro cambiamenti nella malattia. Pertanto, una combinazione di proteine native e ricombinanti dovrebbe fornire un'analisi più completa dei recettori sinaptici.

Esistono molti metodi per preparare i sinaptosomi 10,11,12,13,14,15 che possono essere regolati per le esigenze di un laboratorio. Il protocollo inizia con il presupposto che i preparati arricchiti sinaptosomiali sono stati isolati e sono pronti per essere elaborati per esperimenti di microtrapianto. In laboratorio, il metodo Syn-Per viene utilizzato seguendo le istruzioni del produttore. Questo viene fatto a causa dell'elevata riproducibilità negli esperimenti elettrofisiologici10,11. C'è anche un'abbondante letteratura che spiega come isolare gli ovociti Xenopus 18,19, che possono anche essere acquistati pronti per l'iniezione20.

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Protocollo

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Tutte le ricerche sono eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della California Irvine (IACUC-1998-1388) e dall'Università del Texas Medical Branch (IACUC-1803024). La corteccia temporale di un cervello non di Alzheimer (AD) (femmina, 74 anni, intervallo post-mortem 2,8 h) e un cervello AD (femmina, 74 anni, intervallo post mortem 4,5 h) sono stati forniti dal centro di ricerca sulla malattia di Alzheimer dell'Università della California Irvine (UCI-ADRC). Il consenso informato per la donazione di cervello è stato ottenuto da UCI-ADRC.

NOTA: il tessuto cerebrale umano non fissato deve essere trattato come una fonte di agenti patogeni trasmessi dal sangue (BBP). Di conseguenza, la formazione BBP è necessaria prima di iniziare gli esperimenti. Questo protocollo viene eseguito in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL2) secondo i requisiti BSL2. Le linee guida e le precauzioni all'interno del laboratorio includono: non sono ammessi cibi o bevande in laboratorio, devono essere seguite buone pratiche di laboratorio, sono necessari dispositivi di protezione individuale (guanti, camice, scarpe aperte) e la porta deve essere chiusa in ogni momento.

1. Preparazione per la microiniezione di ovociti Xenopus

  1. Per fare aghi per iniezione, tirare tubi di borosilicato da 3,5 pollici usando un estrattore di micropipette. Una volta estratti gli aghi per microiniezione, utilizzare un microscopio e una lama di rasoio per tagliare abbastanza della punta dell'ago in modo che la microiniezione possa essere eseguita (di solito tra 2-3 mm).
    NOTA: La lunghezza della punta dell'ago da tagliare può variare.
  2. Preparare 1x soluzione di Barth aggiungendo 200 mL di soluzione madre di Barth (5x) a 800 ml di acqua distillata. Riempire una piastra di coltura tissutale a fondo piatto a 24 pozzetti con 18 °C 1x soluzione di Barth.
    1. Preparare la soluzione stock di Barth 5x come segue. In 1 L di acqua distillata, aggiungere 25,71 g di NaCl (cloruro di sodio), 0,372 g di KCl (cloruro di potassio), 0,301 g di CaCl2 (dicloriuro di calcio), 0,389 g di Ca(NO3)2(4H2O) (nitrato di calcio tetraidrato), 1,01 g di MgSO4(7H2O) (solfato di magnesio eptaidrato), 1,008 g di NaHCO3 (bicarbonato di sodio), e 11,91 g di HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico).
  3. Isolare gli ovociti Xenopus utilizzando i protocolli descritti in18,19 e utilizzando 2x stereoscopio ingrandito, selezionando ovociti V-VI dall'aspetto sano. Posizionare circa 10 ovociti per pozzetto e utilizzare uno dei pozzetti per ospitare ovociti non iniettati da utilizzare come cellule di controllo durante l'esecuzione di registrazioni.
  4. Recupera una piccola capsula di Petri, alta 1 cm e 6 cm di diametro, e posiziona la rete di nylon all'interno in modo che copra il fondo del piatto. Quindi, versare 15 ml di 1x soluzione di Barth da utilizzare per eseguire microiniezioni degli ovociti.
  5. Posizionare un nanoiniettore lungo la linea mediana della piattaforma del microscopio. Ruotare il magnete in posizione Off e spostare lentamente il nanoiniettore nella posizione desiderata sostenendolo con attenzione. Quando il nanoiniettore è posizionato correttamente, riportare il magnete in posizione completamente on e assicurarsi che sia sicuro.
  6. Per una dimensione del campione di 50,6 nL, utilizzare le seguenti impostazioni sul lato del nanoiniettore: 1 è D (giù), 2 è D, 3 è U (su), 4 è D e 5 è U. Posizionare un pezzo di termoplastico autosigillante, o cappuccio del tubo microcentrifuga, sul supporto del microscopio, allineandolo con la traiettoria del nanoiniettore.
    NOTA: 50 nL è vicino alla quantità massima di materiale iniettato che il citoplasma può sopportare21.
  7. Riempire una siringa da insulina di circa la metà del suo volume con olio minerale (circa 0,5 ml / cc). Utilizzando questa siringa, riempire l'ago della microiniezione con olio minerale. Assicurarsi che una perla visibile di olio sia visibile sulla punta dell'ago.
  8. Esporre lo stantuffo del nanoiniettore ad un minimo di 1-2 cm. Fallo tenendo premuto il pulsante EMPTY fino a quando lo stantuffo è visibile alla lunghezza desiderata. Una volta esposto lo stantuffo, posizionare lentamente e con attenzione l'ago di vetro per microiniezione riempito di olio minerale sullo stantuffo del nanoiniettore e assicurarsi che si adatti bene attraverso l'O-ring di resistenza nero e si fermi all'anello di resistenza bianco. Assicurarsi di non piegare lo stantuffo del nanoiniettore nel processo.
  9. Una volta che l'ago di vetro per microiniezione è sicuro e in posizione, premere EMPTY per annullare eventuali bolle d'aria. Delicatamente, con un fazzoletto di carta, pulire l'olio minerale in eccesso.

2. Caricamento del campione

  1. Preparare preparati sinaptosomiali arricchiti (campioni) dalla regione di interesse del cervello umano come descritto in 10,11,12,13,14,15 e conservarli in aliquote di circa 5 μL a -80 °C fino al momento dell'iniezione.
  2. Prima dell'iniezione, trasferire l'aliquota sul ghiaccio bagnato e tenerla sul ghiaccio in ogni momento, ad eccezione della sonicazione e del recupero. Il numero e i tipi di campioni saranno determinati dal progetto sperimentale.
  3. Sonicare i campioni selezionati 3 volte in un bagno con ghiaccio bagnato galleggiante per evitare il riscaldamento del campione. Utilizzare 5 cicli s ogni volta, aspettando 1 minuto sul ghiaccio bagnato tra un ciclo e l'altro.
  4. Posizionare 1 μL di campione sul materiale termoplastico. Effettuare un rientro nella superficie, se necessario, prima del posizionamento del campione per impedire il movimento del campione.
  5. Utilizzare le manopole del manipolatore che tiene il nanoiniettore per posizionare l'ago e spostarlo verso il campione da riempire. Una volta che la punta dell'ago è nel campione, tenere premuto il pulsante FILL fino a quando non viene prelevato un campione sufficiente. Circa 0,5 μL sono necessari per 10 ovociti. Utilizzando le manopole, spostare l'ago del nanoiniettore nella posizione più alta.

3. Iniezione degli ovociti

NOTA: Le membrane sinaptosomiali standardizzate della corteccia di ratto vengono anche iniettate in tutti gli esperimenti in un insieme di ovociti per misurare i cambiamenti nella capacità di fusione tra diversi lotti di ovociti.

  1. Posizionare gli ovociti selezionati sulla piccola capsula di Petri che ha la rete di nylon montata e la soluzione di Barth (circa 10 ovociti). Disporre gli ovociti in modo che non siano uno sopra l'altro; questo sarà utile durante il processo di iniezione.
  2. Usando le manopole sul manipolatore che tiene il nanoiniettore, spostare l'ago verso gli ovociti. Una volta che l'ago è immerso nella soluzione di Barth, utilizzare il pedale per il nanoiniettore per assicurarsi che l'ago per microiniezione stia rilasciando il campione. Se il campione viene rilasciato, sarà visibile dalla vista del microscopio.
  3. Una volta stabilito con sicurezza che il campione viene rilasciato, passare alla microiniezione dell'ovocita. Se il campione non viene rilasciato, ripetere il processo di riempimento dell'ago.
  4. Penetrare l'ovocita appena sotto la superficie con l'ago, non più in profondità, e utilizzare il pedale per iniettare il campione. Il pedale emetterà un segnale acustico quando il campione viene rilasciato. Attendere circa 2-3 s. Se l'iniezione ha avuto successo, la cellula si espanderà. Una volta che ciò accade, utilizzare le manopole sul manipolatore per uscire dalla cella.
    NOTA: La fusione delle membrane nell'ovocita è un processo polarizzato; pertanto, l'ovocita deve essere iniettato nel lato animale della cellula, preferibilmente sopra l'equatore, con l'angolo dell'ago verso il lato animale per massimizzare la fusione della membrana.
  5. Spostare la capsula di Petri in modo che l'ovocita successivo sia allineato con l'ago e ripetere il processo fino a quando tutti gli ovociti nella parabola sono stati iniettati. Ripetere questo processo fino a quando non è stato iniettato il numero desiderato di ovociti. Assicurarsi che un pozzetto di ovociti sia lasciato non iniettato per essere utilizzato come controllo.
  6. Una volta che tutti gli ovociti sono stati iniettati, ritrarre il nanoiniettore nella sua posizione originale e rimuovere l'ago.

4. Registrazione delle correnti ioniche utilizzando un morsetto di tensione a due elettrodi

  1. Per realizzare due aghi per elettrodi a morsetto di tensione (TEVC), tirare tubi di vetro borosilicato lucidato a fuoco lunghi 15 cm utilizzando l'estrattore di micropipette. Una volta completata la trazione, riempire con 3 M KCl utilizzando lunghi aghi capillari o, in alternativa, immergere e far bollire gli aghi in soluzione da 3 M KCl per 15 minuti sotto vuoto continuo. L'alta temperatura aiuta nel riempimento degli elettrodi e nella rimozione delle bolle d'aria.
    1. Preparare una soluzione di riempimento dell'elettrodo 3 M KCl utilizzando KCl nella forma cristallina e acqua deionizzata e seguendo attentamente questi passaggi in modo che il potenziale di riferimento degli elettrodi non venga modificato. Asciugare accuratamente il KCl in un forno per 2-3 ore. Utilizzando una bilancia analitica, pesare attentamente 223,68 g di KCl. Trasferire il KCl in una bottiglia di vetro da 1 L. Utilizzare questa soluzione per clorurare i fili degli elettrodi d'argento.
      NOTA: Per tirare elettrodi di vetro, il libro di cucina della pipetta può essere scaricato qui: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.
  2. Accendere tutte le apparecchiature utilizzate per la registrazione delle correnti ioniche: sistemi principali, valvole di soluzione, luce del microscopio, sistemi di valvole, morsetto per ovociti e sistema di vuoto. Accendere il computer desktop, accedere a WinEDR V3.9.1. e assicurarsi che il programma sia in esecuzione e che i valori di installazione siano corretti come segue: registrare su disco, impostare la durata della registrazione e cancellare l'opzione del simulatore.
    1. Fornire i seguenti valori di configurazione iniziali per l'amplificatore: per la sezione dell'elettrodo di tensione (Vm), disattivare la compensazione della capacità negativa (-C); per la sezione degli elettrodi da bagno (Im), impostare l'interruttore del selettore di guadagno (intervallo da 0,1 a 10) a 10 e l'interruttore a levetta a tre posizioni che seleziona il moltiplicatore di guadagno (x0,1, x1,0 e x10), a x1,0. Le luci a LED indicheranno la selezione del moltiplicatore di guadagno; per la sezione morsetto, spegnere il selettore della modalità morsetto, impostare il controllo del guadagno DC su IN e il controllo del guadagno a larghezza di banda intera ad anello aperto (intervallo da 0 a 2000) a circa 1200; per i comandi, impostare a 40mV e impostare i controlli di attesa negativa e moltiplicatore di scala per essere in x2; per l'elettrodo corrente, utilizzare l'offset Ve per stabilire un riferimento zero prima di impalare l'ovocita.
    2. Per registrare, aprire il software WinEDR V3.9.1, andare al menu in alto e selezionare File > Apri nuovo file. Crea la tua cartella e salva il file.
    3. Quindi, nel menu principale selezionare Registra > Registra su disco. Quando i due elettrodi si trovano all'interno dell'ooctyte, accendere la suoneria nel controller della valvola VC-8 e ruotare il morsetto su Slow nell'amplificatore OC-725C. Quindi, torna al software WinEDR e seleziona Registra in alto a sinistra dello schermo.
    4. Nel grafico dei segni in basso a sinistra, annotare il potenziale di membrana iniziale e premere Invio. Mentre l'esperimento continua, puoi scrivere il nome dei farmaci utilizzati. Una volta terminato l'esperimento, seleziona Interrompi in alto a sinistra dello schermo.
      NOTA: Utilizziamo il software WinEDR o WinWCP per eseguire TEVC perché questi sono gratuiti e adatti per gli esperimenti, ma è possibile utilizzare qualsiasi altro software disponibile.
  3. Costituisci tutte le soluzioni farmacologiche necessarie per eseguire l'esperimento (ad esempio, GABA, Kainate) e conferma che le valvole della soluzione funzionino correttamente accendendole e spegnendole e osservando lo spostamento delle valvole a manicotto.
  4. Riempire i tubi versando la soluzione corrispondente sul recipiente della siringa collegato al tubo ed etichettare il controller della valvola in modo che sia correlato con i tubi della soluzione. Assicurarsi che il flusso di soluzione sia costante, che non ci siano bolle e che il sistema di vuoto funzioni correttamente.
  5. Impostare il microscopio e l'area della camera di registrazione. Posizionare i ponti di agar (vedi sotto) nei rispettivi fori circolari dietro la camera di registrazione (distale dall'area di movimentazione), collegando i pozzetti per gli elettrodi utilizzati come riferimento a terra e la camera di registrazione. Aggiungere la soluzione di lavoro di Ringer (1x) alla camera di registrazione e ai pozzetti degli elettrodi di riferimento a terra.
    1. I ponti di agar sono tubi borosilicati a forma di U, lunghi 2-3 cm, riempiti con agar al 3% nella soluzione di Ringer. Realizza tubi a forma di U tagliando tubi lunghi 15 cm, piegandoli sulla fiamma libera e quindi riempiendoli con agar caldo al 3% usando una siringa da insulina. Conservare i ponti di agar riempiti nella soluzione di Ringer in frigorifero fino all'uso.
    2. Produrre 20x soluzione madre di Ringer come segue: In 1 L di acqua distillata, aggiungere 134,4 g di NaCl, 2,982 g di KCl, 5,29 g di CaCl2 e 23,83 g di HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico). Per 1x soluzione di lavoro di Ringer, in un pallone volumetrico, aggiungere 200 mL di soluzione madre di Ringer (20x) a 3.800 mL di acqua distillata.
  6. Preparare elettrodi di argento clorurato prima di ogni esperimento per elettrolisi posizionando fili d'argento in soluzione 3 M KCl e collegando l'elettrodo d'argento al terminale positivo di una batteria da 9 V. Dopo circa 3 minuti un solido strato marrone di AgCl viene depositato nell'elettrodo. Posizionare i fili dell'elettrodo in argento clorurato nell'alloggiamento dell'elettrodo.
    NOTA: gli elettrodi clorurati di riferimento a terra e di registrazione sono elettrodi di cloruro d'argento/argento (Ag/AgCl).
  7. Rimuovere gli aghi borosilicati dalla soluzione KCl. Utilizzare una siringa per estrarre una piccola quantità di soluzione di KCl dall'estremità aperta dell'ago dell'elettrodo e sostituire la soluzione di KCl con olio minerale; ciò eviterà l'evaporazione dell'acqua e le variazioni della concentrazione di KCl all'interno dell'ago. Far scorrere l'ago di vetro sul filo dell'elettrodo d'argento clorurato e stringerli in posizione.
  8. Utilizzando i manipolatori destro e sinistro che tengono gli elettrodi, guidare gli aghi dell'elettrodo nella camera di registrazione che è riempita con la soluzione di Ringer.
  9. Controllare la resistenza di ciascun elettrodo azzerando le manopole di offset Vm e Ve e quindi premendo i pulsanti Di test dell'elettrodo . La resistenza dovrebbe essere compresa tra 0,5-3 MΩ (letto direttamente come 5-30 mV nello schermo). Se la resistenza è fuori dall'intervallo, sostituire utilizzando nuovi microelettrodi.
  10. Riempi la camera di registrazione con la nuova soluzione di Ringer. Utilizzando una pipetta di vetro, posizionare un ovocita non iniettato o microtrapiantato al centro della camera di registrazione. Assicurarsi che l'ovocita sia chiaramente visibile al microscopio, con il lato animale verso l'alto (vedere NOTA al punto 3.4).
  11. Guidare l'elettrodo nella soluzione di Ringer fino a quando non toccano la membrana dell'ovocita. Perforare delicatamente la membrana dell'ovocita nel lato animale (vedere NOTA al punto 3.4) con entrambi gli elettrodi e registrare il potenziale di membrana a riposo. Attivare il flusso di soluzione della suoneria.
  12. Utilizzando l'amplificatore a morsetto per ovociti, cambiare la modalità su Voltage Clamp e impostare la tensione di mantenimento di -80 mV. La corrente sul monitor dovrebbe essere negativa, di solito tra 0 e 0,4 microampere.
  13. Creare un nuovo file per salvare la registrazione come File > Nuovo > Salva la registrazione sul software. Avviare la registrazione, premere Registra > Registra su disco. Aggiungere informazioni pertinenti al file utilizzando la finestra di dialogo della casella di marcatura (nome del test, farmaci utilizzati, ecc.).
  14. Applicare agonisti (ad esempio, GABA, glutammato o kainato) per la stimolazione chimica aprendo le valvole e perfondendole nella camera di registrazione per 15 s. Di solito, utilizzare un guadagno di 10x per tracciare il numero massimo di punti e ricostruire la risposta. Se le correnti sono molto piccole, aumentare l'amplificazione, o guadagno, in modo che possano essere valutate e visibili. Prendi sempre nota di queste modifiche.
    NOTA: La durata della perfusione dipende dal paradigma sperimentale. Se l'obiettivo principale è misurare l'ampiezza massima, 15 s saranno sufficienti per raggiungere il picco per GABA o il plateau per kainate.
  15. Monitorare sempre i livelli di soluzione. La soluzione di Ringer dovrà essere ricaricata frequentemente poiché viene utilizzata tra tutti gli usi della soluzione. Una volta completata la registrazione, ruotare il morsetto di tensione in posizione OFF e spegnere la valvola della soluzione di Ringer. Rimuovere l'ovocita. Interrompere la registrazione e salvare il file. Ripetere questi passaggi per tutti gli ovociti iniettati.

5. Analisi delle registrazioni TEVC

  1. Salvare una copia delle registrazioni su un'unità USB. Da lì, apri il file desiderato da analizzare. Nel file che si apre, la registrazione può essere visualizzata, contrassegnata e misurata. L'analisi più comune include la misurazione dell'ampiezza massima, del tempo di attivazione, della desensibilizzazione e del rundown di applicazioni ripetitive.
  2. Misurare la risposta massima AMPA e la risposta di picco GABA. Per acquisire queste misurazioni, stabilire innanzitutto un livello zero o una linea di base trovando la linea rossa con il cursore e trascinandola alla corrente generata dall'applicazione Ringer o dalla linea di base.
  3. Una volta stabilito il livello zero, determinare le misurazioni della risposta utilizzando il mouse per trascinare il cursore di lettura verticale verde sulla parte desiderata del tracciante grafico. Se lo si desidera, esportare le tracce da analizzare in qualsiasi altro software preferito
    NOTA: se il livello zero non può essere definito o c'è troppo rumore indicato sul tracciante, esportare il file WinEDR in un software analitico offline, che consentirà modifiche per fornire una linea di base di livello e l'aggiunta di filtri al fine di ridurre il rumore.

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Risultati

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Entro poche ore dall'iniezione, le membrane sinaptiche, che trasportano i loro recettori dei neurotrasmettitori e i canali ionici, iniziano a fondersi con la membrana plasmatica degli ovociti. La Figura 1 mostra le registrazioni dei recettori AMPA e GABAA microtrapiantati in ovociti Xenopus. Per la maggior parte dell'analisi, sono state misurate le risposte di due o tre ovociti per campione, utilizzando due o tre lotti di ovociti di rane diverse, per un totale di sei-nove...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'analisi dei complessi proteici nativi del cervello umano è necessaria per comprendere i processi omeostatici e patologici nei disturbi cerebrali e sviluppare strategie terapeutiche per prevenire o curare le malattie. Pertanto, le banche del cervello contenenti campioni congelati a scatto sono una fonte inestimabile di una grande e per lo più non sfruttata ricchezza di informazioni fisiologiche29,30. Una preoccupazione iniziale per l'uso del tessuto post-mortem ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIA/NIH R01AG070255 e R01AG073133 ad AL. Ringraziamo anche il centro di ricerca sulla malattia di Alzheimer dell'Università della California Irvine (UCI-ADRC) per aver fornito il tessuto umano mostrato in questo manoscritto. L'UCI-ADRC è finanziato dalla sovvenzione NIH/NIA P30 AG066519.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Per microiniezione
3,5" Capillari in vetroDrummond3-000-203-G/X
24 pozzetti, fondo piatto Piastra di coltura tissutaleThermofisherFB012929
Estrattore per micropipette di tipo fiammante/marroneSutterP-1000
Thermofisher08-772B
Provette per microcentrifugaThermofisher02-682-002
Olio mineraleThermofisherO121-1
Nanoject IIDrummond3-000-204
Rete di nylonRete industrialeWN0800
ParafilmThermofisherS37440
StereoscopioFisher Scientific03-000-037
SiringaThermofisher14-841-31
Bagno di pulizia ad ultrasuoniThermofisherFS20D
Xenopus laevis raneXenopus 14217
Per due elettrodi Morsetto di tensione
15 cm di lunghezza capillari in vetro borosilicato lucidato a fuocoSutterB200-116-15
Qualsiasi computer PC o laptop
Filtro Bessel passa-bassoWarner InstrumentsStereoscopio LPF-8
Fisher Scientific03-000-037
Stazione di lavoro con morsetto di tensione a due elettrodiWarner InstrumentsTEV-700
ValveLink 8.2 Controller di perfusioneAutomate ScientificSKU:01-18
WInEDR Software liberoUniversità di Strathclyde Glasgowhttps://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
DAQ multifunzione Serie XNational InstrumentsNI USB-6341
Reagenti
Dicloruro di calcioThermofisherC79
Calcio nitrato tetraidratoThermofisherC109
CollagenasiSigma-AldrichC0130
GABASigma-AldrichA2129
HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico)ThermofisherBP310
Acido kainicoTocris0222
Solfato di magnesio eptaidratoThermofisherM63
Cloruro di potassioThermofisherP217
Bicarbonato di sodioThermofisherS233
Cloruro di sodioThermofisherS271-1
Ultrafree-0.1 µ m Filtro MC,Amicon
Piatto di iniezione

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Journal of Alzheimer's Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
  2. Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
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