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Articolo metodologico

In vitro Ricostituzione del citoscheletro di actina all'interno di vescicole unilamellari giganti

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DOI:

10.3791/64026

⸱

25 agosto 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

In questo articolo

Sommario

In questo manoscritto, dimostriamo le tecniche sperimentali per incapsulare il citoscheletro F-actina in vescicole lipidiche unilamellari giganti (chiamate anche liposomi) e il metodo per formare uno strato di F-actina che imita la corteccia nel foglietto interno della membrana liposomiale.

Abstract

Il citoscheletro di actina, il principale macchinario meccanico nella cellula, media numerose attività fisiche cellulari essenziali, tra cui la deformazione, la divisione, la migrazione e l'adesione cellulare. Tuttavia, lo studio della dinamica e della struttura della rete di actina in vivo è complicato dalla regolazione biochimica e genetica all'interno delle cellule vive. Per costruire un modello minimale privo di regolazione biochimica intracellulare, l'actina viene incapsulata all'interno di vescicole unilamellari giganti (GUV, chiamate anche liposomi). I liposomi biomimetici sono di dimensioni cellulari e facilitano una comprensione quantitativa delle proprietà meccaniche e dinamiche della rete del citoscheletro, aprendo una strada praticabile per la biologia sintetica bottom-up. Per generare liposomi per l'incapsulamento, viene utilizzato il metodo dell'emulsione invertita (noto anche come metodo di trasferimento dell'emulsione), che è una delle tecniche di maggior successo per incapsulare soluzioni complesse in liposomi per preparare vari sistemi di imitazione cellulare. Con questo metodo, una miscela di proteine di interesse viene aggiunta al tampone interno, che viene successivamente emulsionato in una soluzione di olio minerale contenente fosfolipidi per formare goccioline lipidiche monostrato. I liposomi desiderati sono generati da goccioline lipidiche monostrato che attraversano un'interfaccia lipide/olio-acqua. Questo metodo consente l'incapsulamento di polimeri di actina concentrati nei liposomi con i componenti lipidici desiderati, aprendo la strada alla ricostituzione in vitro di una rete di citoscheletri biomima.

Introduzione

Il citoscheletro di actina svolge un ruolo fondamentale nella costruzione dell'architettura intracellulare della cellula coordinando la contrattilità a livello molecolare e la generazione di forza 1,2,3. Di conseguenza, media numerose attività cellulari essenziali, tra cui la deformazione cellulare4,5, la divisione6, la migrazione 7,8 e l'adesione9. La ricostituzione in vitro delle reti di actina ha guadagnato enorme attenzione negli ultimi anni 10,11,12,13,14,15,16,17. L'obiettivo della ricostituzione è quello di costruire un modello minimo della cellula privo della complessa regolazione biochimica che esiste all'interno delle cellule vive. Ciò offre un ambiente controllabile per sondare specifiche attività intracellulari e facilita l'identificazione e l'analisi di diversi componenti del citoscheletro di actina18,19. Inoltre, l'incapsulamento di reti di actina in vitro all'interno di vescicole unilamellari giganti fosfolipidi (GUV, liposomi) fornisce uno spazio confinato ma deformabile con un confine semipermeabile. Imita il microambiente fisiologico e meccanico del macchinario dell'actina all'interno della cellula 9,20,21,22.

Tra i vari metodi per preparare i liposomi, il metodo di idratazione del film lipidico (noto anche come metodo del gonfiore) è una delle prime tecniche23. Il film lipidico secco idrata con l'aggiunta di tamponi, formando bolle membranose che alla fine diventano vescicole24. Per produrre vescicole più grandi con una resa più elevata, un metodo migliorato che avanza dal metodo di idratazione del film, noto come metodo di elettroformazione25, applica un campo elettrico CA per promuovere in modo efficiente il processo di idratazione26. I principali limiti di questi metodi basati sull'idratazione per l'incapsulamento di actina sono che ha una bassa efficienza di incapsulamento di proteine altamente concentrate ed è compatibile solo con specifiche composizioni lipidiche24. La tecnica dell'emulsione invertita, in confronto, ha meno limitazioni per i componenti lipidici e le concentrazioni proteiche20,27,28,29. In questo metodo, una miscela di proteine per l'incapsulamento viene aggiunta al tampone acquoso interno, che viene successivamente emulsionato in una soluzione di olio minerale contenente lipidi, formando goccioline monostrato lipidiche. Le goccioline lipidiche monostrato attraversano quindi un'altra interfaccia lipide/olio-acqua attraverso la centrifugazione per formare vescicole lipidiche a doppio strato (liposomi). Questa tecnica ha dimostrato di essere una delle strategie di maggior successo per l'incapsulamento di actina24,30. Separatamente, ci sono alcuni metodi di dispositivi microfluidici, tra cui il getto pulsato 31,32, l'espulsione transitoria della membrana33 e il metodo cDICE34. Le somiglianze tra il metodo dell'emulsione invertita e il metodo microfluidico sono il solvente lipidico (olio) utilizzato e l'introduzione dell'interfaccia lipide/olio-acqua per la formazione del foglietto esterno dei liposomi. Al contrario, la generazione di liposomi con il metodo microfluidico richiede una messa a punto di dispositivi microfluidici ed è accompagnata da olio intrappolato tra i due lembi del doppio strato, che richiede un passaggio supplementare per la rimozione dell'olio35.

In questo manoscritto, abbiamo usato la tecnica dell'emulsione invertita per preparare liposomi che incapsulano una rete polimerizzata F-actina come usato in precedenza22. La miscela proteica per l'incapsulamento è stata prima posta in un tampone con condizioni non polimerizzanti per mantenere l'actina nella sua forma globulare (G). L'intero processo è stato eseguito a 4 °C per prevenire la polimerizzazione precoce dell'actina, che è stata successivamente innescata consentendo al campione di riscaldarsi a temperatura ambiente. Una volta a temperatura ambiente, l'actina polimerizza nella sua forma filamentosa (F). Una varietà di proteine leganti l'actina può essere aggiunta alla soluzione tampone acquosa interna per studiare le funzionalità e le proprietà delle proteine, fornendo così ulteriori informazioni sulla sua interazione con la rete di actina e la superficie della membrana. Questo metodo può essere applicato anche all'incapsulamento di varie proteine di interesse36 e oggetti di grandi dimensioni (microparticelle, micronuotatori semoventi, ecc.) vicini alla dimensione dei liposomi finali 28,37.

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Protocollo

1. Preparazione di tamponi e soluzioni proteiche

  1. Preparare il tampone acquoso interno di non polimerizzazione (INP) in un volume totale di 5 mL miscelando 0,1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM saccarosio e0,2 mM ATP.
  2. Preparare il mix proteico (PM) aggiungendo proteine al tampone INP a 4 °C con le seguenti concentrazioni: 11,2 μM di G-actina non fluorescente, 2,8 μM di actina marcata con fluorescenza e 0,24 μM di Arp2/3 (Tabella dei materiali). Per formare uno strato di F-actina, aggiungere 100 nM gelsolina, 4 μM cofilina e 2,2 μM VCA-His al PM. Come esperimento di controllo, sostituire il PM con un colorante fluorescente da 100 μg/mL (Tabella dei materiali).
  3. Preparare il tampone acquoso di polimerizzazione interna (IP) (acquoso) in un volume totale di 5 mL miscelando 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP e 80 mM saccarosio.
  4. Preparare il tampone finale (FB) mescolando tampone INP (contenente PM) e tampone IP con un rapporto di volume di 1:1 per ottenere la soluzione acquosa interna in un volume totale di 30 μL che sarà incapsulato all'interno del liposoma.
  5. Preparare il tampone esterno acquoso (OB) in un volume totale di 150 μL miscelando 10 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM KCl, 2mM MgCl 2, 0,2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM glucosio e 0,1 mg/ml β-caseina.
    NOTA: L'osmolarità dell'OB può essere regolata con glucosio per garantire che la pressione osmotica dell'OB sia leggermente maggiore di quella dell'FB (20-60 mOsm). La densità dell'FB dovrebbe essere leggermente superiore all'OB.

2. Preparazione di liposomi basati sulle tecniche di emulsione invertita

  1. Preparare la miscela di lipidi e oli
    1. Aggiungere 100 μL di 25 mg/mL di L-α-fosfatidilcolina (PC uovo non fluorescente, chiamato anche EPC, incluso l'1% di DHPE) in un flaconcino di vetro. Far evaporare il cloroformio con gas argon, lasciando un film lipidico solido secco (2,5 mg) sul fondo del flaconcino.
      1. Per formare uno strato di F-actina, aggiungere 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{[n(5-ammino-1-carbossipentil) acido iminodiacetico] succinil} sale di nichel} (DOGS-NTA-Ni) in un rapporto 10:1 di EPC e DOGS-NTA-Ni e mescolare prima dell'evaporazione del cloroformio.
    2. Aggiungere 2 ml di olio minerale e sonicare la miscela di olio lipidico a temperatura ambiente in un bagno per 1 ora per risospendere i lipidi.
      NOTA: La miscela di olio lipidico dopo sonicazione può essere conservata per 1 settimana a 4 °C. La resonicazione è consigliata prima dell'uso.
  2. Preparare un'emulsione Final Buffer in olio (FB/olio) per la preparazione di goccioline lipidiche monostrato contenenti la proteina di interesse.
    1. A 100 μL di miscela di lipidi-olio presa in un tubo di plastica, aggiungere 10 μL di FB. Assicurati che FB sia in una goccia.
    2. Utilizzando una siringa di vetro, aspirare la miscela lipidi-olio-FB e aspirare delicatamente su e giù più volte per emulsionarla; aspirare prima una piccola quantità di miscela di olio lipidico e poi la goccia FB posizionando la punta della siringa alla periferia della goccia per scomporla in minuscole goccioline. Ripetere l'aspirazione su e giù fino a formare un'emulsione biancastra e torbida.
  3. Mettere 30 μL di OB in un tubo di plastica separato. Posizionare 30 μL della miscela di olio lipidico sopra OB e lasciarlo riposare per ~ 10 minuti per sviluppare un monostrato lipidico all'interfaccia.
    NOTA: Se i lipidi sono carichi o la proteina è incorporata, la durata di questo passaggio deve essere estesa38.
  4. Preparare i liposomi
    1. Aggiungere con cautela 50 μL di emulsione FB/olio (punto 2.2) alla fase superiore dell'olio del tubo dal punto 2.3.
    2. Centrifugare il tubo di plastica a 100 x g per 15 minuti a 4 °C. Variare il tempo e la velocità di centrifugazione per ottimizzare la formazione dei liposomi.
      NOTA: Dopo la centrifugazione, la fase superiore dell'olio dovrebbe essere chiara e l'OB inferiore (contenente liposomi) dovrebbe essere leggermente torbido.
    3. Rimuovere con cautela la fase dell'olio con la pipetta. Aspirare un volume extra se necessario. Assicurarsi di non mettere la punta della pipetta sul lato del tubo per evitare di creare un menisco di olio sopra la fase liposomica.
    4. Con una nuova pipetta, inserire lentamente la punta della pipetta nella fase inferiore rimanente e aspirare il volume acquoso per raccogliere i liposomi.
      NOTA: È meglio perdere volume che incorporare l'olio. L'inclusione di olio causerà la rottura dei liposomi e i componenti interni verranno rilasciati nel tampone esterno. Tagliare la punta di una pipetta per ridurre il taglio.

3. Osservazione al microscopio

  1. Versare 100 μL di OB nel pozzetto di una camera di incubazione (piastra a 4 pozzetti contenente vetrini rotondi da 12 mm). Depositare delicatamente i liposomi raccolti (punto 2.4.4) in OB, quindi posizionare un altro vetrino di copertura sulla parte superiore della camera.
    NOTA: L'OB contiene la β-caseina per passivare la superficie del vetro e ridurre al minimo l'attaccamento tra i liposomi20.
  2. Osservare i liposomi con un microscopio confocale utilizzando un obiettivo ad immersione in olio 63x. Utilizzare linee laser a 488 nm, 647 nm e 561 nm per osservare rispettivamente lipidi marcati con fluorescenza, coloranti fluorescenti incapsulati e actina marcata fluorescentmente incapsulata. Cattura i fotogrammi di interesse e salva le immagini in formato TIFF.
  3. Elaborare e analizzare le immagini in ImageJ/Fiji39. Per i nuovi utenti di ImageJ/Fiji, è disponibile un tutorial online (vedi Tabella dei materiali).
    1. Aprire il file TIFF utilizzando il software ImageJ/Fiji.
    2. Vai a Immagine > regola > luminosità/contrasto. Regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine sulla scala desiderata regolando le impostazioni Minimo e Massimo e i cursori Luminosità e Contrasto .
    3. Fare clic sullo strumento di selezione del rettangolo nella barra degli strumenti e selezionare la regione di interesse (ROI). Vai a Immagine > Ritaglia per ritagliare il ROI.
    4. Vai ad Analizzare > impostare la scala. Nella finestra pop-up, inserisci 1.0 nel campo Proporzioni pixel e imposta μm come unità di lunghezza. Nel campo Distanza in pixel, immettere la larghezza dell'immagine in pixel . Nel campo Distanza nota , inserisci la larghezza reale dell'immagine in micron.
    5. Per misurare la dimensione del liposoma, utilizzando lo strumento di selezione ovale nella barra degli strumenti, disegnare un cerchio lungo il bordo del liposoma. Vai su Analizza > misura per misurare l'area del cerchio, da cui è possibile calcolare il diametro del liposoma.

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Risultati

La preparazione dei liposomi basata sulla tecnica dell'emulsione invertita è illustrata graficamente e schematicamente nella Figura 1.

In primo luogo, sono stati preparati liposomi vuoti (~ 5-50 μm di diametro) composti da fosfolipidi (EPC) e lipidi fluorescenti (DHPE). Un colorante fluorescente brillante e rosso lontano è stato incapsulato all'interno di liposomi nudi come esperimento di controllo. Se un monostrato lipidico si è formato con successo nella perifer...

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Discussione

Diversi passaggi chiave determinano il successo di un'alta resa di liposomi durante il processo di preparazione. Per sciogliere completamente il film lipidico nell'olio, il campione deve essere sonicato fino a quando il film lipidico sul fondo della fiala di vetro scompare completamente. Dopo la sonicazione, la miscela di olio lipidico deve essere conservata durante la notte a temperatura ambiente in condizioni di oscurità affinché le molecole lipidiche si disperdano ulteriormente29. La miscela pu...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Riconosciamo il finanziamento di ARO MURI W911NF-14-1-0403 a M.P.M., il National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 a M.P.M., il National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 e Human Frontiers Science Program (HFSP) numero di sovvenzione RGY0073/2018 a M.P.M. Qualsiasi opinione, risultato, conclusione o raccomandazione espressa in questo materiale è quella degli autori e non riflette necessariamente le opinioni di ARO, NIH o HFSP. S.C. riconosce le fruttuose discussioni con V. Yadav, C. Muresan e S. Amiri.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
acido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{[n(5-ammino-1-carbossipentil)acido iminodiacetico]succinil} sale di nichel (DOGS-NTA-Ni) Avanti Polar Lipids Inc.231615773Nichel Lipide
1,4-Diazabiciclo[2.2.2]ottanoSigmaD27802-25GDABCO
Proteina actina (pura al >99%): muscolo scheletrico di coniglioCitoscheletro, IncAKL99-Dnon fluorescente G-actina
Proteina actina (rodamina): muscolo scheletrico di coniglioCitoscheletro, IncAR05actina marcata fluorescentemente
Adenosina 5′-trifosfato sale disodico idratoSigmaA2383-10GATP
Alexa Fluor 647 colorantefluorescenteThermoFisher
Andor iQ3Andor Technologiessoftware di controllo e acquisizione per microscopio confocale
Arp2/3 Complesso proteico: PorcineBrain Cytoskeleton, IncRP01P-AArp 2/3
Cloruro di calcio diidratoSigma10035048Camere CaCl2
Chamlide (4 pozzetti per vetrino coprioggetto rotondo da 12 mm)Camera di incubazioneQuorum Technologies
Proteina cofilina:citoscheletroCF01-Ccofilina
(obiettivo a immersione in olio 63>)Andor TechnologiesLEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSIO BIOXTRASigmaG7528
glucosio ditiotreitoloDOT Scientific DSD11000-10DTT
Proteina Gelsolina: Homo Sapiens Citoscheletro Ricombinante, IncHPG6gelsolin
Hamilton 1750 Siringa a tenuta di gas, 500 e micro; L, ago cementato, 22 G, punta conica da 2"Siringa in vetroCole-ParmerUX-07940-53
HEPESAmericanBio7365-45-9
ImageJ/Fijihttps://imagej.net/tutorials/
L-alfa-FosfatidilcolinaAvanti Polar Lipids Inc.97281442
EPC Cloruro di magnesioSigma7786303MgCl2
Mineral oil, BioReagent, per biologia molecolare, olio leggeroSigma8042475mineral
oil N-WASP fragment WWA (aa400– 501, VCA-His)VCA-His viene purificato utilizzando il protocollo di laboratorio. Il protocollo può essere fornito su richieste ragionevoli
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)Thermo FisherO12650DHPE
Cloruro di potassioSigma7447407KCl
SaccarosioSigma57-50-1saccarosio
β-Caseina da latte bovinoSigmaC6905-250MG
umano ricombinante, Inc Microscopio confocale

Riferimenti

  1. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
  2. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  3. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  4. Yousafzai, M., Yadav, V., Amiri, S., Errami, Y., Murrell, M. Active regulation of pressure and volume defines an energetic constraint on the size of cell aggregates. Physical Review Letters. 128 (4), 048103(2022).
  5. Simon, C., et al. Actin dynamics drive cell-like membrane deformation. Nature Physics. 15 (6), 602-609 (2019).
  6. Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Developmental Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
  7. Bray, D., White, J. Cortical flow in animal cells. Science. 239 (4842), 883-888 (1988).
  8. Beaune, G., et al. Spontaneous migration of cellular aggregates from giant keratocytes to running spheroids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12926-12931 (2018).
  9. Murrell, M. P., et al. Liposome adhesion generates traction stress. Nature Physics. 10 (2), 163-169 (2014).
  10. Lee, G., et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), (2021).
  11. Anderson, S., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  12. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  13. McCall, P. M., MacKintosh, F. C., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Cofilin drives rapid turnover and fluidization of entangled F-actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12629-12637 (2019).
  14. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nature Materials. 10 (6), 462-468 (2011).
  15. Koenderink, G. H., et al. An active biopolymer network controlled by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15192-15197 (2009).
  16. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  17. Tabatabai, A. P., et al. Detailed balance broken by catch bond kinetics enables mechanical-adaptation in active materials. Advanced Functional Materials. 31 (10), 2006745(2021).
  18. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  19. Murrell, M., Gardel, M. L. Actomyosin sliding is attenuated in contractile biomimetic cortices. Molecular Biology of the Cell. 25 (12), 1845-1853 (2014).
  20. Murrell, M., et al. Spreading dynamics of biomimetic actin cortices. Biophysical Journal. 100 (6), 1400-1409 (2011).
  21. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nature Physics. 4 (10), 789-793 (2008).
  22. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  23. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  24. Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annual Review of Biophysics. 50, 525-548 (2021).
  25. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  26. Limozin, L., Sackmann, E. Polymorphism of cross-linked actin networks in giant vesicles. Physical Review Letters. 89 (16), 168103(2002).
  27. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  28. Natsume, Y., et al. Preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion. Journal of Visualized Experiments. (119), e55282(2017).
  29. Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, I. s Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophysical Journal. 107 (2), 346-354 (2014).
  30. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  31. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesiclelike compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. Journal of the American Chemical Society. 129 (42), 12608-12609 (2007).
  32. Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T., Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 20 (23), 9905-9908 (2004).
  33. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  34. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  35. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  36. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  37. Vutukuri, H. R., et al. Active particles induce large shape deformations in giant lipid vesicles. Nature. 586 (7827), 52-56 (2020).
  38. Lemière, J., Carvalho, K., Sykes, C. Methods in Cell Biology. 128, Elsevier. 271-285 (2015).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Liman, J., et al. The role of the Arp2/3 complex in shaping the dynamics and structures of branched actomyosin networks. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (20), 10825-10831 (2020).
  41. Sun, Y., Leong, N. T., Wong, T., Drubin, D. G. A Pan1/End3/Sla1 complex links Arp2/3-mediated actin assembly to sites of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 26 (21), 3841-3856 (2015).
  42. Bretschneider, T., et al. Dynamic actin patterns and Arp2/3 assembly at the substrate-attached surface of motile cells. Current Biology. 14 (1), 1-10 (2004).
  43. Goley, E. D., et al. An actin-filament-binding interface on the Arp2/3 complex is critical for nucleation and branch stability. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 107 (18), 8159-8164 (2010).
  44. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. The Journal of Cell Biology. 145 (5), 1009-1026 (1999).
  45. Kelleher, J. F., Atkinson, S. J., Pollard, T. D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. The Journal of Cell Biology. 131 (2), 385-397 (1995).
  46. Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D., Lim, W. A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 290 (5492), 801-806 (2000).
  47. Delatour, V., et al. Arp2/3 controls the motile behavior of N-WASP-functionalized GUVs and modulates N-WASP surface distribution by mediating transient links with actin filaments. Biophysical Journal. 94 (12), 4890-4905 (2008).
  48. Izdebska, M., Zielińska, W., Hałas-Wiśniewska, M., Grzanka, A. Involvement of actin and actin-binding proteins in carcinogenesis. Cells. 9 (10), 2245(2020).
  49. Schäfer, E., Kliesch, T. -T., Janshoff, A. Mechanical properties of giant liposomes compressed between two parallel plates: impact of artificial actin shells. Langmuir. 29 (33), 10463-10474 (2013).
  50. Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  51. Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
  52. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  53. Vale, R. Reconstituting the Cytoskeleton. , Academic Press. (2014).
  54. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Mechanism of K+-induced actin assembly. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 648-654 (1982).
  55. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of pH on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 27 (20), 7766-7772 (1988).
  56. Wegner, A. M., et al. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the development of dendritic spines and synapses. Journal of Biological Chemistry. 283 (23), 15912-15920 (2008).
  57. Blanchoin, L., et al. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. Nature. 404 (6781), 1007-1011 (2000).
  58. Römer, W., et al. Actin dynamics drive membrane reorganization and scission in clathrin-independent endocytosis. Cell. 140 (4), 540-553 (2010).
  59. Popova, A. V., Hincha, D. K. Effects of flavonol glycosides on liposome stability during freezing and drying. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1858 (12), 3050-3060 (2016).
  60. Harrigan, P., Madden, T., Cullis, P. Protection of liposomes during dehydration or freezing. Chemistry and Physics of Lipids. 52 (2), 139-149 (1990).
  61. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9 (1), 467-508 (1980).
  62. Campillo, C., et al. Unexpected membrane dynamics unveiled by membrane nanotube extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  63. Deng, N. -N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. Monodisperse uni-and multicompartment liposomes. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  64. Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
  65. Sheung, J. Y., et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
  66. Falzone, T. T., Blair, S., Robertson-Anderson, R. M. Entangled F-actin displays a unique crossover to microscale nonlinearity dominated by entanglement segment dynamics. Soft Matter. 11 (22), 4418-4423 (2015).
  67. Francis, M. L., et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
  68. Yadav, V., et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243(2019).
  69. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Methods in Enzymology. 540, Elsevier. 265-282 (2014).

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