In questo manoscritto, dimostriamo le tecniche sperimentali per incapsulare il citoscheletro F-actina in vescicole lipidiche unilamellari giganti (chiamate anche liposomi) e il metodo per formare uno strato di F-actina che imita la corteccia nel foglietto interno della membrana liposomiale.
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Articolo metodologico
In vitro Ricostituzione del citoscheletro di actina all'interno di vescicole unilamellari giganti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il citoscheletro di actina, il principale macchinario meccanico nella cellula, media numerose attività fisiche cellulari essenziali, tra cui la deformazione, la divisione, la migrazione e l'adesione cellulare. Tuttavia, lo studio della dinamica e della struttura della rete di actina in vivo è complicato dalla regolazione biochimica e genetica all'interno delle cellule vive. Per costruire un modello minimale privo di regolazione biochimica intracellulare, l'actina viene incapsulata all'interno di vescicole unilamellari giganti (GUV, chiamate anche liposomi). I liposomi biomimetici sono di dimensioni cellulari e facilitano una comprensione quantitativa delle proprietà meccaniche e dinamiche della rete del citoscheletro, aprendo una strada praticabile per la biologia sintetica bottom-up. Per generare liposomi per l'incapsulamento, viene utilizzato il metodo dell'emulsione invertita (noto anche come metodo di trasferimento dell'emulsione), che è una delle tecniche di maggior successo per incapsulare soluzioni complesse in liposomi per preparare vari sistemi di imitazione cellulare. Con questo metodo, una miscela di proteine di interesse viene aggiunta al tampone interno, che viene successivamente emulsionato in una soluzione di olio minerale contenente fosfolipidi per formare goccioline lipidiche monostrato. I liposomi desiderati sono generati da goccioline lipidiche monostrato che attraversano un'interfaccia lipide/olio-acqua. Questo metodo consente l'incapsulamento di polimeri di actina concentrati nei liposomi con i componenti lipidici desiderati, aprendo la strada alla ricostituzione in vitro di una rete di citoscheletri biomima.
Introduzione
Il citoscheletro di actina svolge un ruolo fondamentale nella costruzione dell'architettura intracellulare della cellula coordinando la contrattilità a livello molecolare e la generazione di forza 1,2,3. Di conseguenza, media numerose attività cellulari essenziali, tra cui la deformazione cellulare4,5, la divisione6, la migrazione 7,8 e l'adesione9. La ricostituzione in vitro delle reti di actina ha guad....
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Protocollo
1. Preparazione di tamponi e soluzioni proteiche
- Preparare il tampone acquoso interno di non polimerizzazione (INP) in un volume totale di 5 mL miscelando 0,1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM saccarosio e0,2 mM ATP.
- Preparare il mix proteico (PM) aggiungendo proteine al tampone INP a 4 °C con le seguenti concentrazioni: 11,2 μM di G-actina non fluorescente, 2,8 μM di actina marcata con fluorescenza e 0,24 μM di Arp2/3 (Tabella dei materiali). Per formare uno strato di F-actina, aggiungere 100 nM gelsolina, 4 μM cofilina e 2,2 μM VCA-His al PM. Come esperimento di controllo,....
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Risultati
La preparazione dei liposomi basata sulla tecnica dell'emulsione invertita è illustrata graficamente e schematicamente nella Figura 1.
In primo luogo, sono stati preparati liposomi vuoti (~ 5-50 μm di diametro) composti da fosfolipidi (EPC) e lipidi fluorescenti (DHPE). Un colorante fluorescente brillante e rosso lontano è stato incapsulato all'interno di liposomi nudi come esperimento di controllo. Se un monostrato lipidico si è formato con successo nella perifer.......
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Discussione
Diversi passaggi chiave determinano il successo di un'alta resa di liposomi durante il processo di preparazione. Per sciogliere completamente il film lipidico nell'olio, il campione deve essere sonicato fino a quando il film lipidico sul fondo della fiala di vetro scompare completamente. Dopo la sonicazione, la miscela di olio lipidico deve essere conservata durante la notte a temperatura ambiente in condizioni di oscurità affinché le molecole lipidiche si disperdano ulteriormente29. La miscela pu.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Riconosciamo il finanziamento di ARO MURI W911NF-14-1-0403 a M.P.M., il National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 a M.P.M., il National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 e Human Frontiers Science Program (HFSP) numero di sovvenzione RGY0073/2018 a M.P.M. Qualsiasi opinione, risultato, conclusione o raccomandazione espressa in questo materiale è quella degli autori e non riflette necessariamente le opinioni di ARO, NIH o HFSP. S.C. riconosce le fruttuose discussioni con V. Yadav, C. Muresan e S. Amiri.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| acido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{[n(5-ammino-1-carbossipentil)acido iminodiacetico]succinil} sale di nichel (DOGS-NTA-Ni) | Avanti Polar Lipids Inc. | 231615773 | Nichel Lipide |
| 1,4-Diazabiciclo[2.2.2]ottano | Sigma | D27802-25G | DABCO |
| Proteina actina (pura al >99%): muscolo scheletrico di coniglio | Citoscheletro, Inc | AKL99-D | non fluorescente G-actina |
| Proteina actina (rodamina): muscolo scheletrico di coniglio | Citoscheletro, Inc | AR05 | actina marcata fluorescentemente |
| Adenosina 5′-trifosfato sale disodico idrato | Sigma | A2383-10G | ATP |
| Alexa Fluor 647 colorante | fluorescente | ThermoFisher | |
| Andor iQ3 | Andor Technologies | software di controllo e acquisizione per microscopio confocale | |
| Arp2/3 Complesso proteico: Porcine | Brain Cytoskeleton, Inc | RP01P-A | Arp 2/3 |
| Cloruro di calcio diidrato | Sigma | 10035048 | Camere CaCl2 |
| Chamlide (4 pozzetti per vetrino coprioggetto rotondo da 12 mm) | Camera di incubazione | Quorum Technologies | |
| Proteina cofilina: | citoscheletro | CF01-C | cofilina |
| (obiettivo a immersione in olio 63>) | Andor Technologies | LEICA DMi8 | |
| D-(+)-GLUCOSIO BIOXTRA | Sigma | G7528 | |
| glucosio ditiotreitolo | DOT Scientific | DSD11000-10 | DTT |
| Proteina Gelsolina: Homo Sapiens Citoscheletro Ricombinante | , Inc | HPG6 | gelsolin |
| Hamilton 1750 Siringa a tenuta di gas, 500 e micro; L, ago cementato, 22 G, punta conica da 2" | Siringa in vetro | Cole-Parmer | UX-07940-53 |
| HEPES | AmericanBio | 7365-45-9 | |
| ImageJ/Fiji | https://imagej.net/tutorials/ | ||
| L-alfa-Fosfatidilcolina | Avanti Polar Lipids Inc. | 97281442 | |
| EPC Cloruro di magnesio | Sigma | 7786303 | MgCl2 |
| Mineral oil, BioReagent, per biologia molecolare, olio leggero | Sigma | 8042475 | mineral |
| oil N-WASP fragment WWA (aa400– 501, VCA-His) | VCA-His viene purificato utilizzando il protocollo di laboratorio. Il protocollo può essere fornito su richieste ragionevoli | ||
| Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) | Thermo Fisher | O12650 | DHPE |
| Cloruro di potassio | Sigma | 7447407 | KCl |
| Saccarosio | Sigma | 57-50-1 | saccarosio |
| β-Caseina da latte bovino | Sigma | C6905-250MG |
Riferimenti
- Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
- Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Jour....
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Ristampe e permessi
