Questo protocollo descrive un'interruzione di 96 pozzi di singole Caenorhabditis elegans colonizzate battericamente a seguito di paralisi fredda e sbiancamento superficiale per rimuovere i batteri esterni. La sospensione risultante è placcata su piastre di agar per consentire una quantificazione accurata e di media produttività della carica batterica in un gran numero di singoli vermi.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Utilizzo di dati single-worm per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni caenorhabditis elegans-batteriche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il nematode Caenorhabditis elegans è un sistema modello per le interazioni ospite-microbo e ospite-microbioma. Molti studi fino ad oggi utilizzano digest batch piuttosto che singoli campioni di vermi per quantificare la carica batterica in questo organismo. Qui si sostiene che la grande variabilità inter-individuale osservata nella colonizzazione batterica dell'intestino di C. elegans è informativa e che i metodi di digestione batch scartano le informazioni che sono importanti per un confronto accurato tra le condizioni. Poiché la descrizione della variazione inerente a questi campioni richiede un gran numero di individui, viene stabilito un comodo protocollo a piastre a 96 pozzetti per l'interruzione e la placcatura della colonia di singoli vermi.
Introduzione
L'eterogeneità nelle associazioni ospite-microbo è osservata ovunque e la variazione tra gli individui è sempre più riconosciuta come un fattore che contribuisce ai processi a livello di popolazione dalla competizione e coesistenza1 alla trasmissione della malattia 2,3,4. In C. elegans, "eterogeneità nascosta" all'interno di popolazioni isogeniche è stata osservata ripetutamente, con sottopopolazioni di individui che mostrano fenotipi distinti nella risposta allo shock termico 5,6
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
I vermi utilizzati in questi esperimenti sono stati ottenuti dal Caenorhabditis Genetic Center, che è finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Bristol N2 è il wild-type. I mutanti DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) e daf-2(e1370) III (CGC CB1370) sono usati per illustrare le differenze nella carica batterica intestinale.
HT115(DE3) E. coli che trasporta il vettore pos-1 RNAi proviene dalla libreria Ahringer21. La collezione MYb di batteri intestinali nativi C. elegans 22 è stata ottenuta dal laborator....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Sterilizzazione con candeggina di vermi vivi
I vermi sbiancati in superficie sono effettivamente privi di batteri esterni fino a quando la motilità ritorna e l'escrezione riprende. Nelle condizioni qui utilizzate, si osserva una rapida estinzione dei batteri nel tampone (Figura 1A-C, Figura supplementare 2, Video 1) senza disturbare i batteri associati all'intestino nei vermi paralizzati dal freddo (Figura 1D-F
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Qui vengono presentati i dati sui vantaggi della quantificazione a verme singolo della carica batterica in C. elegans, insieme a un protocollo di interruzione a 96 pozzi per consentire l'acquisizione rapida e coerente di grandi set di dati di questo tipo. Rispetto ai metodi esistenti33, questi protocolli consentono una misurazione a più alto rendimento delle comunità microbiche intestinali nel verme.
Questo approccio ha la placcatura come un passaggio limitante.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero ringraziare H. Schulenberg e C. LaRock per la loro generosa condivisione di ceppi batterici utilizzati in questi esperimenti. Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti della Emory University e NSF (PHY2014173).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre in polipropilene a fondo piatto a 96 pozzetti, 300 uL | Evergreen Labware | 290-8350-03F | |
| Tappetino sigillante per piastre a 96 pozzetti, silicone, pozzetti quadrati (AxyMat) | Piastre Axygen | AM-2ML-SQ | |
| a 96 pozzetti, 2 mL, pozzetti quadrati | Axygen | P-2ML-SQ-C-S Coperchi per | |
| piastre in polipropilene a 96 pozzetti | Evergreen Labware | 290-8020-03L | |
| Agar | Fisher Scientific | 443570050 | |
| Set di adattatori per piastre a 96 pozzetti | QIAGEN | 119900 | Piastre adattatrici da utilizzare con due piastre a 96 pozzetti sul TissueLyser II |
| Omogeneizzatore tissutale per mulino a perline TissueLyser II (TissueLyser II) | QIAGEN | 85300 | Omogeneizzatore meccanico per la disgregazione di campioni a media e alta produttività |
| BioSorter | Union Biometrica | Da preventivo | Selezionatore di oggetti di grandi dimensioni dotato di un fuoco di 250 micron per C. elegans |
| Bleach, commerciale, ipoclorito di sodio all'8,25% | Clorox | ||
| Breathe-Easy Membrana sigillante permeabile ai gas a 96 pozzetti | Diversified Biotech | BEM-1 | . Il sottile film sigillante è permeabile a O2, CO2 e vapori d'acqua ed è trasparente ai raggi UV fino a 300 nm. Sterile, 100/scatola. |
| Cloruro di calcio diidrato | Fisher Scientific | AC423525000 | |
| Colesterolo | VWR | AAA11470-30 | |
| Acido citrico monoidrato | Fisher Scientific | AC124910010 | |
| Solfato di rame (II) pentaidrato | Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuga | Corning | COR-6765 | |
| EDTA disodico | Fisher Scientific | 409971000 | |
| DL 1,4 Ditiotreitolo, 99+%, per biologia mol, senza DNAsi, RNAsi e proteasi, ACROS Organics | Fisher Scientific 327190010 | ||
| Eppendorf 1,5 mL provette per microcentrifuga, naturale | Eppendorf | ||
| Eppendorf 5424R microcentrifuga | Eppendorf | 5406000640 | Microcentrifuga da banco refrigerata da 24 posti Centrifuga |
| Eppendorf 5810R con rotore S-4-104 | Centrifuga da banco Eppendorf | 22627040 | 3L con adattatori per provette e piastre da 15-50 mL |
| Secchio per piastre Eppendorf (x2), per rotore S-4-104 | Eppendorf | 22638930 | |
| Etanolo 100% | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Perle di vetro, 2,7 mm | Life Science Products | LS-79127 | |
| Perle di vetro, lavate con acido, 425-600 &; m | Sigma | G877-500G | |
| Perline di vetro | VWR | 76005-124 | |
| Acido cloridrico | VWR | BDH7204-1 | |
| Solfato di ferro (II), eptaidrato | Fisher Scientific, | 423731000 | |
| Kimble, Kontes, motore per pestello, DWK | Life Sciences | 749540-0000 | |
| Kimble Kontes, pellet di polipropilene e microprovette, 0,5 mL | DWK Life Sciences | 749520-0590 | |
| Microscopio invertito motorizzato Leica DMi8 con tavolino motorizzato | Leica | 11889113 | |
| Software Leica LAS X Premium | Leica | 11640687 | |
| Solfato di magnesio eptaidrato | Fisher Scientific | AC124900010 | |
| Cloruro di manganese(II) tetraidrato | VWR | 470301-706 | |
| PARAFILM M pellicola sigillante flessibile da laboratorio | Amcor | PM996 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Piastre di Petri, rotonde, 10 cm | VWR | 25384-094 | |
| Piastre di Petri, rotonde, 6 cm | VWR | 25384-092 | |
| Piastre di Petri, quadrate, 10 x 10 cm | VWR | 10799-140 | |
| Fosfo-tamponate soluzione salina (1X PBS) | Gold Bio | P-271-200 | |
| Vassoio per autoclave in polipropilene, poco profondo | Fisher Scientific | 13-361-10 | |
| Idrossido di potassio | Fisher Scientific | AC134062500 | |
| Fosfato di potassio bibasico | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Fosfato di potassio monobasico | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 | R Foundation | n/a | |
| Spatola da laboratorio a paletta, metallo | VWR | 470149-438 | |
| Carburo di silicio grana 36 | MJR Tumbler | n/a | Grana di carburo di silicio extra grossolana nera. Disponibile nelle misure da 0,5-5 libbre da questo fornitore. |
| Sodio dodecil solfato | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Idrossido di sodio | VWR | BDH7247-1 | |
| Sodio fosfato bibasico anidro | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Cloruro di sodio | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Saccarosio | Fisher Scientific | AC419760010 | |
| Tri-potassio citrato monoidrato | Fisher Scientific | AC611755000 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Solfato di zinco eptaidrato | Fisher Scientific | AC205982500 |
Riferimenti
- Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
- Stephenson, J., et al. Host heter....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
