Articolo metodologico

Un metodo semi-automatico e riproducibile a base biologica per quantificare la deposizione di calcio in vitro

DOI:

10.3791/64029

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2 giugno 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Cardiovascular Research Institute Maastricht (CARIM), Maastricht University, 2Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, Biointerface Group, RWTH Aachen University, 3Institute of Experimental Medicine and Systems Biology, RWTH Aachen University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte in tutto il mondo. La calcificazione vascolare contribuisce in modo sostanziale al carico di morbilità e mortalità cardiovascolare. Questo protocollo descrive un metodo semplice per quantificare la precipitazione di calcio mediata da cellule muscolari lisce vascolari in vitro mediante imaging fluorescente.

Abstract

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La calcificazione vascolare comporta una serie di patologie degenerative, tra cui l'infiammazione, i cambiamenti del fenotipo cellulare, la morte cellulare e l'assenza di inibitori della calcificazione, che portano contemporaneamente a una perdita di elasticità e funzionalità dei vasi. La calcificazione vascolare è un importante contributo alla morbilità e alla mortalità in molte patologie, tra cui la malattia renale cronica, il diabete mellito e l'aterosclerosi. Gli attuali modelli di ricerca per studiare la calcificazione vascolare sono limitati e sono praticabili solo nelle ultime fasi dello sviluppo della calcificazione in vivo. Gli strumenti in vitro per lo studio della calcificazione vascolare utilizzano misurazioni end-point, aumentando le richieste di materiale biologico e rischiando l'introduzione di variabilità negli studi di ricerca. Dimostriamo l'applicazione di una nuova sonda marcata con fluorescenza che si lega allo sviluppo della calcificazione in vitro sulle cellule muscolari lisce vascolari umane e determina lo sviluppo in tempo reale della calcificazione in vitro . In questo protocollo, descriviamo l'applicazione del nostro test di calcificazione di nuova concezione, un nuovo strumento nella modellazione delle malattie che ha potenziali applicazioni traslazionali. Prevediamo che questo test sia rilevante in uno spettro più ampio di ricerca sulla deposizione minerale, comprese le applicazioni nelle ossa, nella cartilagine o nella ricerca dentale.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La calcificazione vascolare (VC) è un fattore di rischio indipendente per la morbilità e mortalità cardiovascolare 1,2,3. A lungo considerato un processo chimico passivo di deposizione di minerali ectopici, ora appare una risposta di guarigione tissutale modificabile che coinvolge il contributo attivo di varie cellule tra cui le cellule muscolari lisce vascolari attivate (hVSMC) come driver della malattia 4,5. In vivo La VC può essere misurata mediante TAC multislice come valutazione del carico aterosclerotico 6,7,8. Attualmente, è in corso un cambiamento di paradigma, in cui la gravità VC viene riconosciuta come un fattore di rischio nelle malattie cardiovascolari, nel diabete di tipo II, nella malattia renale cronica e nell'invecchiamento 9,10,11,12,13,14,15.

Le hVSMC sono il tipo di cellula più abbondante nel sistema cardiovascolare e un attore principale nello sviluppo della VC. La calcificazione indotta da hVSMC in vitro è un modello di malattia ampiamente utilizzato per studiare le malattie cardiovascolari16,17. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli per il rilevamento della calcificazione in vitro utilizza misurazioni end-point che possono limitare l'acquisizione dei dati, richiedere un maggiore uso di materiale cellulare e possono rallentare la ricerca. I metodi comuni per il rilevamento della calcificazione in vitro di hVSMC includono il saggio o-cresolphthalein, che misura la deposizione di calcio solubilizzato rispetto alle proteine totali e richiede la lisi cellulare18. Inoltre, viene utilizzata la colorazione Alizarin Red, che si lega direttamente ai depositi di calcio su cellule fisse o tessuto19. Per studiare la calcificazione di hVSMC nel tempo con o-cresolphthalein o Alizarin Red richiede lotti di repliche per punto temporale, aumentando la domanda di materiale biologico e, a sua volta, aumentando la possibilità di variabilità.

In questo articolo, descriviamo in dettaglio il metodo per l'applicazione di un nuovo test che utilizza hVSMC con una sonda di imaging fluorescente per determinare la progressione VC in vitro e funzionare come un singolo test di calcificazione allo stadio terminale. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo test è direttamente paragonabile ai metodi o-cresolphthalein e Alizarin Red e può essere utilizzato per distinguere tra diverse condizioni di coltura20. Oltre alle misurazioni in tempo reale, questo test può essere utilizzato per determinare la propensione dei campioni di siero o plasma come marcatore surrogato per lo sviluppo clinico di VC20. Ciò aiuterà nell'applicazione di strategie biologiche delle scienze cardiovascolari e nella modellizzazione delle malattie. Un'ulteriore applicazione del test può essere come sistema bioibrido traslazionale per valutare la gravità o la progressione della VC da costituenti del sangue come siero o plasma.

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Protocollo

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1. Induzione di semina, mantenimento e calcificazione cellulare

  1. Per la coltura delle cellule primarie, utilizzare un armadio per il flusso d'aria laminare, guanti e attrezzature sterili. Disinfettare le mani e lo spazio di lavoro prima e dopo aver eseguito qualsiasi lavoro. Trattare tutte le cellule primarie e i terreni di coltura come un potenziale rischio biologico, salvo prova contraria. Preferibilmente celle e terreni in eccedenza in autoclave prima dello smaltimento. Non inattivare chimicamente e autoclavare poiché questo libererà fumi tossici.
  2. Coltura hVSMC su piastre di coltura cellulare non rivestite.
  3. Mantenere regolarmente hVSMC in terreno di crescita costituito da terreno M199 integrato con 10% -20% FBS e 1% Pen / Strep e incubare a 37 ° C e 5% CO2.
  4. Dividere le celle in base alla confluenza del 70% -90%.
    1. Per dividere, lavare gli hVSMC 2x con PBS. Aggiungere tripsina e incubare per 2-5 minuti a 37 °C. Verificare il distacco delle cellule al microscopio.
    2. Inibire la reazione della tripsina aggiungendo mezzo contenente siero. Centrifugare le celle a 350 x g per 4 minuti e risospendere il pellet nel mezzo di mantenimento. Gli hVSMC seguono uno schema di suddivisione 1:2.
  5. Per iniziare l'esperimento di calcificazione, preparare le celle seguendo le istruzioni per una divisione (Passo 1.4.1). Al momento della risospensione, contare le cellule e il seme in una piastra a 48 pozzetti ad una densità di 10-15 x 103 cellule/cm2. Seminare le cellule evitando l'uso dei pozzetti esterni, come raccomandato nella Figura supplementare 1.
  6. Lasciare che le cellule aderiscano e recuperino per 24 ore (durante la notte) durante l'incubazione a 37 °C e al 5% di CO2.
  7. Lavare delicatamente le celle 2x con PBS, aspirando accuratamente tutto il PBS rimanente dopo il 2° lavaggio.
  8. Aggiungere delicatamente il mezzo di calcificazione e incubare ulteriormente a 37 °C e al 5% di CO2. Il mezzo di calcificazione deve contenere uno stimolo di calcificazione, fetuina-A marcata con fluorescenza (ad esempio, con proteina fluorescente rossa [RFP]) (1 μg/ml) e colorazione nucleare HOECHST 33342 (0,1 μg/mL) o colorazione nucleare fluorescente viva simile. Non utilizzare DAPI, poiché non è permeabile.
  9. Controllare quotidianamente con un microscopio ottico fino a quando non si verifica la calcificazione.
    NOTA: per le note sulla coltura cellulare e sul mantenimento degli hVMSC, vedere il file supplementare 1.

2. Rilevamento della calcificazione tramite imaging

NOTA: il seguente protocollo fornisce i passaggi generali da eseguire nella preparazione, nell'imaging e nell'analisi dei dati. Le schermate che supportano le istruzioni per ogni passaggio utilizzando una piattaforma di imaging automatizzata e il corrispondente software di analisi delle immagini (vedere la tabella dei materiali per i dettagli) sono fornite nel file supplementare 2 e nel file supplementare 3. Altri strumenti di imaging e strumenti di elaborazione delle immagini possono essere utilizzati per applicare questo protocollo. Tuttavia, l'imaging ripetuto nella stessa posizione in ciascun pozzetto è fondamentale per l'acquisizione significativa dei dati. La creazione di un protocollo per la calcificazione e il riutilizzo delle immagini in ogni fase dell'imaging è necessaria per ottenere risultati riproducibili. La prima volta che si applica il metodo, seguire i passaggi seguenti per prepararsi prima dell'imaging.

  1. Impostazione del protocollo
    1. Aprire il software, quindi selezionare Protocolli e Crea nuovo.
    2. Selezionare Procedura e fare clic su Imposta temperatura. Nella finestra popup, impostare la temperatura su 37 °C e la sfumatura su 1 °C, quindi fare clic su OK. Selezionare il tipo di piastra scelto dal menu a discesa. Aggiungere il passaggio dell'immagine facendo clic su Immagine. Selezionare il imager invertito e fare clic su OK.
    3. Aggiungere tre canali di imaging e impostarli su DAPI (377, 447 nm), RFP (531, 593 nm) e campo chiaro. Spuntare la casella Montaggio e impostare il numero desiderato e la posizione delle immagini. 2 x 2 per una piastra da 48 pozzetti è una scelta comune. Modificare la sovrapposizione per rappresentare una migliore copertura di ciascun pozzo. Selezionare i pozzi da fotografare. Si aprirà una nuova finestra dove è possibile selezionare i pozzi di interesse.
    4. Fare clic su Opzioni di messa a fuoco per impostare la modalità di messa a fuoco . Si aprirà una nuova finestra. Imposta ogni canale singolarmente. Comunemente, i pozzi sono focalizzati automaticamente sul canale "DAPI". Impostate tutti gli altri canali su Altezza focale fissa dal primo canale e impostate facendo clic su OK. Chiudere la finestra.
    5. Avviare i passaggi di riduzione dei dati di preimpostazione facendo clic su Riduzione dati e selezionare Pre-elaborazione immagini. L'impostazione di questo passaggio riduce lo sfondo di fluorescenza. Accettare le impostazioni predefinite selezionando OK. Verrà creato un nuovo set di immagini con il prefisso "TSF". Le immagini originali saranno conservate.
    6. Impostare un passaggio per contare le celle selezionando Analisi cellulare. Selezionare le immagini DAPI TSF dal menu a discesa Canale . Impostare ulteriori dettagli dopo l'esecuzione dell'imaging. Questo passaggio può anche essere considerato riduzione dei dati; Assicurati sempre di conservare le immagini originali.
    7. Preparare l'analisi del segnale RFP (calcificazione) selezionando Statistiche. Nella finestra pop-up, etichetta Step e seleziona TSF RFP come canale di input. Selezionare le caselle Valore superiore e Valore inferiore. Spuntare la casella per Area totale nell'elenco inferiore. Selezionate Nessuno nella colonna Effetto colore. Nella finestra pop-up, fai clic su Personalizzato e seleziona la casella Sfondo. Questo colorerà i risultati da basso-alto per una facile valutazione. Premere OK.
    8. Per una lettura corretta, normalizzare il segnale RFP per cella. In tal modo, un'area totale viene divisa per cella. Per impostare questo passaggio, premere Rapporto sul lato sinistro. Nella finestra pop-up, selezionare per l'immissione dei dati 1 Quantificazione RFP: Area totale dal menu a discesa. Selezionare ulteriormente Conteggio celle come input dati 2.
    9. Infine, selezionare un nuovo nome set di dati e premere nuovamente OK e OK . Selezionare Effetto colore come descritto in precedenza. Nell'angolo superiore sinistro, selezionate File e salvate il file come protocollo (tipo di file .prt).
  2. Ogni giorno dopo la prima calcificazione
    1. Per ogni punto temporale, ripetere questi passaggi. Nel software di avvio, premere Leggi ora e Protocollo esistente.... Selezionare il protocollo creato nel passaggio precedente. Il programma chiederà di salvare l'esperimento. Questo può essere fatto in questo passaggio, ma anche in qualsiasi passaggio successivo manualmente facendo clic sul pulsante Salva in alto a sinistra.
    2. Una finestra pop-up chiederà di attendere che il sistema si riscaldi. Accendere il regolatore di gas CO2 e impostarlo al 5%.
    3. Una volta che il sistema ha raggiunto la temperatura impostata, apparirà un prompt per inserire una piastra e leggere. Premere Annulla. Questo perché, per ogni punto temporale, l'esposizione di ciascun fluorocromo deve essere regolata individualmente.
    4. Trasportare la piastra dall'incubatore all'imager in una cassetta di sicurezza che resista alla rottura e alla fuoriuscita ed è in linea con le normative locali sulla biosicurezza per il trasporto di cellule vive, in caso di incidente. Inserire la piastra nel lettore di piastre.
    5. Dopo l'annullamento, fare clic su Procedura. Nella finestra pop-up, selezionare Pre-Set Imaging Step (Passaggio acquisizione immagini preimpostato). Regolare prima la messa a fuoco e l'esposizione sul canale DAPI . Deseleziona la casella Esposizione automatica su tutti i canali. Quindi, fare clic sull'icona Microscopio accanto al canale DAPI . Si aprirà una nuova finestra.
    6. Selezionare il pozzo su cui concentrarsi. Utilizzare un pozzo con calcificazione medio-alta per questo passaggio. Se un segnale è già visibile, fare clic prima su Autofocus e poi su Autoesposizione. In caso contrario, aumentare prima l'esposizione e ripetere Autofocus e Autoesposizione. Se lo si desidera, l'esposizione può essere regolata manualmente selezionando il menu a discesa dell'esposizione. Controlla le impostazioni su più pozzi. Una volta soddisfatto, salva le impostazioni.
    7. Regolare l'esposizione nello stesso modo per tutti i canali.
      ATTENZIONE: Non concentrarsi su altri canali; Regola solo l'esposizione. La messa a fuoco dovrebbe essere la stessa per tutti i canali.
    8. Chiudere la finestra della procedura. Seleziona il pulsante verde Leggi ora nella barra delle applicazioni superiore. Salvare l'esperimento come indicato dal software.
      NOTA: Il software ora leggerà automaticamente tutti i pozzi selezionati nelle impostazioni selezionate.

3. Analisi dei dati

NOTA: per screenshot dettagliati su come eseguire l'analisi dei dati utilizzando una piattaforma di imaging automatizzata e il software di analisi delle immagini corrispondente (vedere la tabella dei materiali per i dettagli), vedere il file supplementare 4. Se si utilizzano strumenti di imaging alternativi o software di analisi, le immagini devono essere esportate ed elaborate in batch garantendo che l'esposizione, la soglia di fluorescenza o l'intensità siano regolate allo stesso modo per tutte le immagini in un set di dati comparativi.

  1. Mentre il sistema legge la lastra, tutte le immagini vengono elaborate automaticamente in background. Regolare le impostazioni per il conteggio delle celle selezionando le immagini DAPI TSF da visualizzare. Selezionare il pozzo di scelta facendo doppio clic. Apparirà una nuova finestra. Seleziona una delle immagini.
  2. Selezionare la scheda Analisi . Nella finestra pop-up, seleziona Analisi cellulare: conteggio delle cellule. Fare clic su OK. Deselezionate i canali RFP e brightfield. Selezionare la casella Evidenzia oggetti .
  3. Fare clic su Opzioni per aprire il menu. Regolare la dimensione e la soglia di intensità per includere tutti i nuclei ma escludere i detriti. Fare clic su OK. Fai clic su Applica modifiche in basso a sinistra per trasferire le impostazioni anche a tutte le altre immagini.
  4. In modo simile a prima, selezionare un pozzo e un'immagine con una quantità medio-alta di calcificazione per regolare al meglio il rapporto segnale-rumore; fare clic sulla scheda Analisi nel menu attività.
    1. Questa volta seleziona Statistiche immagine. Deselezionate il canale DAPI e brightfield. Fare clic su Opzioni per aprire il menu. Spuntare la casella Soglia valori anomali. Regolare i valori superiore e inferiore della soglia. Contare il segnale solo se è sopra lo sfondo ed escludere se ci sono detriti / artefatti.
    2. Per impostare un valore di soglia non soggettivo per il segnale sopra lo sfondo, selezionate lo strumento linea dalla barra delle applicazioni. Apparirà una finestra. Disegna una linea attraverso una macchia di segnale, ma assicurati di includere anche un'area di sfondo.
      NOTA: nella finestra pop-up verrà visualizzato un grafico che mostra un picco che rappresenta il segnale sopra la linea di sfondo. Il valore dell'altezza di picco del 25% rappresenta la soglia consigliata. Si consiglia inoltre di misurare più patch di segnale per garantire la selezione della giusta soglia. Durante la selezione di patch di segnale, la selezione di regioni con potenza del segnale molto elevata può comportare una soglia che trascura i segnali medi e/o inferiori. Si consiglia pertanto di selezionare patch di segnale medio-basso sopra lo sfondo. Esempi di soglie troppo alte, troppo basse e accurate sono mostrati nel file supplementare 4.
    3. Una volta soddisfatti, fare clic su OK e su Applica modifiche per trasferire le impostazioni a tutti gli altri pozzi. Controllare se la soglia è accuratamente selezionata negli altri pozzi.
  5. Una volta impostate le soglie di conteggio delle celle e RFP, esportare i dati. Seleziona la piastra di interesse. Nel menu a discesa, è possibile selezionare più parametri per l'esportazione. Di rilevanza potrebbe essere il conteggio delle celle, l'area RFP e "area / cella" che è la metrica utilizzata per il confronto tra gruppi. Fai clic sul pulsante Excel accanto al menu a discesa per esportare i dati direttamente in un foglio di calcolo.
    NOTA: Nel menu a discesa, i valori calcolati per il conteggio delle celle, l'area totale del segnale RFP (che riflette l'area di calcificazione) e il rapporto normalizzato dell'area totale del segnale RFP per cella possono ora essere selezionati singolarmente ed esportati in un foglio di calcolo. Visualizza i risultati come il rapporto tra l'area totale del segnale RFP per cella e visualizza (ad esempio, grafici a barre). Applica un test t di Student non accoppiato per confrontare due gruppi o un ANOVA non accoppiato per confrontare diversi gruppi nello stesso punto temporale. Il confronto dello stesso gruppo in diversi punti temporali può richiedere un'analisi statistica accoppiata.

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Risultati

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Il risultato include immagini originali di nuclei colorati con HOECHST, calcificazione marcata RFP e immagini in campo chiaro. Possono essere rilevate e analizzate diverse fasi della calcificazione che vanno da basse (Figura 2) ad alte (Figura 3). La calcificazione di solito può essere individuata come macchie nere usando la microscopia ottica (Figura 2D e Figura 3B, le frecce indicano la calcificazione...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo manoscritto, descriviamo un metodo semi-automatico per la determinazione della calcificazione in vitro . Per questo metodo, è necessario ottimizzare tre fasi critiche della calcificazione di hVSMC. In primo luogo, la densità cellulare è fondamentale per lo sviluppo della calcificazione di hVSMC. Basse densità di hVSMC si tradurranno in una calcificazione lenta o assente e nella morte cellulare a causa della mancanza di contatto cellula-cellula e dello stress indotto in condizioni calcificanti

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Dichiarazioni

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Leon Schurgers ha ricevuto sovvenzioni istituzionali da Bayer, Boehringer Ingelheim, NattoPharma e IDS. Leon Schurgers possiede azioni di Coagulation Profile. Willi Jahnen-Dechent è co-fondatore e azionista di CALCISCON AG.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata finanziata dai programmi di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Sklodowska-Curie n. 722609 e 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Questa ricerca è stata supportata da BioSPX. WJ-D ha ricevuto finanziamenti dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) TRR219-ID 322900939 e ID progetto 403041552

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cloruro di calcio, 93%, anidroThermo Fisher Scientific349615000
Costar Piastre a pozzetti trattate con TC trasparente a 6 pozzettiCorning3516
Cytation 3 SystemBioTek, Abcoude, Paesi Bassi
Siero fetale bovinoMerckF7524-100ML
Fetuin-A-Alexa Fluor-546Preparato internamente
Software Gen5 v3.10BioTek
Gibco Medium 199Thermo Fisher Scientific11150059
Hoechst 33342, TricloridratoThermo Fisher ScientificH3570
PBS (10X), pH 7.4Thermo Fisher Scientific70011044
Penicillina-StreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenoloThermo Fisher Scientific25300062

Riferimenti

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