Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento dei BMM dai ratti SD, chiamato metodo di aderenza secondaria.
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Articolo metodologico
Isolamento delle cellule di lignaggio monociti-macrofagi dalle ossa di ratto mediante metodo di aderenza secondaria
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Con una diminuzione della densità minerale ossea, le ossa hanno maggiori probabilità di fratturarsi, influenzando così negativamente la qualità della vita di un paziente. La crescita e lo sviluppo delle ossa sono regolati principalmente da osteoblasti e osteoclasti. È stato ampiamente accettato che gli osteoclasti sono derivati da cellule monociti-macrofagi del midollo osseo (BMM). BMM e altre cellule staminali ematopoietiche si trovano nella cavità del midollo osseo. Pertanto, isolare singoli BBM stabili da popolazioni cellulari diverse ed eterogenee è una sfida enorme. Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento dei BMM dai ratti SD, chiamato metodo di aderenza secondaria. Sono state raccolte cellule aderenti coltivate per 24-48 ore in coltura primaria. L'analisi citometrica a flusso ha mostrato che circa il 37,94% delle cellule erano CD11b/c+ (antigene di superficie monocita-macrofago). La colorazione della fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP) e l'analisi western blot hanno dimostrato che i BMM potrebbero differenziarsi in osteoclasti in vitro. I risultati di cui sopra hanno suggerito che le cellule di aderenza secondaria potrebbero essere considerate come un modello cellulare adatto per la ricerca sulla differenziazione degli osteoclasti.
Introduzione
È stato riportato che le cellule di lignaggio monociti-macrofagi esistenti nel midollo osseo possono differenziarsi in monociti del sangue e macrofagi tissutali 1,2. Le cellule di cui sopra, che possono differenziarsi in osteoclasti per bilanciare la crescita e lo sviluppo osseo, sono comunemente usate come modello cellulare per indurre osteoclasti in vivo 3,4. Il midollo osseo è un tessuto speciale contenente diversi tipi di cellule, che includono, ma non sono solo limitate alle cellule staminali mesenchimali del midollo....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti in questo studio sono stati condotti in conformità con le linee guida per gli esperimenti sugli animali del Centro di ricerca sugli animali da laboratorio dell'Università medica cinese di Zhejiang (numero di approvazione: IACUC-20181029-11).
1. Estrazione cellulare
- Metti i ratti Sprague-Dawley (ratti SD, 1-10 giorni, maschio o femmina) nelle gabbie di eutanasia riempite con CO2 ad un tasso equilibrato del 30% -70% volume contenitore / minuto. Dopo che i ratti perdono conoscenza (20-60 min), eutanasizzare il ratto per lussazione cervicale per garantire una morte indolore.
- ....
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Risultati
La popolazione cellulare aderente secondaria era stabile e uniforme. Con la continua proliferazione cellulare, la maggior parte delle cellule è diventata più grande, con forma irregolare ed è cresciuta in un disco aderente radiale (Figura 2C, D). La citometria a flusso ha mostrato che la percentuale di cellule che esprimono CD11b/c, un marcatore molecolare sulla superficie delle cellule di lignaggio monociti-macrofagi, era di circa il 37,94% .......
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Discussione
Gli osteoclasti sono uno dei tipi di cellule più significativi coinvolti nell'insorgenza e nello sviluppo di malattie ossee, nonché uno degli oggetti primari della ricerca sulle malattie ossee20. Monociti / macrofagi possono differenziarsi in osteoclasti. Poiché i macrofagi mononucleati (cellule RAW264.7) sono troppo costosi da acquistare e si attivano facilmente durante la coltura, è difficile eseguire esperimenti di differenziazione in vitro utilizzando questa linea cellulare. Sebbene s.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Natural Science Foundation della provincia di Zhejiang (sovvenzione n. LY19H060001) e il Zhejiang Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan Project (n. 2022ZB093).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| fette rampicanti cellulari da 35 mm2 | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-catepsina K | Abcam | ab19027 | 1:1.000 |
| Controllo isotipo anti-CD11 | Abcam | ab172730 | 1 μ g/test, 1,675 mg/ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μ g/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1.000 |
| Anti-β-actina | Beyotime | AF5003 | 1:1.000 |
| Fette rampicanti cellulari | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Piatto per colture cellulari | corning | 430167 | |
| Pallone per colture cellulari | 430168 | ||
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Capra anti-coniglio IgG | Abcam | ab150077 | per IF, 1:2.000 |
| capra anti-coniglio IgG | Abcam | ab6721 | per WB, 1:2.000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 giorni | |
| Kit di preparazione gel SDS-PAGE | Solarbio | P1200 | |
| Kit di colorazione TRAP/ALP | Wako | 294-67001 | |
| Soluzione di tripsina-EDTA | Biosharp | BL512A | |
| Soluzione di Wright-Giemsa | Keygen Biotech | KGA225-1 |
Riferimenti
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
- Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.....
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Ristampe e permessi
