Questo protocollo delinea in dettaglio la preparazione di complessi nucleosomiali utilizzando due metodi di preparazione del campione per il congelamento delle griglie TEM.
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Articolo metodologico
Preparazione di particelle nucleosomiche complessate con fattori di riparazione del DNA per la determinazione strutturale della microscopia crioelettronica
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La riparazione del DNA nel contesto della cromatina è poco conosciuta. Studi biochimici che utilizzano particelle nucleosomiche del nucleosoma, l'unità ripetitiva fondamentale della cromatina, mostrano che la maggior parte degli enzimi di riparazione del DNA rimuove il danno al DNA a tassi ridotti rispetto al DNA libero. I dettagli molecolari su come gli enzimi di riparazione dell'escissione di base (BER) riconoscono e rimuovono il danno al DNA nei nucleosomi non sono stati chiariti. Tuttavia, i dati biochimici BER dei substrati nucleosomiali suggeriscono che il nucleosoma presenta diverse barriere strutturali a seconda della posizione della lesione del DNA e dell'enzima. Ciò indica che i meccanismi impiegati da questi enzimi per rimuovere il danno al DNA nel DNA libero possono essere diversi da quelli impiegati nei nucleosomi. Dato che la maggior parte del DNA genomico è assemblato in nucleosomi, sono necessarie informazioni strutturali di questi complessi. Ad oggi, la comunità scientifica manca di protocolli dettagliati per eseguire studi strutturali tecnicamente fattibili di questi complessi. Qui, forniamo due metodi per preparare un complesso di due enzimi BER geneticamente fusi (polimerasi β e AP Endonucleasi1) legati a un gap a singolo nucleotide vicino all'entrata-uscita del nucleosoma per la determinazione strutturale della crio-microscopia elettronica (crio-EM). Entrambi i metodi di preparazione del campione sono compatibili per la vetrificazione di griglie di qualità tramite congelamento a tuffo. Questo protocollo può essere utilizzato come punto di partenza per preparare altri complessi nucleosomiali con diversi fattori BER, fattori di trascrizione pionieristici ed enzimi modificanti la cromatina.
Introduzione
Il DNA eucariotico è organizzato e compattato dalle proteine istoniche, formando la cromatina. La particella nucleosomica (NCP) costituisce l'unità ripetitiva fondamentale della cromatina che regola l'accessibilità alle proteine leganti il DNA per la riparazione, la trascrizione e la replicazione del DNA1. Sebbene la prima struttura cristallina a raggi X del PCN sia stata risolta per la prima volta più di due decenni fa2 e molte altre strutture del PCN siano state pubblicate da 3,4,5,6, i mecca....
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Protocollo
1. Assemblare le particelle del nucleo del nucleosoma tramite dialisi salina
NOTA: La preparazione di particelle nucleosomiche utilizzando proteine istoniche ricombinanti per studi strutturali è stata ampiamente descritta in dettaglio da altri14,15,16. Seguire la purificazione degli istoni ricombinanti di X. laevis e dell'assemblaggio di ottameri istonici descritti da altri14,15 e assemblare il substrato nucleosomico come descritto di seguito.
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Risultati
NCP correttamente assemblati (Figura 2) sono stati utilizzati per creare un complesso con una proteina di fusione ricombinante di MBP-Polβ-APE1 (Figura 3). Per determinare il rapporto tra NCP e MBP-Polβ-APE1 per formare un complesso stabile, abbiamo eseguito saggi di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) (Figura 4), che hanno mostrato una banda spostata singolarmente del NCP con un eccesso molare di 5 volte di MBP-Polβ-A.......
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Discussione
Un protocollo specifico per purificare il fattore di riparazione del DNA dipenderà dall'enzima di interesse. Tuttavia, ci sono alcune raccomandazioni generali, tra cui l'uso di metodi ricombinanti per l'espressione e la purificazione delle proteine18; se la proteina di interesse è troppo piccola (<50 kDa), la determinazione della struttura da parte della crio-EM era stata quasi impossibile fino a tempi più recenti attraverso l'uso di sistemi di fusione19, scaffold leganti i.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Mario Borgnia del nucleo crio-EM presso il National Institute of Environmental Health Sciences e il Dr. Joshua Strauss dell'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill per il loro tutoraggio e formazione nella preparazione della griglia crio-EM. Ringraziamo anche la Dott.ssa Juliana Mello Da Fonseca Rezende per l'assistenza tecnica nelle fasi iniziali di questo progetto. Apprezziamo il contributo chiave e il supporto del defunto Dr. Samuel H. Wilson e dei suoi membri del laboratorio, in particolare il Dr. Rajendra Prasad e il Dr. Joonas Jamsen per la purificazione del complesso APE1-Polβ geneticamente fuso. La ricerca è stata sostenuta dal prog....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 M HEPES; pH 7,5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific AM9530G | ||
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldeide | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 Filtro | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 (cutoff MW 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 (cutoff MW 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid | Ted Pella | 47000-600 | |
| Congelatore automatico ad immersione | Leica | EM GP | |
| Termociclatore tattile C-1000 | Bio-rad | 1851148 | |
| clip e anelli a C | Thermo Fisher | 6640--6640 | |
| Stazione di clipping | SubAngostrom | SCT08 | |
| Membrana per dialisi (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Pinzette diamantate | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | integrato tecnologie | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| Sistema di purificazione FPLC | di 29018224 | puro AKTA | |
| Modello 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Pacchetto di accessori per lo stoccaggio a rete | SubAngostrom | GSAX | |
| Etano liquido | N/A | N/A | |
| Azoto liquido | N/A | N/A | |
| Pompa peristaltica a due teste Minipuls 3 | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | ||
| Novex 16%, Tricine, 1,0 mm, Mini gel proteici | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Puntali per pipette (VWR) Bassa ritenzione | VWR | 76322-528 | |
| Soluzione di gel di poliacrilammide (37,5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polietilenglicole (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | ||
| Fattore di riparazione del DNA ricombinante purificato | N/A | N/A | |
| R 1,2/1,3 Cu 300 mesh Griglie | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Ottamero istonico ricombinante | N/A | N/A | |
| Strumenti di clipping a molla | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 colonna 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Microscopio elettronico a trasmissione | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Pinzette Assemblaggio per FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| Glicerolo ultrapuro | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Carta da filtro (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xilene cianolo | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Colonne di desalinizzazione Zeba Micro Spin, 7K MWCO, 75 &; L | Thermo Fisher Scientifico | 89877 |
Riferimenti
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core pa....
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Ristampe e permessi
