Articolo metodologico

Preparazione di particelle nucleosomiche complessate con fattori di riparazione del DNA per la determinazione strutturale della microscopia crioelettronica

DOI:

10.3791/64061

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17 agosto 2022

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1Genome Integrity and Structural Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo delinea in dettaglio la preparazione di complessi nucleosomiali utilizzando due metodi di preparazione del campione per il congelamento delle griglie TEM.

Abstract

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La riparazione del DNA nel contesto della cromatina è poco conosciuta. Studi biochimici che utilizzano particelle nucleosomiche del nucleosoma, l'unità ripetitiva fondamentale della cromatina, mostrano che la maggior parte degli enzimi di riparazione del DNA rimuove il danno al DNA a tassi ridotti rispetto al DNA libero. I dettagli molecolari su come gli enzimi di riparazione dell'escissione di base (BER) riconoscono e rimuovono il danno al DNA nei nucleosomi non sono stati chiariti. Tuttavia, i dati biochimici BER dei substrati nucleosomiali suggeriscono che il nucleosoma presenta diverse barriere strutturali a seconda della posizione della lesione del DNA e dell'enzima. Ciò indica che i meccanismi impiegati da questi enzimi per rimuovere il danno al DNA nel DNA libero possono essere diversi da quelli impiegati nei nucleosomi. Dato che la maggior parte del DNA genomico è assemblato in nucleosomi, sono necessarie informazioni strutturali di questi complessi. Ad oggi, la comunità scientifica manca di protocolli dettagliati per eseguire studi strutturali tecnicamente fattibili di questi complessi. Qui, forniamo due metodi per preparare un complesso di due enzimi BER geneticamente fusi (polimerasi β e AP Endonucleasi1) legati a un gap a singolo nucleotide vicino all'entrata-uscita del nucleosoma per la determinazione strutturale della crio-microscopia elettronica (crio-EM). Entrambi i metodi di preparazione del campione sono compatibili per la vetrificazione di griglie di qualità tramite congelamento a tuffo. Questo protocollo può essere utilizzato come punto di partenza per preparare altri complessi nucleosomiali con diversi fattori BER, fattori di trascrizione pionieristici ed enzimi modificanti la cromatina.

Introduzione

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Il DNA eucariotico è organizzato e compattato dalle proteine istoniche, formando la cromatina. La particella nucleosomica (NCP) costituisce l'unità ripetitiva fondamentale della cromatina che regola l'accessibilità alle proteine leganti il DNA per la riparazione, la trascrizione e la replicazione del DNA1. Sebbene la prima struttura cristallina a raggi X del PCN sia stata risolta per la prima volta più di due decenni fa2 e molte altre strutture del PCN siano state pubblicate da 3,4,5,6, i mecca....

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Protocollo

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1. Assemblare le particelle del nucleo del nucleosoma tramite dialisi salina

NOTA: La preparazione di particelle nucleosomiche utilizzando proteine istoniche ricombinanti per studi strutturali è stata ampiamente descritta in dettaglio da altri14,15,16. Seguire la purificazione degli istoni ricombinanti di X. laevis e dell'assemblaggio di ottameri istonici descritti da altri14,15 e assemblare il substrato nucleosomico come descritto di seguito.

  1. Acquistare ....

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Risultati

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NCP correttamente assemblati (Figura 2) sono stati utilizzati per creare un complesso con una proteina di fusione ricombinante di MBP-Polβ-APE1 (Figura 3). Per determinare il rapporto tra NCP e MBP-Polβ-APE1 per formare un complesso stabile, abbiamo eseguito saggi di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) (Figura 4), che hanno mostrato una banda spostata singolarmente del NCP con un eccesso molare di 5 volte di MBP-Polβ-A.......

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Discussione

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Un protocollo specifico per purificare il fattore di riparazione del DNA dipenderà dall'enzima di interesse. Tuttavia, ci sono alcune raccomandazioni generali, tra cui l'uso di metodi ricombinanti per l'espressione e la purificazione delle proteine18; se la proteina di interesse è troppo piccola (<50 kDa), la determinazione della struttura da parte della crio-EM era stata quasi impossibile fino a tempi più recenti attraverso l'uso di sistemi di fusione19, scaffold leganti i.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il Dr. Mario Borgnia del nucleo crio-EM presso il National Institute of Environmental Health Sciences e il Dr. Joshua Strauss dell'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill per il loro tutoraggio e formazione nella preparazione della griglia crio-EM. Ringraziamo anche la Dott.ssa Juliana Mello Da Fonseca Rezende per l'assistenza tecnica nelle fasi iniziali di questo progetto. Apprezziamo il contributo chiave e il supporto del defunto Dr. Samuel H. Wilson e dei suoi membri del laboratorio, in particolare il Dr. Rajendra Prasad e il Dr. Joonas Jamsen per la purificazione del complesso APE1-Polβ geneticamente fuso. La ricerca è stata sostenuta dal prog....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 M HEPES; pH 7,5Thermo Fisher Scientific15630080
1 M MgCl2Thermo Fisher Scientific AM9530G
10x TBEBio-rad1610733
25% glutaraldeideFisher Scientific50-262-23
3 M KClThermo Fisher Scientific043398.K2
491 FiltroBio-rad1702926
Amicon Ultra 15 (cutoff MW 30 kDa)Millipore SigmaZ717185
Amicon Ultra 4 (cutoff MW 30 kDa)Millipore SigmaUFC8030
AutoGridTed Pella47000-600
Congelatore automatico ad immersioneLeicaEM GP
Termociclatore tattile C-1000Bio-rad1851148
clip e anelli a CThermo Fisher6640--6640
Stazione di clippingSubAngostromSCT08
Membrana per dialisi (MW cufoff 6-8 kDa)Fisher Scientific15370752
Pinzette diamantateTechni-Pro758TW0010
dsDNAintegrato tecnologieN/A
FEI Titan KriosThermo FisherKRIOSG4TEM
Sistema di purificazione FPLCdi 29018224puro AKTA
Modello 2110Bio-rad7318122
Glow Discharge Cleaning SystemTed Pella91000S
Grid BoxesSubAngostromPB-E
Pacchetto di accessori per lo stoccaggio a reteSubAngostromGSAX
Etano liquidoN/AN/A
Azoto liquidoN/AN/A
Pompa peristaltica a due teste Minipuls 3GilsonF155008
Nanodrop Thermo Fisher ScientificND-2000
Novex 16%, Tricine, 1,0 mm, Mini gel proteiciThermo Fisher ScientificEC6695BOX
PipetmanGilsonFA10002M
Puntali per pipette (VWR) Bassa ritenzioneVWR76322-528
Soluzione di gel di poliacrilammide (37,5:1)Bio-rad1610158
polietilenglicole (PEG)Millipore SigmaP4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500Millipore Sigma
Fattore di riparazione del DNA ricombinante purificatoN/AN/A
R 1,2/1,3 Cu 300 mesh GriglieQuantifoilN1-C14nCu30-01
Ottamero istonico ricombinanteN/AN/A
Strumenti di clipping a mollaSubAngostromCSA-01
Superdex 200 colonna 10/300Millipore SigmaGE28-9909-44
Microscopio elettronico a trasmissioneThermo FisherTalos Arctica 200 kV
Pinzette Assemblaggio per FEI Vitrobot Mark IV-ITed Pella47000-500
Glicerolo ultrapuroThermo Fisher Scientific15514011
VitrobotThermo FisherMark IV System
Whatman Carta da filtro (55 mM)Cytiva1005-055
Xilene cianoloThermo Fisher Scientific440700500
Colonne di desalinizzazione Zeba Micro Spin, 7K MWCO, 75 &; LThermo Fisher Scientifico89877
centrifugo Filtro centrifugo Pinzette Collettore di frazioni PURX35050

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core pa....

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