Rilevamento di Candidatus liberibacter asiaticus distribuibile sul campo utilizzando l'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a

Summary

In questo lavoro, è stato sviluppato un metodo di rilevamento rapido, sensibile e portatile per Candidatus Liberibacter asiaticus basato sull'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a.

Abstract

La diagnosi precoce di Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) da parte degli agrumicoltori facilita l'intervento precoce e previene la diffusione della malattia. Qui viene presentato un semplice metodo per la diagnosi rapida e portatile di Huanglongbing (HLB) che combina l'amplificazione della polimerasi ricombinasi e un reporter fluorescente che utilizza l'attività nucleasica del sistema 12a (CRISPR-Cas12a) associato a CRISPR regolarmente intervallato. La sensibilità di questa tecnica è molto più alta della PCR. Inoltre, questo metodo ha mostrato risultati simili alla qPCR quando sono stati utilizzati campioni di foglie. Rispetto ai metodi di rilevamento CLas convenzionali, il metodo di rilevamento qui presentato può essere completato in 90 minuti e funziona in una condizione isotermica che non richiede l'uso di macchine PCR. Inoltre, i risultati possono essere visualizzati attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile sul campo.

Introduction

Huanglongbing (HLB) è una delle malattie degli agrumi più problematiche in tutto il mondo¹. L'HLB è causata dai batteri filocolonizzatori e fastidiosi Candidatus Liberibacter spp., tra cui Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus e Ca. L. americanus ². La specie associata all'HLB più diffusa in Cina e negli Stati Uniti è CLas, che viene trasmessa dalle psillidi asiatiche degli agrumi (Diaphorina citri) o attraverso l'innesto³. Dopo essere stati infettati da CLas, gli alberi di agrumi mostrano un declino della crescita fino alla morte

Protocol

1. Costruzione del CLas-DETECTR

NOTA: La costruzione di CLas-DETECTR è un processo in quattro fasi: preparazione della soluzione, isolamento totale del DNA degli agrumi, amplificazione isotermica del DNA e visualizzazione dei risultati. Lo schema del test CLas-DETECTR è illustrato nella Figura 1A.

1. Preparazione della soluzione
   1. Preparare il tampone A: 20 mM NaOH in PEG 200 al 6%. Per 100 ml, aggiungere 113 mg di NaOH e 6 g di PEG 200 in 80 ml di H₂O in un flacone. Incubare il flacone a bagnomaria a 60 °C fino a quando tutto il PEG 200 è sciolto. Quindi, aggiungere H₂O a un v....

Results

Qui, abbiamo descritto una piattaforma portatile, CLas-DETECTR, che combina i sistemi RPA e CRISPR-Cas12a per diagnosticare HLB sul campo. Lo schema di CLas-DETECTR è illustrato nella Figura 1A.

Quando campioni di foglie provenienti dagli alberi di Newhall infetti da HLB e non infetti da HLB (Figura 1B), per i quali la presenza di CLas è stata confermata dalla PCR (Figura 1C), sono stati sottoposti al test CLas-DETECTR, è stato osservato un segnale di fluorescenza.......

Discussion

Questo studio presenta un metodo rapido e portatile per rilevare CLas chiamato CLas-DETECTR, che combina i sistemi RPA e CRISPR-Cas12a. Il flusso di lavoro è illustrato nella Figura 1. CLas-DETECTR rileva CLas con specificità e sensibilità (Figura 2 e Figura 3). Inoltre, utilizzando campioni di foglie di Newhall, CLas-DETECTR rileva CLas con la stessa sensibilità della qPCR (Figura 4). .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit di estrazione del gel di DNA AxyPrep	Corning	09319KE1	Cina
Kit di estrazione del DNA genomico batterico	Solarbio	D1600	Cina
EnGen LbCas12a	TOLOBIO	32104-01	Cina
Ex Taq Versione 2.0 più colorante	TaKaRa	RR902A	Cina
Dispositivo di rilevamento fluorescente portatile	LUYOR	3415RG
Cina Perforatrice	Deli	114	Cina
Acetato di magnesio, MgOAc	TwistDx	TABAS03KIT	Regno Unito
NaOH	SCR	10019718	Cina
NEB tampone 3.1	NEB	B7203	USA
Provette per strisce PCR	LABSELECT	PST-0208-FT-C	Cina
PEG 200	Sigma	P3015	USA
PrimeSTAR Max DNA Polymeras	TaKaRa	R045A	Cina
Caricamento rapido Viola 1 kb Plus DNA Ladder	New England Biolabs	N0550S	USA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	TaKaRa	RR820B	China
TwistAmp Basic	TwistDx	TABAS03KIT	Regno Unito