Protocollo di salvataggio degli embrioni per l'ibridazione interspecifica nello squash

Cucurbita (2n = 40) è un genere molto diversificato della famiglia delle Cucurbitaceae che contiene 27 specie diverse, di cui cinque sono addomesticate¹. Tra questi, Cucurbita moschata, C. pepo e C. maxima sono i più importanti economicamente al mondo. Negli Stati Uniti, C. moschata e C. pepo sono le due specie più importanti nella produzione agricola. C. pepo è costituito da quattro sottospecie (ovifera, pepo, fraternal e gumala) che contengono gruppi di cultivar di zucca sia estivi che invernali di crookneck, straightneck, ghianda, capesante, cocozelle, midollo vegetale, zucchine e zucca^2,3,4,5. C. moschata consiste principalmente di tipi di mercato di zucca invernale tra cui butternut, Dickinson e formaggio del gruppo¹. Le due specie sono morfologicamente e fenotipicamente diverse, con C. pepo considerato per la sua resa, precocità, abitudine di crescita del cespuglio e diversi tratti dei frutti tra cui la forma del frutto, la dimensione del frutto, il colore della polpa e il modello di buccia. D'altra parte, C. moschata è apprezzato per il suo adattamento al calore e all'umidità, nonché per la resistenza alle malattie e ai parassiti ^6,7. L'ibridazione interspecifica tra C. moschata e C. pepo non è solo un'importante strategia per l'introgressione delle caratteristiche desiderabili tra le due specie, ma consente anche l'ampliamento della base genetica nei programmi di allevamento ^7,8.

I primi incroci tra C. moschata e C. pepo sono stati fatti per determinare la loro compatibilità e / o barriere tassonomiche 9,10,11, mentre studi successivi si sono concentrati principalmente sul trasferimento di tratti desiderabili^12,13,14. L'ibridazione interspecifica tra le due specie ha mirato al trasferimento di nuovi tratti come l'abitudine di crescita di un cespuglio o semi-cespuglio e una migliore resa da C. pepo insieme alla resistenza alle malattie, all'adattabilità allo stress abiotico e all'aumento del vigore da C. moschata^14,15,16. Ad esempio, incroci specifici tra C. pepo (P₅) e C. moschata (MO₃) hanno portato a una maggiore resa di frutta 13, mentre le accessioni di C. moschata (nigeriane locali e menina) sono state ampiamente utilizzate come fonte primaria di resistenza ai potyvirus nelle cultivar coltivate di C. pepo ^17,18.

Studi precedenti hanno dimostrato che l'ibridazione tra C. moschata e C. pepo è possibile ma difficile ^8,15. Gli incroci interspecifici potrebbero risultare in nessuna allegagione (aborto), frutti partenocarpici privi di semi vitali (semi vuoti), frutti senza semi in cui gli embrioni immaturi non riescono a svilupparsi (stenospermocarpia), o frutti con pochi embrioni immaturi che possono essere salvati in piante mature attraverso il salvataggio di embrioni^15,16. Ad esempio, nessun seme vitale è stato ottenuto incrociando C. pepo (regina da tavola, materna) con C. moschata (formaggio grande, paterno), tuttavia, l'incrocio reciproco ha prodotto 57 semi vitali da 134 impollinazioni⁹. Hayase ha ottenuto semi vitali da incroci di C. moschata e C. pepo solo quando gli incroci sono stati fatti alle 04:00 del mattino usando polline immagazzinato a 10 ° C durante la notte¹⁹. Baggett ha incrociato otto diverse varietà di C. moschata con C. pepo (delicata) e ha riferito che su 103 impollinazioni totali, sono stati ottenuti 83 frutti che sembravano normali, ma nessuno di essi conteneva semi vitali⁸. In un incrocio tra C. pepo (S179) e C. moschata (NK), Zhang et al. hanno ottenuto 15 frutti con 2.994 semi, ma solo 12 di quei semi erano vitali mentre i restanti mostravano solo uno sviluppo rudimentale. Questi studi suggeriscono che anche se l'incrocio interspecifico tra C. moschata e C. pepo è altamente benefico, ottenere frutti con semi vitali dagli incroci è impegnativo¹⁶.

Il salvataggio degli embrioni è stato suggerito come metodo appropriato per superare i problemi derivanti dall'aborto precoce o da embrioni poco sviluppati ed è una delle prime e più efficaci tecniche di coltura in vitro per la rigenerazione di embrioni immaturi^16,20. Il salvataggio degli embrioni comporta la coltura in vitro di embrioni sottosviluppati/immaturi, seguita dal trasferimento in un mezzo nutritivo sterile per facilitare il recupero delle piantine e, infine, delle piante mature²¹. Sebbene il salvataggio degli embrioni sia comunemente usato nell'allevamento di zucche, manca una descrizione dettagliata della metodologia appropriata che consentirebbe la sua applicazione di routine. L'uso della tecnica di salvataggio degli embrioni per superare le barriere di ibridazione interspecifica nelle specie di Cucurbita è stato segnalato già nel 1954²². Tuttavia, il successo del salvataggio degli embrioni nei primi studi non è stato segnalato o molto basso. Metwally et al. hanno riportato un tasso di successo del 10% (rigenerazione in piante mature) tra 100 embrioni ibridi interspecifici salvati da un incrocio tra C. pepo e C. martinezii²³. Sisko et al. hanno riportato un tasso variabile di successo della rigenerazione embrionale tra embrioni ottenuti da diverse combinazioni incrociate: il tasso di rigenerazione degli ibridi ottenuti incrociando C. maxima (Bos. Max) e C. pepo (Gold Rush) è stato del 15,5%, per C. pepo (Zucchine) e C. moschata (Hokaido) è stato del 20%, mentre per C. pepo (Gold Rush) e C. moschata (Dolga) è stato del 37,5%²⁴. Oltre al genotipo, i terreni e le condizioni di coltura in vitro sono fattori importanti per il successo della tecnica^25,26. Nel presente studio, sono state testate varie combinazioni incrociate tra C. moschata e C. pepo ed è stata sviluppata una semplice metodologia per utilizzare la tecnica di salvataggio degli embrioni nella zucca. Lo sviluppo di una tecnica di salvataggio degli embrioni semplice e facilmente riproducibile faciliterà l'ibridazione interspecifica e il miglioramento del germoplasma nei programmi di allevamento delle zucche.

1. Semina e impollinazione

NOTA: È importante identificare genotipi compatibili la cui ibridazione comporterebbe l'allegagione e la produzione di embrioni vitali.

1. Condizioni di impianto e manutenzione
   1. Ottenere semi di genotipi di zucca (cultivar/accessioni) per l'ibridazione (Tabella 1).
   2. Riempire i piatti di partenza a 50 celle (25 cm larghezza x 50 cm di lunghezza) con terriccio modificato con fertilizzante NPK completo contenente 1,38 g/kg N, 1,38 g/kg P e 1,38 g/kg K.
   3. Semina i semi ad una profondità pari alla loro lunghezza e copri con terriccio. Innaffia gli appartamenti senza creare acqua stagnante. Successivamente, mantenere il supporto umido annaffiandolo a mano una volta al giorno.
   4. Nella seconda fase a foglia vera, trapiantare le piantine in vasi da 25 cm a 30 cm di diametro modificati con un fertilizzante NPK completo a 3 cucchiai / vaso. Fertilizzare le piante una volta alla settimana con 500 ml / vaso di fertilizzante liquido contenente NPK 20:20:20 aggiunto ad una concentrazione di 1 g per gallone d'acqua.
   5. Mantenere le piante in serra a temperature comprese tra 22-28 °C in regime di luce naturale. Per i genotipi di vining, fornire un traliccio di supporto nella serra (Figura 1).
2. Esecuzione dell'impollinazione
   1. Tipicamente, la fioritura in zucca inizia a 6-8 settimane dalla semina a seconda della cultivar (Figura 2A,B). Inizia a fare ibridazioni controllate (croci) non appena le piante iniziano a fiorire. In condizioni di serra, l'impollinazione può essere effettuata tutto l'anno.
   2. Identificare i fiori maschili e femminili delle cultivar di C. pepo e C. moschata che saranno pronti per l'impollinazione il giorno seguente. Per identificare tali fiori, controlla i fiori i cui petali hanno una tonalità gialla ma non sono aperti. Fissare delicatamente i fiori chiusi nella parte superiore usando del nastro adesivo per prevenire l'impollinazione accidentale degli insetti (Figura 2C,D).
   3. La mattina del giorno seguente, i fiori sono pronti per impollinare. Effettuare l'impollinazione prima delle 10:00 per migliorare il tasso di successo dell'ibridazione²⁷.
   4. Aprire i fiori femminili e maschili rimuovendo delicatamente la parte superiore nastrata dei petali. Rimuovere i petali dal fiore maschile e trasferire il polline strofinando delicatamente l'antera sullo stigma del fiore femminile (Figura 3A).
   5. Dopo l'impollinazione, chiudere immediatamente il fiore femminile impollinato con del nastro adesivo. Utilizzare un tag per registrare la data di impollinazione e per indicare i genitori paterni e materni utilizzati nella croce (Figura 3B).
   6. Un incrocio di successo è indicato da un'ovaia espansa che forma rapidamente un piccolo frutto entro 1 settimana (Figura 4A). La pianta è quindi pronta per il raccolto 45-55 giorni dopo l'impollinazione²⁸ (Figura 4B).

2. Tecnica di salvataggio degli embrioni

1. Preparazione dei supporti
   1. Preparare le scorte di antibiotici: per cefotaxime (sale sodico), sciogliere l'antibiotico in 4 ml di acqua deionizzata o distillata, filtrare attraverso un filtro sterile a siringa da 0,22 μm e fare 0,5 mL di aliquote. Conservare a -20 °C. La soluzione madre risultante avrà una concentrazione di 250 mg/ml.
   2. Per l'ampicillina (sale sodico), sciogliere la polvere in 10 ml di acqua, filtrare attraverso un filtro sterile per siringhe da 0,22 μm e aliquote in 1 mL di materiale madre con una concentrazione finale di 100 mg/ml. Conservare a -20 °C.
   3. Produrre terreno Murashige e Skoog (MS) sciogliendo 2,45 g di terreno (concentrazione di 4,91 g / L) in 500 ml di acqua distillata in una bottiglia da 1 L. Aggiungere 1,5 g di gomma gellan e autoclave a 121 °C per 20 min. La gomma di gellano si dissolve completamente durante l'autoclave.
   4. Dopo l'autoclave, raffreddare il fluido ponendo il flacone a bagnomaria a 50 °C. Rimuovere le scorte di antibiotici dal congelatore e scongelarle nell'armadio a flusso laminare.
   5. Trasferire il flacone medio sul cappuccio a flusso laminare. Aggiungere 0,6 mL di soluzione madre di cefotaxime (250 mg/ml) e 0,25 mL di brodo di ampicillina (100 mg/ml) al flacone medio e mescolare bene. Versare circa 7 ml del terreno in una capsula di Petri sterile (60 mm x 15 mm).
   6. Lasciare solidificare il terreno nelle piastre di Petri per circa 15-20 minuti. Chiudere le piastre di Petri con pellicola trasparente e metterle in una scatola di immagazzinaggio. Conservare a temperatura ambiente.
2. Salvataggio degli embrioni
   1. Prima di iniziare, pulire e sterilizzare l'armadio a flusso d'aria laminare con alcool etilico al 70%.
   2. Raccogliere il frutto della zucca rompendolo/tagliandolo dalla vite principale e disinfettare la superficie del frutto lavandolo con detergente liquido (ad esempio, cloroxilenolo allo 0,3%) nel lavandino di laboratorio fino a quando tutto lo sporco sciolto viene rimosso (Figura 5A).
   3. Risciacquare abbondantemente con acqua di rubinetto. Asciugare la frutta con carta assorbente pulita. Spostare il frutto nell'armadio a flusso d'aria laminare (Figura 5B).
   4. Sterilizzare la frutta spruzzando il 70% di etanolo sul frutto nell'armadio sterile a flusso d'aria laminare. Taglia in due il frutto con un coltello sterile (Figura 5C) ed estrai i semi.
   5. Utilizzare una pinza sterile per aprire asetticamente il rivestimento del seme ed esporre gli embrioni immaturi (Figura 6). Posizionare con cautela gli embrioni immaturi in una capsula di Petri contenente terreno di SM integrato con cefotaxime e ampicillina (Figura 7A). Chiudere la piastra di Petri e sigillare con pellicola avvolgente.
      NOTA: A seconda delle dimensioni dell'embrione, è possibile inserire cinque o sei embrioni in una capsula di Petri.
   6. Porre le piastre di Petri sigillate con embrioni in una camera di crescita sotto 16 ore di fotoperiodo a 25 °C e 70% di umidità relativa. In caso di contaminazione, sottocoltivare prontamente gli embrioni non contaminati in una nuova piastra con lo stesso mezzo.
   7. I cotiledoni inizieranno ad espandersi dopo 4 giorni e diventeranno verdi in 10 giorni (Figura 7B). A questo punto, se necessario, eseguire la subcoltura in nuove piastre contenenti lo stesso mezzo per consentire l'espansione tissutale. Le radici inizieranno ad apparire a 14 giorni (Figura 7C), e a 21 giorni le piantine avranno radici estese e cotiledoni (Figura 7D).
      NOTA: Il terreno di coltura utilizzato nel protocollo è appropriato per la differenziazione in germogli e radici senza regolatori di crescita supplementari.
   8. In questa fase, rimuovere le piantine dalle piastre di Petri e lavare delicatamente via il terreno dalle radici con acqua di rubinetto (Figura 8). Posizionare le piantine in un contenitore di plastica (14 cm x 9 cm x 4 cm) e coprire le radici con carta assorbente bagnata (Figura 9A). Coprire il contenitore e rimuovere gli asciugamani di carta se necessario.
   9. Conservare i contenitori a temperatura ambiente (25-28 °C) e con un fotoperiodo di 16 ore. Questo passaggio acclimaterà le piantine. Dopo l'acclimatazione per 7-10 giorni nel contenitore, le piantine saranno lunghe circa 3-4. Durante questo periodo, inumidire gli asciugamani di carta secondo necessità.
   10. Trasferire le piantine in appartamenti di partenza a 50 celle (larghezza 25 cm x lunghezza 50 cm) modificati con fertilizzante come descritto in precedenza e spostarli nella serra (Figura 9B). Non annaffiare eccessivamente le piantine per evitare di marcire; aggiungere circa 10-20 ml per cella secondo necessità.
   11. Nella seconda e terza fase di foglia vera, trapiantare le piantine in vasi di 30 cm di diametro riempiti con terriccio modificato con fertilizzante come descritto in precedenza (Figura 10A). Fornire supporto a traliccio per le piante di vinificazione ed eseguire l'ibridazione controllata quando le piante iniziano a fiorire, come descritto in precedenza (Figura 10B).
   12. Mantenere le piante in serra a temperature comprese tra 22-28 °C in regime di luce naturale. Valuta le piante per le caratteristiche di frutta e semi.

Allegagione e vitalità delle sementi
È stato condotto un test iniziale per determinare l'allegagione e la vitalità dei semi in una varietà di combinazioni incrociate. Sono stati scelti un totale di 15 genotipi di zucca, quattro C. pepo e 11 C. moschata (Tabella 1). Delle 24 combinazioni incrociate interspecifiche tentate, è stata ottenuta un'allegagione per 22 (Tabella 2), che rappresenta un successo complessivo del >92% nell'allegagione. Nessun frutto maturo è stato ottenuto incrociando O e M ed E e J, mentre il maggior numero di frutti (n = 6) è stato ottenuto incrociando F e J (Tabella 2). Il numero di fiori impollinati per diverse combinazioni incrociate variava da uno a 11 e il tasso di successo dell'impollinazione variava dallo 0% al 100%. Il numero di fiori impollinati in diverse combinazioni incrociate variava a seconda del numero di set di fiori e della sincronizzazione della fioritura tra fiori maschili e femminili. Anche se i frutti sono stati ottenuti da tutte le croci tranne due, la valutazione dei frutti dopo averli tagliati ha rivelato che la maggior parte dei frutti aveva abortito embrioni senza semi vitali. I frutti della maggior parte delle croci sembravano normali ma erano privi di semi o consistevano di semi con embrioni rudimentali. Un totale di 44 frutti sono stati prodotti da tutte le combinazioni incrociate, e solo un frutto, sviluppato incrociando C e J, aveva embrioni poco sviluppati che potevano essere recuperati attraverso la tecnica di salvataggio degli embrioni.

Salvataggio degli embrioni e ulteriore avanzamento
L'ibrido interspecifico F1 sviluppato incrociando C e J aveva 44 semi in totale, ma solo 10 di questi avevano embrioni che potevano essere salvati per l'avanzamento generazionale. I semi rimanenti non avevano embrioni. Tutti e 10 gli embrioni sono stati coltivati nei mezzi di salvataggio degli embrioni e controllati quotidianamente per la loro crescita e sviluppo. La dimensione dei 10 embrioni immaturi variava da 3,51 mm a 8,26 mm. Il tasso di successo del salvataggio degli embrioni è stato dell'80%. Gli ibridi interspecifici F 1 (linee ponte) sviluppati incrociando C. moschata e C. pepo (C e J) contenevano i genomi di entrambe le specie con un rapporto 1:1 (50% ciascuno). Queste piante sono state utilizzate come linee di ponte per l'introgressione di tratti economicamente importanti tra le due specie. Ad esempio, l'attraversamento di queste linee di ponte con C. moschata si tradurrebbe in ibridi con il 75% di C. moschata e il 25% di C. pepo background genetico, rispettivamente. I frutti ottenuti da queste linee ponte avevano una miscela di semi non vitali e semi con embrioni immaturi che successivamente richiedevano la coltura tissutale per la rigenerazione. Ad esempio, uno dei frutti aveva un totale di 54 semi, tra cui 14 semi avevano embrioni immaturi che sono stati salvati utilizzando il protocollo qui descritto.

Figura 1: Traliccio di supporto per piante di zucca in crescita verticale nella serra. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Illustrazione di fiori aperti e nastrati. Apri (A) il maschio e (B) il fiore di zucca femminile nella serra. (C) Un fiore maschile registrato da Cucurbita moschata genitore paterno. (D) Un fiore femminile registrato dal genitore materno Cucurbita pepo . Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Illustrazione dell'impollinazione . (A) Trasferire il polline dal fiore maschile strofinando delicatamente l'antera sullo stigma del fiore femminile. (B) Dopo l'impollinazione, nastro adesivo il fiore femminile e utilizzare una targhetta per registrare la data di impollinazione e i genitori paterni e materni utilizzati nella croce. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Allegagione . (A) Dopo l'impollinazione, l'ovaio si espanderà rapidamente, formando un piccolo frutto entro 1 settimana. B) Il frutto è pronto per la raccolta 45 giorni dopo l'impollinazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Preparazione della frutta. (A) Lavare la frutta con detersivo. Raccogliere e disinfettare la superficie del frutto lavandolo con detersivo liquido nel lavandino del laboratorio. (B) Risciacquare e asciugare il frutto. Asciugare la frutta con carta assorbente pulita, dopo il risciacquo con abbondante acqua di rubinetto, e spostarla nell'armadio a flusso d'aria laminare. (C) Tagliare in due il frutto aperto con un coltello sterile. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Estrarre l'embrione dai semi. Utilizzare una pinza sterile per aprire asetticamente il rivestimento del seme ed esporre l'embrione immaturo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Rigenerazione embrionale nei mezzi SM. (A) Posizionare con cura gli embrioni immaturi in una capsula di Petri contenente terreno per la SM. (B) I cotiledoni si espanderanno e diventeranno verdi entro 10 giorni. (C) Le radici inizieranno ad apparire a 14 giorni. (D) A 21 giorni, le piantine avranno radici estese e cotiledoni che sono pronti per essere trasferiti in un contenitore di plastica per l'acclimatazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 8: Lavare le radici. Rimuovere le piantine dalle piastre di Petri e lavare delicatamente il terreno dalle radici con acqua di rubinetto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 9: Acclimatare le piantine . (A) Mettere le piantine in un contenitore di plastica e coprire le radici con un tovagliolo di carta bagnato per 5 giorni per acclimatarle. (B) Trasferire le piantine in vassoi contenenti terriccio commerciale modificato con fertilizzante NPK completo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 10: Trapiantare le piantine in vasi. (A) Nella fase dalla seconda alla terza foglia vera, trapiantare le piantine in vasi di 30 cm di diametro riempiti con terriccio modificato con fertilizzante. (B) Fornire supporto a traliccio per le piante di vinificazione e fare ibridazione controllata quando le piante iniziano a fiorire. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Un totale di 15 genotipi di zucca, quattro C. pepo e 11 C. moschata, sono stati utilizzati nello studio per incroci interspecifici.

Tabella 2: Combinazioni incrociate tentate con i 15 genotipi di zucca e la corrispondente allegagione, il numero di semi abortiti, embrioni immaturi e salvataggi di embrioni riusciti.

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.