Il presente protocollo descrive i metodi per l'espressione transgenica nei cuori di ratto e topo mediante iniezione intramiocardica diretta del virus sotto guida ecocardiografica. Qui vengono spiegati anche i metodi per la valutazione della suscettibilità dei cuori alle aritmie ventricolari mediante la stimolazione elettrica programmata di cuori isolati perfusi da Langendorff.
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Articolo metodologico
Espressione del transgene virale nei cuori dei roditori e valutazione del rischio di aritmia cardiaca
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le malattie cardiache sono la principale causa di morbilità e mortalità in tutto il mondo. A causa della facilità di manipolazione e dell'abbondanza di ceppi transgenici, i roditori sono diventati modelli essenziali per la ricerca cardiovascolare. Tuttavia, le aritmie cardiache letali spontanee che spesso causano mortalità nei pazienti con malattie cardiache sono rare nei modelli di roditori di malattie cardiache. Ciò è dovuto principalmente alle differenze di specie nelle proprietà elettriche cardiache tra uomo e roditori e rappresenta una sfida per lo studio delle aritmie cardiache utilizzando i roditori. Questo protocollo descrive un approccio per consentire un'espressione transgenica efficiente nel miocardio ventricolare di topo e ratto utilizzando iniezioni intramuscolari guidate da ecocardiografia di virus ricombinante (adenovirus e virus adeno-associati). Questo lavoro delinea anche un metodo per consentire una valutazione affidabile della suscettibilità cardiaca alle aritmie utilizzando cuori di topo e ratto isolati e perfusi da Langendorff con stimolazioni elettriche sia adrenergiche che programmate. Queste tecniche sono fondamentali per lo studio dei disturbi del ritmo cardiaco associati al rimodellamento cardiaco avverso dopo lesioni, come l'infarto del miocardio.
Introduzione
Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte in tutto il mondo, causando la morte di 18 milioni di persone nel solo 20171. I roditori, in particolare topi e ratti, sono diventati il modello più comunemente usato nella ricerca cardiovascolare a causa della facilità di manipolazione e della disponibilità di varie linee di sovraespressione transgenica o knockout. I modelli di roditori sono stati fondamentali per comprendere i meccanismi della malattia e per identificare potenziali nuovi bersagli terapeutici nell'infarto miocardico2, nell'ipertensione3, nell'insufficienza cardiaca4 e nell'aterosclerosi5. Tuttavia, l'uso dei roditori negli studi sulle aritmie cardiache è limitato dalle loro piccole dimensioni del cuore e dalla frequenza cardiaca più veloce rispetto ai modelli umani o animali di grandi dimensioni. Pertanto, le aritmie letali spontanee nei topi o nei ratti dopo infarto miocardico sono rare2. I ricercatori sono costretti a concentrarsi su cambiamenti secondari indiretti che potrebbero riflettere un substrato pro-aritmico, come la fibrosi o l'espressione genica, senza mostrare cambiamenti significativi nel carico di aritmia o tendenze pro-aritmiche. Per superare questa limitazione, nel presente protocollo è descritto un metodo che consente una valutazione affidabile della suscettibilità dei cuori di topo e ratto alle tachiaritmie ventricolari dopo modificazione genetica 6,7 o infarto miocardico2. Questo metodo combina la stimolazione del recettore adrenergico con la stimolazione elettrica programmata per indurre tachiaritmie ventricolari in8 cuori isolati di topo e ratto permeati da Langendorff.
Gli approcci standard per il trasferimento genico virale nel tessuto miocardico dei roditori spesso comportano l'esposizione del cuore mediante toracotomia 9,10,11, che è una procedura invasiva ed è associata a un ritardo nel recupero degli animali dopo la procedura. Questo articolo descrive un metodo di iniezione intramiocardica diretta del virus sotto guida di imaging ecografico per la sovraespressione dei transgeni. Questa procedura meno invasiva consente un recupero più rapido dell'animale dopo l'iniezione virale e meno lesioni tissutali, rispetto alla toracotomia, riduce il dolore post-operatorio e l'infiammazione nell'animale e, quindi, consente una migliore valutazione degli effetti dei geni transgenici sulla funzione cardiaca.
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Protocollo
Tutti i metodi e le procedure descritti sono stati approvati dal comitato di revisione etica della ricerca animale presso l'Università di Ottawa e dal comitato di revisione della biosicurezza presso l'Heart Institute dell'Università di Ottawa. I protocolli di sicurezza sviluppati includono che tutte le procedure relative all'adenovirus ricombinante o al virus adeno-associato (AAV) sono state eseguite in un armadio di biosicurezza di livello II. Tutti gli oggetti a contatto con il virus sono stati completamente decontaminati dopo l'esperimento. Per il presente studio sono stati utilizzati topi Ctnnb1 flox/flox e αMHC-MerCreMer (8-12 settimane di età compresa tra i sessi) e ratti Sprague-Dawley (200-250g, maschio). Gli animali sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali). Tutte le procedure relative agli animali sono state eseguite da personale formato e approvato da comitati regolatori istituzionali. Durante tutte le procedure sono stati utilizzati adeguati dispositivi di protezione individuale.
1. Espressione del transgene virale nei tessuti ventricolari dei roditori
NOTA: Conservare adenovirus ricombinante o AAV che esprime il gene bersaglio e il corrispondente virus di controllo, come Ad-GFP (titolo di 1 x 10 10 PFU / mL) o AAV9-GFP (titolo di 1 x 1013 GC / ml) (vedi tabella dei materiali), in un congelatore a -80 °C.
- Il giorno dell'iniezione del virus, scongelare il virus sul ghiaccio. Aspirare il virus che esprime il gene bersaglio e il virus di controllo in due siringhe separate (volume = 50 μL) con aghi da 30 G 1/2 e conservare in ghiaccio fino all'uso.
NOTA: Eventuali bolle nella siringa e nell'ago devono essere accuratamente rimosse. - Somministrare buprenorfina a ratti o topi (0,05 mg/kg per i ratti, 0,1 mg/kg per i topi, sottocutaneo), 1 ora dopo indurre l'anestesia usando isoflurano al 3% e mantenere l'isoflurano al 2% (al 100% di ossigeno ad una portata di 0,5-1,0 L/min) per la procedura successiva.
- Pizzicare delicatamente il corpo dell'animale (ad esempio, la coda) con un paio di pinze, e se l'animale non risponde al pizzico con alcun movimento del corpo, viene confermata la corretta anestesia.
- Mantenere la temperatura corporea a 37 °C utilizzando una piastra elettrica riscaldante. Rasare i capelli nella regione del torace usando un tagliacapelli.
NOTA: prestare attenzione durante l'utilizzo di una piastra riscaldante elettrica a causa della potenziale distribuzione irregolare del calore. - Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione della cornea.
- Mantenere l'animale in posizione supina e utilizzare un sistema di imaging preclinico (vedere Tabella dei materiali) per l'ecografia del cuore dell'animale con l'orientamento dell'asse corto.
NOTA: I seguenti passaggi vengono eseguiti in un armadio di biosicurezza di livello II che fornisce un ambiente sterile. Vengono impiegate procedure di sicurezza standard, comprese quelle con manipolazione sicura dell'ago. - Sterilizzare la regione inferiore sinistra del torace dell'animale con cicli alternati di uno scrub a base di iodio o clorexidina e alcol tre volte con un movimento circolare.
- Sotto guida per l'ecografia, inserire l'ago da 30 G 1/2 della siringa contenente il virus come preparato al punto 1.1. nel petto dell'animale attraverso il lato inferiore sinistro del corpo.
- Avvicinare la punta dell'ago nella parete libera anteriore ventricolare sinistra e iniettare lentamente 10-15 μL del virus. Verificare la riuscita dell'iniezione nelle immagini ecografiche grazie alla maggiore luminosità vicino alla punta dell'ago.
NOTA: La quantità di virus iniettata in ciascun sito non è superiore a 15 μL per prevenire danni fisici ai tessuti miocardici. - Ritirare l'ago dal cuore e inserirlo in altre regioni del ventricolo sinistro per una seconda e terza iniezione della stessa quantità di virus.
NOTA: Il numero totale di siti di iniezione è determinato dal disegno sperimentale. Se è richiesta l'espressione del transgene focale, è necessaria una sola iniezione; Se è richiesta un'espressione transgenica più diffusiva, di solito sono necessari più siti di iniezione (da tre a cinque). - Dopo il completamento delle iniezioni, riportare l'animale nella sua gabbia.
- Monitorare attentamente l'animale fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la reclinazione sternale e riportarlo nella sua stanza di alloggiamento.
- Somministrare buprenorfina HCl (0,1 mg/kg, due volte al giorno per i topi, 0,05 mg/kg, due volte al giorno per i ratti, per via sottocutanea) all'animale per i successivi 2 giorni. Riportare gli animali al vivaio e monitorare quotidianamente eventuali segni insoliti di dolore o angoscia e, se trovati, trattare gli animali secondo i protocolli del comitato istituzionale per la cura degli animali.
2. Valutazione della suscettibilità all'aritmia cardiaca
NOTA: A 4-6 giorni dopo l'iniezione di adenovirus e 1-2 settimane dopo l'iniezione di AAV, valutare la suscettibilità dei cuori degli animali alle aritmie cardiache seguendo i passaggi 2.1.-2.2.
- Eseguire la perfusione Langendorff del cuore di ratto o topo.
- Preparare la soluzione di Tyrode aggiungendo quanto segue a 1 L di acqua: NaCl, 7,9 g (finale = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl2, 0,27 g (1,8 mM); MgCl 2, 0,24 g (1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); e glucosio, 1,8 g (10 mM). Regolare il pH a 7,40 con NaOH (vedere Tabella dei materiali).
- Filtrare la soluzione con un filtro da 0,2 μm e bolla con il 100% di O 2 in modo continuo durante le fasi 2.1.6.-2.2.8 .
- Somministrare eparina al ratto o al topo (500 U/kg, iniezione intraperitoneale) e 10 minuti dopo anestetizzare l'animale con isoflurano al 3%. Garantire un'adeguata anestesia con un pizzico delicato sul corpo.
- Utilizzare un bisturi per fare un'incisione verticale di 1-1,5 cm nella linea medio-clavicolare per una toracotomia sinistra ed esporre il cuore.
- Raccogliere il cuore tagliando con un paio di forbici a livello dell'arco aortico e mettere immediatamente il cuore in soluzione di Tyrode ghiacciata.
NOTA: Si presta attenzione a non danneggiare il cuore durante la raccolta del cuore. - Cannulare l'aorta del cuore con un ago smussato (18 G per i ratti; 23 G per i topi) collegato ad un sistema di perfusione Langendorff modificato (vedi Tabella dei materiali) in modalità a flusso costante. Regolare la portata per mantenere la pressione di perfusione a 70-80 mmHg.
NOTA: Eventuali bolle nell'ago di perfusione devono essere rimosse prima dell'incannulamento aortico. L'uso di un microscopio da dissezione facilita l'incannulamento. - Porre il cuore cannulato in un piatto di plastica rivestito di elastomero siliconico da 9, 10 cm con il ventricolo sinistro rivolto verso l'alto e perfondere il cuore 9,12 con la soluzione di Tyrode a 37 °C con bolle di O.
- Verificare il corretto incannulamento aortico all'inizio della perfusione osservando il lavaggio del sangue dal cuore durante i primi due o tre battiti cardiaci e il cambiamento del colore del cuore dal rosso al pallido.
- Posizionare gli elettrodi di un sistema ECG di piccoli animali (vedi Tabella dei materiali) attorno al cuore inserendoli nel rivestimento in elastomero siliconico nel piatto (Figura 1). Registra ECG utilizzando un software compatibile.
- Eseguire la stimolazione del recettore adrenergico e la stimolazione elettrica programmata per indurre tachiaritmie ventricolari.
- Dopo il successo dell'incannulamento aortico, continuare a perfondere il cuore con la soluzione di Tyrode per 20 minuti per stabilizzare la preparazione del cuore.
- Aggiungere 1 μM di isoproterenolo (vedere Tabella dei materiali) alla soluzione di Tyrode utilizzata per la perfusione cardiaca nei punti 2.2.3.-2.2.8.
- Dopo 10 minuti di perfusione di isoproterenolo, stimolare il cuore all'apice con due elettrodi di platino collegati ad uno stimolatore elettrico (vedi Tabella dei materiali).
- Inizia con la procedura di stimolazione (Figura 2), che include 10 stimoli consecutivi (S1, 5 V, intervalli di 100 ms) seguiti da uno stimolo extra (S2) con un intervallo iniziale di 80 ms. Ridurre ripetutamente l'intervallo S2 di 2 ms ogni volta fino a quando il battito cardiaco non può più essere catturato (cioè raggiungere il periodo refrattario effettivo del cuore, ERP)13.
- Monitorare eventuali tachiaritmie ventricolari indotte (incluse tachicardia ventricolare e fibrillazione) mediante ECG.
- Se non vengono indotte aritmie dalla procedura di cui sopra, aggiungere un altro stimolo extra (S3) dopo S2 con gli stessi intervalli iniziali (80 ms) e di decremento (di 2 ms) fino al raggiungimento dell'ERP.
- Se le tachiaritmie ventricolari non sono ancora indotte, aggiungere un altro stimolo extra (S4) dopo S3 con gli stessi intervalli iniziali e di decremento fino al raggiungimento dell'ERP.
- Se le tachiaritmie ventricolari non sono ancora indotte (come previsto nei cuori sani di controllo), interrompere il protocollo di stimolazione elettrica e considerare il cuore non inducibile.
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Risultati
Quando perfuso seguendo il protocollo qui descritto (Figura 1), un cuore isolato di ratto o topo batte ritmicamente e stabilmente per almeno 4 ore. Se il disegno sperimentale richiede un periodo più lungo di perfusione cardiaca, è utile aggiungere albumina nella soluzione di perfusione per ridurre l'insorgenza di edema miocardico dopo perfusione a lungo termine14. L'inclusione di isoproterenolo nella soluzione di perfusione imita l'attivazione del sistema nervoso simp...
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Discussione
Diversi passaggi sono fondamentali per il successo della preparazione cardiaca isolata e perfusa da Langendorff. In primo luogo, è importante evitare qualsiasi danno al cuore durante la raccolta del cuore (ad esempio, a causa di spremitura accidentale o taglio con le forbici). In secondo luogo, è fondamentale mettere il cuore raccolto in una soluzione fredda di Tyrode il prima possibile perché questo fermerà il battito cardiaco e ridurrà il consumo di ossigeno del cuore. In terzo luogo, l'inserimento dell'ago nell'aorta ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Project Grants (PJT-148918 e PJT-180533, a WL), dal CIHR Early Career Investigator Award (AR8-162705, a WL), dalla borsa di studio McDonald della Heart and Stroke Foundation of Canada (HSFC) e dal New Investigator Award (S-17-LI-0866, a WL), borse di studio per studenti (a JW e YX) e una borsa di studio post-dottorato (ad AL) dall'Università di Ottawa Cardiac Endowment Funds presso l'Heart Institute. Gli autori ringraziano Richard Seymour per il suo supporto tecnico. La Figura 2 è stata creata con Biorender.com con licenze approvate.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 30 G 1/2 Precision Glide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| virus adeno-associato (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Livello II) | Microzone Corporation | N/A | Modello #: BK-2-4 |
| Buprenorfina | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Cloruro di calcio | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-glucosio | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Tagliacapelli | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Siringa Hamilton | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μ L |
| Termoforo | Brand | E12107 | |
| Eparina | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenolo cloridrato | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Versione 8.1.5 | per la registrazione ECG |
| Cloruro di magnesio esaidrato | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Topi (α MHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscopio | Leica | S9i | per sistema Langendorff |
| MS400 trasduttore | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Unguento oftalmico | Systane | DIN 02444062 | |
| Cloruro di potassio (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Misuratore di pressione | NETECH | DigiMano 1000 | per sistema Langendorff |
| Pompa | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | per sistema Langendorff |
| Rat (Sprague-Dawley, maschio) | Charles River | 400 | |
| Lame per bisturi | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Manico per bisturi | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Elastomero siliconico | Down Inc. | Sylgard 184 | per sistema Langendorff |
| Sistema ECG per piccoli animali | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 e Animal Bio Amp |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimolatore | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Sistema di imaging preclinico | VisualSonic Inc. | N/A |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
