Ricostituzione dell'assemblaggio di septina alle membrane per lo studio delle proprietà e delle funzioni biofisiche

Brandy N. Curtis; Ellysa J. D. Vogt; Kevin S. Cannon; Amy S. Gladfelter

doi:10.3791/64090

Articolo metodologico

Ricostituzione dell'assemblaggio di septina alle membrane per lo studio delle proprietà e delle funzioni biofisiche

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DOI:

10.3791/64090

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28 luglio 2022

Brandy N. Curtis^*¹ , Ellysa J. D. Vogt^*² , Kevin S. Cannon¹^,³ , Amy S. Gladfelter¹^,²^,³

¹Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, ²Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, ³Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La ricostituzione senza cellule è stata uno strumento chiave per comprendere l'assemblaggio del citoscheletro e il lavoro nell'ultimo decennio ha stabilito approcci per studiare la dinamica della settina in sistemi minimi. Qui sono presentati tre metodi complementari per osservare l'assemblaggio della settina in diversi contesti di membrana: doppi strati planari, supporti sferici e supporti per aste.

Abstract

La maggior parte delle cellule può percepire e cambiare la propria forma per eseguire processi cellulari fondamentali. In molti eucarioti, il citoscheletro della settina è una componente integrante nel coordinare i cambiamenti di forma come la citochinesi, la crescita polarizzata e la migrazione. Le settine sono proteine che formano filamenti che si assemblano per formare diverse strutture di ordine superiore e, in molti casi, si trovano in diverse aree della membrana plasmatica, in particolare nelle regioni di curvatura positiva su scala micron. Il monitoraggio del processo di assemblaggio della settina in vivo è ostacolato dalle limitazioni della microscopia ottica nelle cellule, nonché dalla complessità delle interazioni sia con le membrane che con gli elementi citoscheletrici, rendendo difficile quantificare la dinamica della settina nei sistemi viventi. Fortunatamente, ci sono stati progressi sostanziali nell'ultimo decennio nella ricostituzione del citoscheletro della settina in un sistema privo di cellule per sezionare i meccanismi che controllano l'assemblaggio della settina ad alte risoluzioni spaziali e temporali. Le fasi principali dell'assemblaggio della settina includono l'associazione e la dissociazione dell'eterooligomero della settina con la membrana, la polimerizzazione in filamenti e la formazione di strutture di ordine superiore attraverso le interazioni tra i filamenti. Qui, presentiamo tre metodi per osservare l'assemblaggio della settina in diversi contesti: doppi strati planari, supporti sferici e supporti per aste. Questi metodi possono essere utilizzati per determinare i parametri biofisici delle settine in diverse fasi di assemblaggio: come singoli ottameri che legano la membrana, come filamenti e come gruppi di filamenti. Utilizziamo questi parametri abbinati a misurazioni del campionamento della curvatura e dell'adsorbimento preferenziale per capire come funziona il rilevamento della curvatura in una varietà di scale di lunghezza e tempo.

Introduzione

Le forme delle cellule e molti dei loro compartimenti interni dipendono dalle membrane lipidiche che le circondano. Le membrane sono strutture viscoelastiche che possono essere deformate attraverso interazioni con proteine, selezione lipidica e forze interne ed esterne che agiscono per generare una varietà di forme 1,2,3,4. Queste forme sono spesso descritte in termini di curvatura della membrana. Le cellule utilizzano una suite diversificata di proteine in grado di assemblarsi preferenzialmente su particolari curvature di membrana per garan....