Il presente protocollo descrive i metodi di integrazione lipidica in colture liquide e su piastra per Caenorhabditis elegans, accoppiati con studi longitudinali e analisi trascrizionali geniche da bulk o da pochi vermi e tessuti di vermi.
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Articolo metodologico
Supplementazione lipidica per la longevità e analisi trascrizionale genica in Caenorhabditis elegans
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'invecchiamento è un processo complesso caratterizzato da progressivi cambiamenti fisiologici derivanti da contributi sia ambientali che genetici. I lipidi sono cruciali nel costituire componenti strutturali delle membrane cellulari, immagazzinare energia e come molecole di segnalazione. La regolazione del metabolismo lipidico e della segnalazione è essenziale per attivare percorsi di longevità distinti. Il nematode Caenorhabditis elegans è un organismo eccellente e potente per analizzare il contributo del metabolismo lipidico e della segnalazione nella regolazione della longevità. Diversi studi di ricerca hanno descritto come l'integrazione dietetica di specifiche molecole lipidiche può prolungare la durata della vita di C. elegans ; Tuttavia, piccole differenze nelle condizioni di integrazione possono causare problemi di riproducibilità tra gli scienziati in diversi laboratori. Qui, due metodi di integrazione dettagliati per C. elegans sono segnalati impiegando l'integrazione lipidica sia con batteri seminati su piastre o sospensione batterica in coltura liquida. Qui sono forniti anche i dettagli per eseguire saggi di durata della vita con supplementazione lipidica permanente e analisi qRT-PCR utilizzando un lisato di verme intero o tessuti sezionati derivati da alcuni vermi. Utilizzando una combinazione di studi longitudinali e indagini trascrizionali sull'integrazione lipidica, i saggi di alimentazione forniscono approcci affidabili per analizzare come i lipidi influenzano la longevità e l'invecchiamento sano. Questa metodologia può anche essere adattata per vari approcci di screening nutrizionale per valutare i cambiamenti in un sottoinsieme di trascrizioni utilizzando un piccolo numero di tessuti sezionati o alcuni animali.
Introduzione
Lipidi
I lipidi sono piccole molecole idrofobiche o anfipatiche solubili in solventi organici ma insolubili in acqua 1,2. Le molecole lipidiche distinte si differenziano l'una dall'altra in base al numero di atomi di carbonio contenuti nelle loro catene, alla posizione, al numero di doppi legami e alle strutture legate, tra cui glicerolo o fosfati. I lipidi svolgono ruoli cruciali all'interno e attraverso cellule distinte per regolare le funzioni dell'organismo, tra cui la costituzione di doppi strati di membrana, fornendo accumulo di energia e agendo come molecole di segnalazione
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Protocollo
La Figura 1 mostra uno schema dell'alimentazione lipidica utilizzando diverse impostazioni sperimentali.
1. Preparazione di batteri lipidici condizionati
- Preparare la soluzione di base di restrizione dietetica di diluizione batterica (BDR) sciogliendo 5,85 g di NaCl, 1,0 g di K 2 HPO 4 e 6,0 g diKH2PO4 (vedere Tabella dei materiali) in 999 ml di acqua deionizzata. Regolare il pH a 6,0 con 0,5 M KOH, quindi filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm.
NOTA: La soluzione BDR può essere conservata a temperatura ambiente per la ....
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Risultati
Validazione dei cambiamenti trascrizionali utilizzando alcuni vermi interi dopo l'integrazione lipidica
Per indagare se il protocollo per estrarre e retrotrascrivere l'RNA in cDNA da pochi vermi interi è riproducibile e confrontabile con i dati dei vermi sfusi, è stato impiegato un ceppo di vermi di lunga durata che sovraesprime l'acido lisosomiale lipasi lipl-4 nell'intestino 7,8,33,35.
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Discussione
L'integrazione lipidica è stata impiegata nella ricerca sull'invecchiamento per chiarire l'impatto diretto di alcune specie lipidiche sull'invecchiamento sano 6,7,23,26,27,31. Tuttavia, la procedura di integrazione lipidica può essere impegnativa e qualsiasi incoerenza tra gli esperimenti può causare risultati non riproducibi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo P. Svay per il supporto alla manutenzione. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI investigator (MCW) e NIH T32 ES027801 pre-doctoral student fellow (MS). Alcuni ceppi sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dall'Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pestello da 1,5 mL | Genesee Scientific | 93-165P15 | Per la macinazione di vermi con Trizol |
| Agarosio | Sigma | A9639-500G | |
| AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix | GenDEPOT | R5600 | Per la trascrizione inversa da campioni di vermi sfusi |
| Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR | ThermoFisher | A28567 | Per qRT-PCR |
| Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuga | Benchmark Scientific | C1248 | Per provette PCR spin down |
| Sonificatore digitale Branson 450, con punta da 1/8" | Branson Ultrasonic Corporation | 100-132-888R | |
| Cloroformio | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Colesterolo | Sigma | C8503-25G | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Sigma | D8418-100ML | |
| Eppendorf 5424 R centrifuga | Eppendorf | 22620444R | Per l'estrazione dell'RNA |
| Eppendorf vapo protect mastercycler pro | Eppendorf | 950030010 | Per la trascrizione inversa |
| Etanolo, assoluto (200 prove) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| Greiner Bio-One CELLSTAR, piastra da 12 W | Neta Scientific | 665180 | 12 pozzetti piastre per l'alimentazione di licuid |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm | Neta Scientific 664161 | Per piastre batteriche LB e vermi Piastre NGM da 10 cm | |
| Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm | Neta Scientific | 628161 | Per vermiPiastre NGM da 6 cm |
| Acqua priva di nucleasi Invitrogen | ThermoFisher | AM9937 | |
| Isoproanol | Sigma | PX1835-2 | |
| Levamisolo cloridrato | VWR | SPCML1054 | |
| lipl-4Tg | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
| lipl-4Tg; fat-3(wa22) | MCW Lab | N/A | Transgenico C. elegans |
| Luria Brodo Base | ThermoFisher | 12795-084 | |
| Solfato di magnesio (MgSO4) | Sigma | M2643-500G | |
| MicroAmp EnduraPlate Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti con codice a barre | ThermoFisher | 4483354 | Piastra |
| qPCR a 96 pozzettiPellicola adesiva ottica MicroAmp | Applied BioSystem | 4311971 | Per sigillare la piastra qPCR a 96 pozzetti |
| Sistema di purificazione dell'acqua Milli-Q Advantage A10 Sigma | Z00Q0V0WW | Acqua deionizzata utilizzata per produrre tutti i reagenti, compresi i tamponi e i terreni di coltura, a meno che non sia specificato come acqua priva di nucleasi nel protocollo | |
| N2 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | C. elegans wild isolate |
| Spettrofotometro NanoDrop ND-1000 | ThermoFisher | N/A | Per misurare la concentrazione di RNA |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | Batteri utilizzati come C. elegans alimentare |
| Fosfato di potassio bibasico triidrato (K2HPO4· 3H2O) | Sigma | P5504-1KG | |
| Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4) | Sigma | P0662-2.5KG | |
| Kit da celle verdi a Ct Power SYBR | ThermoFisher | 4402953 | Per la trascrizione inversa e la qPCR da alcuni vermi o tessuto di vermi |
| Power SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4367659 | per qPCR da campioni di vermi sfusi |
| Ultra candeggina germicida Pure Bright | KIK Internazionale LLC. | 59647210143 | 6% candeggina per la casa Per la preparazione di uova di vermi |
| Piastra spot in Pyrex con nove depressioni | Sigma | CLS722085-18EA | Vetro per orologio per sezionare i vermi |
| RNaseZap Soluzione di decontaminazione RNasi | ThermoFisher | AM9780 | |
| Clouro di sodio (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
| Idrossido di sodio (NaOH) | Sigma | SX0590-3 | |
| Fosfato di sodio bibasico eptaidrato (Na2HPO4· 7H2O) | Sigma | S9390-1KG | |
| Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuga | Thermo | 7500-4337 | Per la raccolta dei batteri |
| Thermo Sorvall ST 8 centrifuga | Thermo | 7500-7200 | Per la preparazione di uova di verme |
| Reagente TRIzol | TheroFisher | 15596018 | Reagente per l'estrazione dell'RNA |
| Kit Turbo senza DNA | ThermoFisher | AM1907 | Per la rimozione della contaminazione da DNA nelle estrazioni di RNA |
| Vortexer 59 | Denville Scientific INV | S7030 | |
| VWR Miscelatori di pellet monouso e motore a batteria | VWR | 47747-370 | Per la macinazione di viti senza fine con Trizol |
| VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini centrifuga C1413 V-115 | VWR | N/A | Per la raccolta di vermi. Modello fuori produzione, uno simile disponibile presso VWR con Cat# 76269-064 |
| Raccoglitore di viti senza fine | WormStuff | 59-AWP |
Riferimenti
- Fahy, E., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1. Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).
- Liebisch, G., et al. Update on LIPID MAPS classificatio....
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Ristampe e permessi
