Supplementazione lipidica per la longevità e analisi trascrizionale genica in Caenorhabditis elegans

Lipidi
I lipidi sono piccole molecole idrofobiche o anfipatiche solubili in solventi organici ma insolubili in acqua ^1,2. Le molecole lipidiche distinte si differenziano l'una dall'altra in base al numero di atomi di carbonio contenuti nelle loro catene, alla posizione, al numero di doppi legami e alle strutture legate, tra cui glicerolo o fosfati. I lipidi svolgono ruoli cruciali all'interno e attraverso cellule distinte per regolare le funzioni dell'organismo, tra cui la costituzione di doppi strati di membrana, fornendo accumulo di energia e agendo come molecole di segnalazione ^3,4.

In primo luogo, i lipidi sono componenti strutturali delle membrane biologiche, compresa la membrana plasmatica e le membrane subcellulari intracellulari che dividono i compartimenti interni dall'ambiente extracellulare. In secondo luogo, i lipidi sono la principale forma di accumulo di energia negli animali vertebrati e invertebrati. I lipidi neutri, compresi i triacilgliceroli, sono immagazzinati per un lungo periodo in vari tessuti, incluso il tessuto adiposo. Nel nematode Caenorhabditis elegans, l'intestino è il principale organo metabolico di deposito del grasso; La sua funzione non è solo coinvolta nella digestione e nell'assorbimento dei nutrienti, ma anche nel processo di disintossicazione, che assomiglia all'attività degli epatociti dei mammiferi. Altri tessuti di accumulo di grasso includono la linea germinale, in cui i lipidi sono essenziali per lo sviluppo degli ovociti, e l'ipoderma, che è composto da cellule epidermiche simili alla pelle ^3,5. In terzo luogo, negli ultimi anni, ulteriori prove hanno suggerito che i lipidi sono potenti molecole di segnalazione coinvolte nella segnalazione intra ed extracellulare agendo direttamente su una varietà di recettori, compresi i recettori accoppiati a proteine G e nucleari, o indirettamente attraverso la modulazione della fluidità della membrana o le modifiche post-traduzionali 6,7,8,9 . Ulteriori studi continueranno a chiarire i meccanismi molecolari alla base della segnalazione lipidica nel promuovere la longevità e la durata della salute.

Gli organismi modello sono importanti per affrontare specifiche questioni biologiche che sono troppo complesse da studiare negli esseri umani. Ad esempio, il nematode C. elegans è un modello eccellente per condurre analisi genetiche per sezionare i processi biologici rilevanti per la nutrizione umana e la malattia¹⁰. I percorsi molecolari altamente conservati rilevanti per la fisiologia umana, i tessuti complessi, i modelli comportamentali e gli abbondanti strumenti di manipolazione genetica rendono C. elegans un notevole organismo modello¹¹. Ad esempio, C. elegans è eccellente nell'inoltro di screening genetici per identificare geni fenotipo-specifici, così come negli screening genetici inversi a livello di genoma tramite interferenza RNA¹².

Nei laboratori, i nematodi vengono coltivati su piastre di agar Petri seminate con un prato di batteri Escherichia coli, fornendo macronutrienti come proteine, carboidrati e acidi grassi saturi e insaturi come fonti di energia e mattoni e micronutrienti come co-fattori e vitamine¹³. Analogamente ai mammiferi, i nematodi sintetizzano molecole di acidi grassi sia dall'acido palmitico che dall'acido stearico (molecole sature a 16 e 18 atomi di carbonio, rispettivamente) che sono sequenzialmente desaturate e allungate in una varietà di acidi grassi monoinsaturi (MUFA) e acidi grassi polinsaturi (PUFA)14,15,16,17,18. È interessante notare che C. elegans è in grado di sintetizzare de novo tutti gli acidi grassi necessari e gli enzimi principali coinvolti nella biosintesi, nella desaturazione e nell'allungamento degli acidi grassi, facilitando la sintesi di PUFA a catena lunga¹⁹. A differenza di altre specie animali, C. elegans può convertire gli acidi grassi ω-6 a 18 e 20 atomi di carbonio in acidi grassi ω-3 con i propri enzimi ω-3 desaturasi. Inoltre, i vermi possiedono una Δ12 desaturasi che catalizza la formazione di acido linoleico (LA) dall'acido oleico (OA, 18:1)^20,21. La maggior parte degli animali o delle piante mancano sia di Δ12 che di ω-3 desaturasi e quindi si basano sull'assunzione alimentare di ω-6 e ω-3 per ottenere i loro PUFA, mentre C. elegans non richiede acidi grassi alimentari²². Mutanti isolati privi di enzimi desaturasi funzionali sono stati utilizzati per studiare le funzioni di specifici acidi grassi in processi biologici distinti, tra cui riproduzione, crescita, longevità e neurotrasmissione. L'effetto dei singoli acidi grassi su specifici percorsi biologici può essere affrontato utilizzando sia un approccio genetico che un'integrazione dietetica^16,17,23. Ad oggi, la ricerca sui lipidi si è concentrata sulla caratterizzazione dei geni coinvolti nella sintesi, degradazione, conservazione e rottura dei lipidi nelle condizioni neurologiche e di sviluppo²⁴. Tuttavia, i ruoli dei lipidi nella regolazione della longevità stanno appena iniziando a essere rivelati.

Segnalazione lipidica nella regolazione della longevità
I lipidi svolgono un ruolo cruciale nella regolazione della longevità attivando cascate di segnalazione cellulare in tessuti e tipi di cellule distinti. Studi recenti hanno evidenziato il ruolo attivo dei lipidi nella modulazione della trascrizione e della comunicazione cellula-cellula attraverso proteine leganti i lipidi o il riconoscimento dei recettori di membrana²⁵. Inoltre, l'integrazione lipidica dietetica offre uno strumento eccellente per sezionare come il metabolismo lipidico influenza la durata della vita in C. elegans. È stato dimostrato che MUFA e PUFA distinti promuovono la longevità attivando i fattori di trascrizione^26,27.

I modelli di longevità, tra cui la segnalazione insulina / IGF-1 e l'ablazione delle cellule precursori della linea germinale, sono associati alla via di biosintesi MUFA e l'integrazione di MUFA, tra cui acido oleico, acido palmitoleico e cis-vaccenic, è sufficiente per estendere la durata della vita di C. elegans ²⁶. Sebbene l'effetto longevità conferito dalla somministrazione di MUFA richieda ulteriori indagini, è probabile che il meccanismo sottostante sia mediato dal fattore di trascrizione SKN-1 / Nrf2, che è un attivatore chiave della risposta allo stress ossidativo e della regolazione della longevità^28,29. Tra i MUFA, una particolare classe di etanolammidi acili grasse chiamate N-aciletanolammine (NAE) svolge ruoli cruciali in meccanismi distinti tra cui infiammazione, allergie, apprendimento, memoria e metabolismo energetico³⁰. In particolare, la molecola lipidica nota come oleoiletanolamide (OEA) è stata identificata come regolatore positivo della longevità promuovendo la traslocazione della proteina legante i lipidi 8 (LBP-8) nel nucleo per attivare i recettori ormonali nucleari NHR-49 e NHR-80⁷. L'integrazione dell'analogo OEA KDS-5104 è sufficiente per prolungare la durata della vita e induce l'espressione di geni coinvolti nelle risposte allo stress ossidativo e nella β-ossidazione mitocondriale ^7,8.

Allo stesso tempo, il ruolo dei PUFA è stato anche collegato alla regolamentazione della longevità. La somministrazione di acido grasso PUFA ω-3 acido α-linolenico (ALA) promuove la longevità attivando i fattori di trascrizione NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF e inducendo la β-ossidazione mitocondriale³¹. È interessante notare che i prodotti perossidati di ALA, indicati come ossilipine, attivano SKN-1 / NRF, suggerendo che sia i PUFA che i loro derivati ossidativi possono conferire benefici di longevitಳ. L'integrazione dell'acido grasso ω-6 acido arachidonico (AA) e dell'acido diomo-γ-linolenico (DGLA) prolunga la durata della vita attraverso l'attivazione dell'autofagia, promuovendo il controllo della qualità delle proteine e determinando la degradazione degli aggregati proteici sprecati e tossici^27,32. Più recentemente, una regolazione del segnale cellulare non autonoma mediata dalla proteina legante i lipidi 3 (LBP-3) e DGLA ha dimostrato di essere cruciale per promuovere la longevità inviando segnali periferici ai neuroni, suggerendo un ruolo a lungo raggio delle molecole lipidiche nella comunicazione intertissutale a livelli sistemici³³. Il presente studio riporta ogni fase per eseguire l'integrazione lipidica con batteri seminati su piastre o sospensione batterica in coltura liquida. Queste metodologie sono utilizzate per valutare la durata della vita e l'analisi trascrizionale, impiegando il contenuto di tutto il corpo o tessuti sezionati derivati da alcuni vermi. Le seguenti tecniche possono essere adattate a una varietà di studi nutrizionali e offrono un valido strumento per analizzare come il metabolismo lipidico influenza la longevità e l'invecchiamento sano.

La Figura 1 mostra uno schema dell'alimentazione lipidica utilizzando diverse impostazioni sperimentali.

1. Preparazione di batteri lipidici condizionati

1. Preparare la soluzione di base di restrizione dietetica di diluizione batterica (BDR) sciogliendo 5,85 g di NaCl, 1,0 g di K 2 HPO 4 e 6,0 g diKH₂PO₄ (vedere Tabella dei materiali) in 999 ml di acqua deionizzata. Regolare il pH a 6,0 con 0,5 M KOH, quindi filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm.
   NOTA: La soluzione BDR può essere conservata a temperatura ambiente per la conservazione a lungo termine.
2. Preparare il mezzo BDR aggiungendo 10 μL di colesterolo 5 mg/ml (sciolto in etanolo 200-proof) ad ogni 10 mL di soluzione base BDR.
3. Strisciare i batteri OP50 (vedi tabella dei materiali) da -80 °C alle piastre di agar LB e incubare a 37 °C durante la notte.
   NOTA: Dopo l'incubazione notturna a 37 °C, la piastra OP50 può essere conservata a 4 °C per un massimo di 1 settimana per risultati di alimentazione costanti.
4. Inoculare i batteri OP50 dalla piastra di agar OP50 LB al mezzo LB e incubare in uno shaker a 37 °C per una notte (16 ore).
   NOTA: il volume medio LB necessario dipende dalle impostazioni sperimentali. Si raccomanda di utilizzare 200 μL di 5x batteri concentrati seminati su ciascuna delle piastre da 6 cm e 1 mL di 5x batteri concentrati per ciascuna delle piastre da 10 cm e ciascuna replica delle condizioni di alimentazione liquida. Pertanto, 1 mL e 5 mL di inoculazione LB iniziale devono essere preparati rispettivamente per ogni coltura di alimentazione lipidica.
5. Raccogliere i batteri mediante centrifugazione a 4.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante.
6. Sospendere il pellet batterico in 20 ml di base BDR e centrifugare a 4.000 x g per 10 minuti. Scartare il surnatante.
   NOTA: Questo passaggio è fondamentale per lavare via i residui residui di LB nel pellet batterico.
7. Sospendi ogni pellet batterico nel mezzo BDR per creare uno stock di batteri BDR 20x. Diluire il brodo di batteri BDR 20x con mezzo BDR a 5x prima dell'uso.
   NOTA: Utilizzare un volume 1/20 di mezzo BDR del volume LB originale per raggiungere una concentrazione 20x per i batteri. Lo stock di batteri 20x può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
8. Preparare una soluzione madre lipidica, utilizzando etanolo o dimetilsolfossido (DMSO) come solvente in un nuovo flaconcino di vetro autoclavato, e riempire il flaconcino di vetro con argon o azoto per prevenire l'ossidazione.
   NOTA: la concentrazione della soluzione madre è solitamente compresa tra 250 mM e 1 mM.
9. Trasferire la soluzione madre lipidica nella quantità desiderata di soluzione di batteri BDR per ottenere la concentrazione finale desiderata in condizioni di alimentazione. Mescolare accuratamente vorticando per 20 s.
   NOTA: La concentrazione finale dei lipidi nell'alimentazione è solitamente compresa tra 1 μM e 1 mM, a seconda delle condizioni lipidiche e di test. Si raccomanda di eseguire prima un esperimento pilota per testare diverse concentrazioni che vanno da 0,1 μM a 1 mM se si lavora con nuovi lipidi. Mescolare la soluzione lipidica con batteri BDR immediatamente prima di seminarla sulla piastra o metterla in colture di vermi liquidi. Preparare i batteri lipidici non più di 1 ora prima di nutrire i vermi.
10. Mescolare gli stessi volumi di etanolo filtrato o DMSO (a seconda di quale viene utilizzato per il gruppo di alimentazione lipidica) con batteri BDR per fungere da controllo del veicolo.

2. Preparazione di C. elegans sincronizzato per l'integrazione lipidica

1. Preparare il tampone M9 miscelando (utilizzando le concentrazioni finali specificate) 22 mM KH 2 PO 4, 22 mM Na 2 HPO 4, 85mM NaCl e₂mM MgSO ₄ (vedere Tabella dei materiali). Autoclavare il tampone per sterilizzare.
2. Preparare una soluzione di candeggina fresca con candeggina domestica al 60% (v/v, vedi Tabella dei materiali) e una concentrazione finale di 1,6 M NaOH.
3. Raccogliere adulti gravidi in un tubo conico da 15 mL utilizzando 10 mL di tampone M9.
   NOTA: il numero di worm e piastre necessari per la sincronizzazione dipende dalle impostazioni sperimentali (ad esempio, dal numero di condizioni, repliche e metodi di alimentazione). Idealmente, ogni piastra completa di 6 cm di vermi adulti dovrebbe essere in grado di produrre almeno 600 vermi L1 dopo la sincronizzazione.
4. Girare i vermi a 1.450 x g per 30 s. Rimuovere il surnatante e sciacquare i vermi ancora una volta con 10 ml di tampone M9.
5. Girare i vermi a 1.450 x g per 30 s. Aspirare il surnatante, lasciando un'aliquota di 4 mL nel tubo conico. Aggiungere 2 ml di soluzione di candeggina e agitare vigorosamente per 1 minuto.
6. Girare i vermi a 1.450 x g per 30 s a temperatura ambiente.
7. Rimuovere il surnatante e aggiungere 4 ml di tampone M9 e 2 ml di soluzione di candeggina. Agitare il tubo fino a quando i corpi del verme sono sciolti.
8. Girare le uova a 1.450 x g per 30 s a temperatura ambiente.
9. Rimuovere il surnatante e lavare le uova con 10 ml di tampone M9.
10. Ripetere i passaggi 2.8 e 2.9 3x.
11. Sospendere gli embrioni con 6 ml di tampone M9. Cullare gli embrioni su un rotatore a 20 °C per 2 giorni per farli schiudere e sincronizzare.
12. Trasferire le larve di L1 in piastre seminate OP50. Incubare a 20 °C per 48 ore per raccogliere vermi L4 sincronizzati, 72 ore per gli adulti del giorno 1 e 96 ore per gli adulti del giorno 2.
    NOTA: Le piastre OP50 vengono preparate aggiungendo 1 ml di 20x batteri OP50 a ciascuna piastra³⁴ del terreno di crescita dei nematodi (NGM) da 10 cm. 30.000 vermi L1 possono essere seminati su ciascuna delle piastre OP50 se si mira a raccogliere i vermi allo stadio L4, e 20.000 vermi L1 possono essere seminati in ciascuna delle piastre OP50 se si mira a raccogliere adulti del giorno 1 negli attuali contesti sperimentali. Potrebbe essere diverso per le diverse impostazioni di laboratorio, quindi si consiglia di testare i numeri di vermi che possono essere seminati per assicurarsi che i vermi abbiano abbastanza cibo prima di essere raccolti.
13. Raccogliere vermi adulti L4, day-1 o day-2 adulti in un tubo conico da 15 mL usando 10 mL di tampone M9. Utilizzare altri 5 ml di tampone M9 per sciacquare i vermi rimanenti dalle piastre.
14. Ruotare i vermi a 1.450 x g per 30 s e scartare il surnatante. Lavare il pellet di verme con 10 ml di terreno BDR, centrifugare a 1.450 x g per 30 s ed eliminare il surnatante.
15. Per i vermi nel metodo di alimentazione liquida, trasferire il mezzo BDR ai vermi per ottenere una concentrazione di vermi di 3.000 vermi / ml. Per i vermi nei metodi di alimentazione sulla piastra, ridurre il volume del mezzo BDR aggiunto ai vermi per ridurre il tempo di asciugatura sulla piastra.

3. Supplementazione lipidica per C. elegans

1. Eseguire l'integrazione lipidica in coltura liquida seguendo i passaggi seguenti.
   NOTA: Questo metodo è adatto per testare i cambiamenti trascrizionali utilizzando vermi di massa integrati con lipidi.
   1. Trasferire la quantità desiderata di lipidi o controllo del veicolo a ciascuno dei pozzetti in una piastra a 12 pozzetti. Preparare da tre a quattro pozzetti per ogni condizione di alimentazione come replicazione biologica.
   2. Mescolare la sospensione di vermi dal passaggio 2.15 con 5x batteri BDR in un rapporto 1: 1 per ottenere una concentrazione finale di 1.500 vermi / ml e 2,5 volte per i batteri.
   3. Trasferire 2 ml della miscela verme-batteri in mezzo BDR a ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti.
   4. Avvolgere la piastra a 12 pozzetti con un foglio e agitare in un incubatore a 20 °C a 100 giri/min per la lunghezza di incubazione desiderata.
      NOTA: Per testare diverse condizioni di alimentazione, incubare i lipidi con vermi per diversi periodi di tempo, ad esempio per 6 ore, 12 ore e 24 ore. Inoltre, diversi stadi del verme possono essere testati per ottenere risultati ottimali, compresa l'alimentazione lipidica dalla fase adulta L4 o day-1.
2. Eseguire l'integrazione lipidica sulle piastre di agar NGM da 10 cm seguendo i passaggi seguenti.
   NOTA: Questo metodo è adatto per testare i cambiamenti trascrizionali utilizzando vermi di massa integrati con lipidi.
   1. Seminare 1 mL di batteri lipidici condizionati dal punto 1.9 al centro di ciascuna delle piastre da 10 cm. Quando è stato preparato un numero elevato di piastre, vortice la soluzione di lavoro finale più volte tra una semina e l'altra. Asciugare le piastre al buio utilizzando un cappuccio di biosicurezza.
   2. Trasferire 3.000 vermi dal passo 2.15 a ciascuna delle piastre da 10 cm. Asciugare le piastre in un cappuccio di biosicurezza fino a quando i vermi possono strisciare sulle piastre integrate con lipidi invece di nuotare.
   3. Incubare i vermi sulle piastre con lipidi condizionati in un'incubatrice a 20 °C per il periodo di tempo desiderato. Proteggere dalla luce se si utilizzano lipidi polinsaturi.
      NOTA: Per testare diverse condizioni di alimentazione, incubare i lipidi con vermi per vari periodi di tempo, come 6 ore, 12 ore e 24 ore. Inoltre, diversi stadi del verme possono essere testati per risultati ottimali, compresa l'alimentazione lipidica nella fase L4 o day-1 adulta.
3. Eseguire l'integrazione lipidica sulle piastre di agar NGM da 6 cm per l'analisi trascrizionale.
   NOTA: Questo metodo è adatto per testare i cambiamenti trascrizionali in alcuni vermi integrati con lipidi.
   1. Seminare 300 μL di batteri lipidici condizionati dal punto 1.9 al centro di ciascuna piastra di 6 cm. Quando è stato preparato un numero elevato di piastre, vortice la soluzione di lavoro finale più volte tra una semina e l'altra. Asciugare le piastre al buio utilizzando un cappuccio di biosicurezza.
   2. Trasferire fino a 300 vermi dal passo 2.15 a ciascuna delle piastre da 6 cm. Asciugare le piastre in un cappuccio di biosicurezza fino a quando i vermi possono strisciare sulle piastre integrate con lipidi invece di nuotare.
   3. Incubare i vermi sulle piastre con lipidi condizionati in un'incubatrice a 20 °C per il periodo di tempo desiderato. Proteggere dalla luce se si utilizzano lipidi polinsaturi.
      NOTA: Per testare diverse condizioni di alimentazione, incubare i lipidi con vermi in diversi punti temporali, come 6 ore, 12 ore e 24 ore. Inoltre, diversi stadi del verme possono essere testati per risultati ottimali, compresa l'alimentazione lipidica nella fase L4 o day-1 adulta.
4. Eseguire l'integrazione lipidica sulle piastre di agar NGM da 6 cm per il saggio longitudinale.
   1. Seminare 200 μL di batteri lipidici condizionati (con 1x concentrazione lipidica e 5x batteri concentrati) al centro di ciascuna delle piastre NGM da 6 cm. Preparare tre piastre per ogni condizione di alimentazione.
      NOTA: Le piastre devono essere preparate fresche il giorno dell'uso (idealmente subito prima dell'uso).
   2. Asciugare le piastre in un cappuccio di biosicurezza. Tenere le luci nella cappa e nella stanza spenta se si utilizzano lipidi polinsaturi.
   3. Scegliete 30-40 vermi L4 sincronizzati su ciascuna delle piastre. Conservare le piastre con i vermi in un'incubatrice a 20 °C. Se si alimenta con lipidi polinsaturi, conservare le piastre in una scatola protetta dalla luce nell'incubatore a 20 °C.
      NOTA: È possibile utilizzare OP50 da una normale piastra di passaggio di 6 cm (OP50 non condizionato) come colla per raccogliere i vermi, ma è fondamentale non lasciare una quantità massiccia di OP50 incondizionato nella piastra di analisi.
   4. Trasferire i vermi in nuove piastre appena fatte con condizionamento lipidico ogni giorno o a giorni alterni, a seconda delle condizioni di alimentazione desiderate. La sopravvivenza è valutata nello stesso modo di^{4 precedentemente} descritto.

4. Estrazione dell'RNA per analisi trascrizionale

1. Eseguire l'estrazione dell'RNA da un numero di vermi interi.
   1. Trasferire i vermi nella coltura liquida dal punto 3.1 a 1,5 mL di provette di microcentrifuga. Lavare i vermi dalle piastre da 10 cm dal punto 3.2 utilizzando il tampone M9 e trasferire i vermi nel tampone M9 in provette da microcentrifuga da 1,5 ml.
   2. Centrifugare brevemente i vermi con una mini centrifuga da tavolo (vedi Tabella dei materiali) per 10 s e aspirare rapidamente il surnatante.
   3. Trasferire i vermi rimanenti dai pozzetti di alimentazione liquidi o lavare dalle piastre allo stesso tubo e girare verso il basso. Rimuovere il surnatante.
   4. Lavare i pellet di verme con 1 mL di M9 ghiacciato, centrifugare brevemente per 10 secondi con una mini centrifuga e aspirare il surnatante. Ripetere 1x o 2x a seconda della trasparenza del surnatante.
   5. Impostare le provette della microcentrifuga sul ghiaccio per 2 minuti e rimuovere quanto più surnatante possibile con una pipetta da 200 μL, lasciando un pellet di vite senza fine impacchettato di volume non superiore a 15 μL.
   6. Trasferire 15 μL di soluzione di estrazione dell'RNA contenente fenolo e isotiocianato di guanidina (tabella dei materiali) in ciascuna delle provette della microcentrifuga e macinare i vermi con una smerigliatrice a motore per circa 30 s fino a quando non sono visibili vermi intatti.
      ATTENZIONE: La soluzione di estrazione dell'RNA è tossica e infiammabile e qualsiasi passaggio che coinvolga un contenitore aperto con questo reagente deve essere utilizzato in una cappa chimica.
   7. Trasferire 285 μL della soluzione di estrazione dell'RNA alla provetta della microcentrifuga mentre si risciacqua il contenuto di vite senza fine dalla punta della smerigliatrice del motore alla provetta della microcentrifuga. Vortice da mescolare accuratamente.
      NOTA: questo è un punto di pausa. I campioni possono essere conservati nella soluzione di estrazione dell'RNA a -80 °C per un paio di mesi. Una volta prelevati fuori da -80 °C, lasciare scongelare i campioni a temperatura ambiente.
   8. Trasferire 60 μL di cloroformio su ciascun campione e vortice vigorosamente. Lasciare riposare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti.
      ATTENZIONE: Il cloroformio è tossico e deve essere maneggiato in una cappa chimica.
   9. Centrifugare a 21.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Trasferire con cautela 140 μL dello strato acquoso sulla parte superiore in una nuova provetta per microcentrifuga priva di RNasi utilizzando una pipetta da 200 μL, trasferendo 2x con 70 μL ogni volta.
      NOTA: Da questo passo in avanti, tutti i puntali e i contenitori per pipette che hanno un contatto diretto con il campione devono essere privi di RNasi. Si consiglia inoltre di utilizzare la soluzione di decontaminazione della RNasi per pulire tutte le attrezzature e lo spazio di lavoro.
   10. Trasferire 140 μL di isopropanolo nella provetta del campione. Vortice energicamente e lasciare decantare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti. Centrifugare a 21.000 x g per 20 minuti a 4 °C e rimuovere con cura tutto il surnatante.
   11. Trasferire 0,5 ml di etanolo (v/v) ghiacciato all'80% nella provetta con il pellet di RNA. Vortice vigorosamente fino a quando il pellet di RNA lascia il fondo del tubo e galleggia nella soluzione di etanolo. Centrifugare a 21.000 x g per 10 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante.
   12. Centrifugare brevemente le provette nella mini centrifuga per 15 s per far girare qualsiasi solvente aderente alla parete del tubo, quindi rimuovere la soluzione di etanolo il più possibile con una pipetta.
   13. Lasciare il tappo del tubo aperto per asciugare il pellet di RNA. Se il pellet è stato lavato accuratamente con la soluzione di etanolo, la fase di asciugatura dovrebbe richiedere meno di 10 minuti.
       NOTA: questo è un punto di pausa. Il pellet di RNA essiccato può essere conservato a -80 °C per un massimo di 1 mese.
   14. Sciogliere il pellet di RNA secco con 40 μL di acqua priva di nucleasi e trattare con un kit di rimozione del DNA secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
       NOTA: Si raccomanda di sciogliere prima l'RNA in acqua priva di nucleasi. Se 40 μL di acqua vengono miscelati con il tampone 10x DNasi prima di trasferirsi nel tubo di RNA, il pellet di RNA non si dissolverà completamente. I campioni di RNA devono essere tenuti sul ghiaccio quando si scioglie il pellet di RNA in acqua. I cicli di congelamento-scongelamento diminuiscono la qualità dell'RNA; pertanto, procedere alla fase di trascrizione inversa lo stesso giorno del trattamento con DNasi.
2. Estrazione di RNA da un piccolo numero di vermi interi.
   1. Scegli 15-20 vermi dal loro prato batterico in una piastra NGM fresca non seminata per rimuovere i batteri dal verme.
   2. Secondo il produttore del kit qRT-PCR in 2 fasi (vedi Tabella dei materiali), preparare 20 μL di soluzione di lisi finale per ciascun campione mescolando 0,2 μL di DNasi con 19,8 μL di soluzione di lisi in provette PCR. Mescolare la soluzione di lisi pipettando su e giù 5 volte.
   3. Trasferire 15-20 vermi dalla piastra NGM non seminata nella provetta PCR contenente 20 μL della soluzione finale di lisi con il numero minimo di batteri. Incubare la reazione di lisi per 5 minuti a temperatura ambiente.
   4. Sonda sonicare (vedi Tabella dei materiali) i worm con ampiezza del 30% usando il seguente programma: sonicazione per 5 s, pausa per 5 s e ripetere 4x con un tempo di sonicazione totale di 20 s. Conservare i campioni in un bagno di acqua ghiacciata durante la sonicazione.
   5. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
      NOTA: Aggiungere più DNasi prima dell'incubazione se il controllo negativo no-RT mostra contaminazione del DNA a un livello preoccupante.
   6. Trasferire 2 μL di soluzione di arresto nella reazione di lisi e mescolare picchiettando delicatamente. Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente, quindi mettere su ghiaccio.
      NOTA: I campioni possono essere lasciati sul ghiaccio per un massimo di 2 ore prima di procedere alla fase di trascrizione inversa.
3. Eseguire l'estrazione dell'RNA dai tessuti dei vermi seguendo i passaggi seguenti.
   1. Raccogli circa 20 vermi dal loro prato batterico e mettili su una piastra NGM fresca non seminata per rimuovere i batteri da loro.
   2. Spostare i 20 vermi (con il minor numero possibile di batteri) in un vetro da orologio contenente 500 μL di soluzione di M9 contenente 4 μM di levamisolo (vedere Tabella dei materiali). L'immobilizzazione avverrà in pochi secondi.
   3. Quando i vermi sono immobilizzati, sezionare la linea germinale o l'intestino usando un ago da 25 G che può essere attaccato alla siringa da 1 ml.
      1. Sotto l'ambito di dissezione, eseguire un taglio nella posizione del secondo bulbo faringeo per consentire l'estrusione naturale dell'intestino e della linea germinale. I due tessuti possono essere facilmente distinti in base alla loro morfologia e al diverso contrasto. Utilizzare pinzette o aghi per separare delicatamente i tessuti, evitando di danneggiarli.
         NOTA: Si consiglia di sezionare entro 5-10 min. Se il taglio non produce una buona estrusione di tessuto, si consiglia di passare al verme successivo e sezionarne il maggior numero possibile entro 10 minuti. Questa procedura richiede un breve lasso di tempo per evitare cambiamenti di trascrizione dall'ambiente.
   4. Secondo il produttore del kit qRT-PCR in 2 fasi, preparare 20 μL di soluzione di lisi finale per ciascun campione mescolando 0,2 μL di DNasi I a 19,8 μL di soluzione di lisi nelle provette PCR. Mescolare la soluzione di lisi pipettando su e giù 5 volte.
   5. Utilizzare una pipetta di vetro autoclavata per trasferire i tessuti sezionati in un tubo PCR. Depositare i tubi PCR sul ghiaccio per 2 minuti per consentire la deposizione di materiale sul fondo. Rimuovere il surnatante, aggiungere 20 μL di soluzione di lisi finale nel tubo PCR e mescolare picchiettando.
   6. Incubare la reazione di lisi per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, trasferire 2 μL di soluzione di arresto nella reazione di lisi e miscelare picchiettando. Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: I campioni possono essere lasciati sul ghiaccio per un massimo di 2 ore prima di procedere alla fase di trascrizione inversa.

5. Trascrizione inversa e qRT-PCR

1. Eseguire la trascrizione inversa e la qRT-PCR da worm di massa.
   1. Misurare la concentrazione di RNA e preparare 5 μg di RNA totale per la trascrizione inversa.
   2. Preparare un campione di RNA aggregato mescolando quantità uguali di RNA da ciascun campione e regolando la concentrazione finale di RNA a 0,556 g / L (5 μg / 9 μL). Utilizzare il campione di RNA aggregato per la curva standard qRT-PCR e i controlli RT-negativi.
   3. Eseguire la trascrizione inversa secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Eseguire le seguenti reazioni di trascrizione inversa di controllo qualità insieme ai singoli campioni di RNA.
      1. Eseguire la trascrizione inversa con il campione di RNA aggregato come modello (per la curva standard qRT-PCR).
      2. Eseguire la trascrizione inversa con il campione di RNA aggregato come modello, senza la trascrittasi inversa (controllo RT-negativo; controllo di qualità per la potenziale contaminazione del DNA del genoma).
      3. Eseguire la trascrizione inversa con l'acqua priva di nucleasi come modello (controllo RT-negativo; controllo di qualità per potenziale contaminazione da RNA nei reagenti).
         NOTA: questo è un punto di pausa. I campioni possono essere lasciati nel termociclatore durante la notte o conservati a -20 °C per alcuni mesi.
   4. Diluire il cDNA generato dai campioni di RNA aggregati quattro volte, 20 volte, 100 volte e 500 volte con acqua priva di nucleasi per curve standard qRT-PCR.
   5. Diluire il cDNA generato da ciascun campione di RNA 20-100 volte da utilizzare come modello per le reazioni qRT-PCR.
      NOTA: Il rapporto di diluizione dipende dall'abbondanza del gene di interesse. Per i geni ad alta espressione, come i geni housekeeping o egl-3 ed egl-21 utilizzati in questo studio, si raccomanda una diluizione 100x. Per i geni a bassa espressione, come lbp-8, si raccomanda una diluizione 20x.
   6. Eseguire qRT-PCR con reagenti qRT-PCR secondo le istruzioni del produttore come segue: 95 °C per 10 minuti, ripetere 40 volte con 95 °C per 15 s e 60 °C per 1 minuto, seguito dal programma di curva di fusione predefinito e tenere a 8 °C per un tempo indefinito.
2. Eseguire la trascrizione inversa e la qRT-PCR da alcuni vermi o tessuti di vermi.
   1. Trasferire 25 μL di tampone RT e 2,5 μL di miscela enzimatica RT 20x dal kit qPCR a 2 fasi (vedere Tabella dei materiali) in ciascuna provetta contenente lisato di verme della fase 4.2.6 o della fase 4.3.6.
      NOTA: Un controllo RT-negativo è fondamentale per la qRT-PCR da alcuni worm. Ogni esperimento deve includere un campione di lisato di verme (dal punto 4.2.6) con tampone RT ma senza enzima RT per esaminare la contaminazione del DNA nei campioni. Se la contaminazione del DNA è un problema, considerare l'aggiunta di più DNasi al tampone di lisi o più DNasi al campione dopo che i vermi sono stati lisati. In alternativa, si può eseguire un controllo RT-negativo per ciascun campione utilizzando metà del lisato in una normale reazione RT e l'altra metà in una reazione RT senza trascrittasi inversa.
   2. Mescolare picchiettando delicatamente. Spin down utilizzando una mini centrifuga per 10 s.
   3. Caricare i campioni nella termociclatrice seguendo le istruzioni del produttore: 37 °C per 60 min, 95 °C per 5 min e 8 °C per un tempo indefinito.
      NOTA: questo è un punto di pausa. I campioni possono essere lasciati nel termociclatore durante la notte o conservati a -20 °C per alcuni mesi.
   4. Conservare tutti i reagenti e i campioni su ghiaccio e proteggere i reagenti qRT-PCR dalla luce.
   5. Preparare una piastra qPCR da 96 pozzetti e in ogni pozzetto mescolare 6 μL di acqua priva di nucleasi, 10 μL di reagente qRT-PCR, 2 μL di miscela di primer da 5 μM (avanti e indietro) e 2 μL di cDNA. Coprire la superficie della piastra qPCR a 96 pozzetti con una pellicola ottica protettiva e premere verso il basso per sigillare.
   6. Eseguire il programma qRT-PCR su un termociclatore seguendo le istruzioni del produttore come segue: 50 °C per 2 min, 95 °C per 2 min, ripetere 40 volte con 95 °C per 3 s e 60 °C per 30 s, seguito da 8 °C per un tempo indefinito.

Validazione dei cambiamenti trascrizionali utilizzando alcuni vermi interi dopo l'integrazione lipidica
Per indagare se il protocollo per estrarre e retrotrascrivere l'RNA in cDNA da pochi vermi interi è riproducibile e confrontabile con i dati dei vermi sfusi, è stato impiegato un ceppo di vermi di lunga durata che sovraesprime l'acido lisosomiale lipasi lipl-4 nell'intestino 7,8,33,35. L'induzione trascrizionale dei geni di elaborazione dei neuropeptidi egl-3 e egl-21 riportati in studi precedenti 7,8,33 è stata convalidata (Figura 2A,B). Questa induzione indica che il metodo di estrazione dell'RNA da pochi animali è una valida alternativa alle tecniche standard di sintesi del cDNA da colture di vermi sfusi.

Validazione di valutazioni trascrizionali utilizzando tessuti vermi sezionati dopo integrazione lipidica
In C. elegans, la sintesi di PUFA a 20 atomi di carbonio dipende dall'attività della desaturasi FAT-316,17. Studi precedenti hanno riportato che i mutanti fat-3 mancano di PUFA a 20 atomi di carbonio, incluso DGLA16. In precedenza, è stato scoperto che la perdita di Δ6-desaturasi FAT-3 nei vermi lipl-4g sopprime l'induzione trascrizionale dei geni di elaborazione del neuropeptide egl-3 e egl-2133. Inoltre, l'integrazione DGLA salva tale induzione33. Il gene che codifica egl-21 è espresso nei neuroni, mentre egl-3 è rilevato sia nei neuroni che nell'intestino36,37. Per verificare ulteriormente se l'integrazione di DGLA ripristina l'induzione di egl-3 e egl-21 nell'intestino o nei neuroni, l'intestino è stato sezionato e i loro livelli trascrizionali sono stati valutati utilizzando l'analisi qRT-PCR descritta nelle fasi 4.3 e 5.2 di questo protocollo. DGLA è stato integrato nel cibo di origine per 12 ore al giorno-1 età adulta. Nessuna induzione trascrizionale di egl-3 o egl-21 è stata trovata nell'intestino (Figura 2C), che è coerente con i risultati precedenti 36,38.

Validazione del saggio sulla durata della vita dopo l'integrazione lipidica
La relazione tra i PUFA a 20 atomi di carbonio e il meccanismo di longevità che inattiva il grasso-3 è stata precedentemente esplorata, in particolare nell'intestino dei vermi lipl-4g 33. Si è scoperto che il knockdown fat-3 sopprime completamente l'estensione della durata della vita conferita da lipl-433. Per valutare se DGLA ripristina la longevità mediata da lipl-4, DGLA è stato integrato fresco a giorni alterni nel cibo di origine al giorno 1 dell'età adulta. È stato riscontrato che al momento del knockdown di fat-3, l'integrazione DGLA salva l'estensione della durata della vita (Figura 2D) 33, indicando una procedura di integrazione lipidica di successo accoppiata con il saggio della durata della vita.

Figura 1: Schema dell'alimentazione lipidica utilizzando diverse impostazioni sperimentali. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Validazione della valutazione trascrizionale dei geni di elaborazione dei neuropeptidi utilizzando una grande popolazione di vermi, alcuni vermi e tessuti sezionati. (A) L'RNA estratto da una grande popolazione di vermi mostra l'induzione dei livelli di trascrizione egl-3 ed egl-21 dei geni di elaborazione neuropeptidicanegli animali lipl-4 Tg. Le barre di errore rappresentano ±1 SEM. **** p < 0,0001 dal test t di Student a due code. (B) L'estrazione dell'RNA da alcuni vermi conferma l'induzione dei livelli di trascrizione egl-3 ed egl-21 dei geni di elaborazione neuropeptidica nei vermi lipl-4 Tg. Le barre di errore rappresentano ±1 SEM. **** p < 0,0001 dal test t di Student a due code. (C) I geni di elaborazione neuropeptidica neuronale egl-3 e egl-21 non sono indotti nell'intestino sezionato. Le barre di errore rappresentano ±1 SEM. Analisi statistica con test t di Student a due code. (D) L'integrazione di DGLA a diverse concentrazioni, tra cui 10 μm, 100 μm e 1 mM salva l'effetto di longevità lipl-4Tg sull'RNAi grasso-3. p < 0,001 mediante log-rank test. Questa figura è adattata da Savini et al.33. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non hanno conflitti di interesse.