Combinazione di attuatore di forza magnetica 3D e imaging a fluorescenza multifunzionale per studiare la meccanobiologia del nucleo

Miao Huang; Heyang Wang; Alfredo A. Delgado; Tyler A. Reid; Julian Long; Shu Wang; Hayley Sussman; Juan Guan; Hitomi Yamaguchi; Xin Tang

doi:10.3791/64098

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Articolo metodologico

Combinazione di attuatore di forza magnetica 3D e imaging a fluorescenza multifunzionale per studiare la meccanobiologia del nucleo

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DOI:

10.3791/64098

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5 luglio 2022

Miao Huang¹^,⁵ , Heyang Wang¹^,⁵ , Alfredo A. Delgado¹ , Tyler A. Reid¹ , Julian Long² , Shu Wang³^,⁵ , Hayley Sussman⁴ , Juan Guan⁵^,⁶^,⁷ , Hitomi Yamaguchi¹ , Xin Tang¹^,⁵^,⁸^,⁹

¹Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, ²Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, ³Department of Biostatistics, University of Florida, ⁴Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), ⁵UF Health Cancer Center, University of Florida, ⁶Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, ⁷Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, ⁸J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, ⁹Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

In questo articolo

Sommario

Questo studio presenta un nuovo protocollo per applicare direttamente la forza meccanica sul nucleo cellulare attraverso microsfere magnetiche consegnate nel citoplasma e per condurre simultanee immagini fluorescenti di cellule vive.

Abstract

Una questione fondamentale in meccanobiologia è come le cellule viventi percepiscono gli stimoli meccanici extracellulari nel contesto della fisiologia e della patologia cellulare. Si ritiene che la meccano-sensazione cellulare degli stimoli meccanici extracellulari sia attraverso i recettori di membrana, il complesso proteico associato e il citoscheletro. I recenti progressi nella meccanobiologia dimostrano che il nucleo cellulare nel citoplasma stesso può percepire indipendentemente gli stimoli meccanici contemporaneamente. Tuttavia, manca una comprensione meccanicistica di come il nucleo cellulare percepisce, trasduce e risponde agli stimoli meccanici, principalmente a causa delle sfide tecniche nell'accesso e nella quantificazione della meccanica del nucleo con strumenti convenzionali. Questo documento descrive la progettazione, la fabbricazione e l'implementazione di un nuovo attuatore di forza magnetica che applica stimoli meccanici 3D precisi e non invasivi per deformare direttamente il nucleo cellulare. Utilizzando cellule ingegnerizzate con CRISPR / Cas9, questo studio dimostra che questo strumento, combinato con l'imaging fluorescente confocale ad alta risoluzione, consente la rivelazione della dinamica in tempo reale di una proteina associata al sì meccano-sensibile (YAP) in singole cellule in funzione della deformazione del nucleo. Questo semplice metodo ha il potenziale per colmare l'attuale divario tecnologico nella comunità meccanobiologica e fornire risposte al divario di conoscenze che esiste nella relazione tra meccanotrasduzione del nucleo e funzione cellulare.

Introduzione

Questo studio mira a sviluppare e applicare una nuova tecnica per chiarire la meccanobiologia del nucleo combinando gli attuatori magnetici che applicano la forza meccanica direttamente sul nucleo cellulare e la microscopia a fluorescenza confocale che visualizza simultaneamente i cambiamenti subcellulari strutturali e funzionali. Le cellule rilevano segnali biofisici extracellulari tra cui rigidità tissutale ^1,2,3,4, pressione del liquido interstiziale e sforzo di taglio ^5,6,7, topologia / <....