Articolo metodologico

Un semplice metodo di filtrazione da banco per isolare piccole vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane

DOI:

10.3791/64106

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23 giugno 2022

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1Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Universiti Kebangsaan Malaysia Medical Centre, 2My CytoHealth Sdn. Bhd., 3School of Biosciences, Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University, 4School of Pharmacy, Monash University Malaysia, 5Haematology Unit, Cancer Research Centre, Institute for Medical Research (IMR), National Institutes of Health (NIH), Ministry of Health Malaysia, 6School of Pharmacy, Faculty of Health & Medical Sciences, Taylor's University, 7Centre for Drug Discovery and Molecular Pharmacology (CDDMP), Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo dimostra come isolare le piccole vescicole extracellulari derivate dal cordone ombelicale umano (hUC-MSC-sEV) con una semplice impostazione da banco su scala di laboratorio. La distribuzione dimensionale, la concentrazione proteica, i marcatori sEVs e la morfologia degli hUC-MSC-sEV isolati sono caratterizzati rispettivamente dall'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, dal saggio della proteina BCA, dal western blot e dal microscopio elettronico a trasmissione.

Abstract

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Il processo basato sull'ultracentrifugazione è considerato il metodo comune per l'isolamento di piccole vescicole extracellulari (sEV). Tuttavia, la resa di questo metodo di isolamento è relativamente inferiore e questi metodi sono inefficienti nel separare i sottotipi sEV. Questo studio dimostra un semplice metodo di filtrazione da banco per isolare le piccole vescicole extracellulari MSC derivate dal cordone ombelicale umano (hUC-MSC-sEVs), separate con successo mediante ultrafiltrazione dal mezzo condizionato di hUC-MSC. La distribuzione dimensionale, la concentrazione proteica, i marcatori esosomici (CD9, CD81, TSG101) e la morfologia degli hUC-MSC-sEV isolati sono stati caratterizzati rispettivamente con analisi di tracciamento delle nanoparticelle, saggio della proteina BCA, western blot e microscopio elettronico a trasmissione. La dimensione degli hUC-MSC-sEV isolati era di 30-200 nm, con una concentrazione di particelle di 7,75 × 10 10 particelle/ml e una concentrazione proteica di80 μg/mL. Sono state osservate bande positive per i marcatori esosomici CD9, CD81 e TSG101. Questo studio ha dimostrato che gli hUC-MSC-sEV sono stati isolati con successo dal mezzo condizionato da hUC-MSCs e la caratterizzazione ha mostrato che il prodotto isolato soddisfaceva i criteri menzionati da Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

Introduzione

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Secondo MISEV 2018, le sEV sono particelle lipidiche a doppio strato non replicanti senza nucleo funzionale presente, con una dimensione di 30-200 nm1. Le sEV derivate da MSC contengono importanti molecole di segnalazione che svolgono un ruolo importante nella rigenerazione dei tessuti, come microRNA, citochine o proteine. Sono diventati sempre più un "hotspot" di ricerca nella medicina rigenerativa e nella terapia cell-free. Molti studi hanno dimostrato che le sEV derivate da MSC sono efficaci quanto le MSC nel trattamento di diverse condizioni, come l'immunomodulazione 2,3,4,5, il miglioramento dell'osteogenesi 6, il diabete mellito7,8 o la rigenerazione vascolare 9,10. Con il progredire degli studi di fase iniziale, sono state evidenziate tre questioni chiave principali in relazione alla traduzione clinica delle MSC-EV: la resa delle EV, la purezza delle EV (esenti da detriti cellulari e altri contaminanti biologici come proteine e citochine) e l'integrità della membrana fosfolipidica a doppio strato delle EV dopo l'isolamento.

Sono stati sviluppati vari metodi per isolare i sEV, sfruttando la densità, la forma, le dimensioni e le proteine di superficie dei sEV11. I due metodi più comuni nell'isolamento dei veicoli elettrici sono tecniche basate sull'ultracentrifugazione e sull'ultrafiltrazione.

I metodi basati sull'ultracentrifugazione sono considerati metodi gold standard nell'isolamento dei sEV. Due tipi di tecniche di ultracentrifugazione che vengono solitamente impiegate sono l'ultracentrifugazione differenziale e l'ultracentrifugazione a gradiente di densità. Tuttavia, i metodi di ultracentrifugazione spesso comportano una bassa resa e richiedono costose attrezzature per l'ultracentrifuga ad alta velocità (100.000-200.000 × g)11. Inoltre, le tecniche di ultracentrifugazione da sole sono inefficienti nel separare i sottotipi di EV (sEV e grandi EV), risultando in uno strato di sedimenti impuri11. Infine, l'ultracentrifugazione del gradiente di densità potrebbe anche richiedere molto tempo e richiedere ulteriori misure precauzionali come l'aggiunta di tampone di saccarosio per inibire il danno del gradiente durante le fasi di accelerazione e decelerazione12. Pertanto, l'ultracentrifugazione di solito porta a una resa relativamente bassa e non è in grado di discriminare tra diverse popolazioni di EV13, il che limita la sua applicazione per la preparazione di EV su larga scala11.

Il secondo metodo di isolamento EV è tramite ultrafiltrazione, che si basa sulla filtrazione dimensionale. L'ultrafiltrazione è relativamente efficiente in termini di tempo e costi rispetto all'ultracentrifugazione, in quanto non comporta attrezzature costose o lunghi tempi di lavorazione14. Quindi, l'ultrafiltrazione sembra essere una tecnica di isolamento più efficace di entrambi i suddetti metodi di ultracentrifugazione. I prodotti isolati possono essere più specifici in base alle dimensioni dei pori e alla maggiore resa15. Tuttavia, la forza aggiuntiva sostenuta durante il processo di filtrazione può provocare la deformazione o l'eruzione dei veicoli elettrici16.

Il presente documento ha proposto un protocollo da banco economico e tempestivo per isolare i sEV derivati da MSC per l'analisi a valle e scopi terapeutici. Il metodo descritto in questo documento ha combinato un semplice metodo di filtrazione con centrifugazione da banco per isolare EV ad alto rendimento e di buona qualità da hUC-MSC per l'analisi a valle, compresa l'analisi delle dimensioni delle particelle, il saggio dei biomarcatori e l'imaging al microscopio elettronico.

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Protocollo

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NOTA: vedere la tabella dei materiali per informazioni dettagliate su tutti i materiali, le attrezzature e il software utilizzati in questo protocollo.

1. Cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale umano e coltura

  1. Coltura delle hUC-MSC ad una densità di semina di 5 × 103/cm2 in DMEM, integrata con lisato piastrinico umano all'8% e penna strep all'1%. Incubare le cellule a 37 °C in 5% di CO2. Sostituire il terreno di coltura cellulare ogni 3 giorni per garantire una corretta crescita cellulare.
  2. Espandere le celle fino al passaggio 5 nei palloni T175 per l'isolamento sEV.
    NOTA: Sono necessari molti palloni per raccogliere un'alta resa di sEV (la resa aumenta con il numero di celle).

2. Isolamento di piccole vescicole extracellulari da hUC - MSCs

  1. Sostituire il terreno di coltura con DMEM fresco privo di rosso fenolo integrato con 1% Pen-Strep [Terreno condizionato (CM)] quando la coltura raggiunge il 70% -80% di confluenza al passaggio 5.
    ATTENZIONE: Utilizzare solo supporti basali; evitare FBS e integratori di lisato piastrinico umano per evitare la contaminazione da sEV esterni.
  2. Dopo 24 ore, centrifugare il CM a 200 × g per 5 minuti a 4 °C per rimuovere i residui cellulari. Raccogliere e filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,22 μm per rimuovere particelle più grandi di 220 nm.
  3. Riempire l'unità filtrante centrifuga con 30 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) filtrata attraverso un filtro da 0,2 μm. Centrifugare l'unità filtrante centrifuga a 3.500 × g per 5 minuti a 4 °C.
  4. Riempire il CM filtrato nell'unità filtrante centrifuga (il volume massimo di ciascuna unità è di 70 ml). Centrifugare il CM a 3.500 × g a 4 °C.
    NOTA: La durata della centrifugazione deve essere monitorata di volta in volta fino a quando la soluzione non ha raggiunto la superficie del filtro.
  5. Gettare la soluzione nella tazza della soluzione filtrata. Centrifugare inversamente il bicchiere filtrante del campione con il bicchiere di raccolta del concentrato a 1.000 x g a 4 °C per 2 minuti.
  6. Trasferire nuovamente la CM concentrata nell'unità filtrante centrifuga. Aggiungere 30 mL di PBS filtrato nell'unità filtrante centrifuga e centrifugare l'unità a 3.500 × g a 4 °C.
  7. Gettare la soluzione nella tazza della soluzione filtrata. Installare un bicchiere di raccolta del concentrato sull'unità filtrante e centrifugare inversamente a 1.000 × g per 2 minuti a 4 °C per ottenere i sEV purificati.
  8. Filtrare i sEV attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm.
  9. Trasferire i campioni in nuove provette e conservarli a -80 °C per ulteriori analisi.

3. Caratterizzazione degli hUC-MSC-sEVs

  1. Analisi di tracciamento delle nanoparticelle
    1. Diluire gli hUC-MSC-sEV isolati in PBS filtrati a 20-100 particelle/frame.
    2. Introdurre 1 mL del campione diluito nella camera NTA utilizzando siringhe monouso da 1 ml.
    3. Impostare le impostazioni di misurazione di conseguenza: regolare il livello della telecamera al livello 14, determinare la soglia di rilevamento per includere il maggior numero possibile di particelle con la limitazione che vengano contate 10-100 croci rosse e il conteggio delle croci blu è limitato a cinque.
    4. Per ogni misurazione, registrare cinque video di 1 minuto e analizzarli utilizzando il software NanoSight con una soglia di rilevamento di cinque.
    5. Effettuare misurazioni in triplice copia per ogni campione.
  2. Analisi Western blotting
    1. Lisare gli hUC-MSC-sEV con tampone di lisi RIPA (ice-cold radioimmunoprecipitation assay), incubare per 30 min a 4 °C e centrifugare a 200 × g per 5 min a 4 °C. Raccogli il surnatante.
    2. Quantificare la proteina utilizzando un kit di dosaggio delle proteine dell'acido bicinconinico (BCA). Assemblare il set di elettroforesi su gel di conseguenza ed eseguire l'elettroforesi su gel a 90 V fino a quando la proteina raggiunge l'estremità del gel impilabile. Cambiare la tensione a 200 V per separare le proteine fino alla fine del gel risolutivo.
    3. Eseguire il trasferimento semisecco per trasferire le proteine dal gel a una membrana di polivinilidendifluoruro (PVDF) a 15 V per 1 ora.
    4. Bloccare la membrana PVDF con albumina sierica bovina al 3% (BSA)/soluzione salina tamponata Tris-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) per 1 ora su uno shaker a temperatura ambiente. Incubare la membrana PVDF con anticorpi primari come segue: anticorpo monoclonale anti-CD 9 di topo (1:500), anticorpo monoclonale anti-CD 81 di topo (1:500), anticorpo monoclonale di topo anti-GRP 94 monoclonale di topo anti-TSG 101 (1:500) a 4 °C durante la notte con agitazione costante.
    5. Il giorno successivo, lavare la membrana PVDF 5 x 5 min con TBS-T e incubare ulteriormente con un anticorpo secondario: proteina legante IgG kappa del topo coniugata con perossidasi di rafano (m-IgGκ BP-HRP) (1:5.000) per 1 ora agitazione a temperatura ambiente.
    6. Ancora una volta, lavare la membrana PVDF con TBS-T cinque volte e visualizzare la membrana in un imager ad accoppiamento di carica (CCD) utilizzando un reagente di rilevamento a chemiluminescenza. Analizzare il livello di espressione delle proteine utilizzando il software ImageJ. Innanzitutto, apri il file immagine in ImageJ (File | Aperto...). Migliorare la qualità dell'immagine regolando la luminosità e il contrasto (Immagine | Regola | Luminosità/Contrasto). Regolare l'immagine fino a quando le macchie sono chiaramente visibili, fare clic sul pulsante Applica , quindi salvare le immagini in formato TIFF (File | Salva con nome | TIFF...).
  3. Microscopio elettronico a trasmissione
    1. Diluire una parte del campione hUC-MSC-sEVs con quattro parti di PBS filtrato per un volume totale di 10 μL e incubare su una griglia di rame rivestita di carbonio per 15 minuti.
    2. Rimuovere il campione in eccesso con una salvietta da laboratorio e lasciarlo asciugare all'aria per 3 minuti.
    3. Incubare 10 μL di soluzione di acido fosfotungstico (PTA) all'1% per colorare il campione per 3 minuti.
    4. Rimuovere la soluzione di PTA all'1% in eccesso utilizzando una salvietta da laboratorio e lasciarla asciugare all'aria per 3 minuti.
    5. Utilizzare il campione per l'imaging al microscopio elettronico a trasmissione.
      NOTA: fare riferimento alla Figura 1 per i passaggi schematici dell'esperimento riepilogati.

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Risultati

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La Figura 2 mostra che gli hUC-MSC-sEV hanno una modalità di dimensione delle particelle a 53 nm, mentre altri picchi significativi di dimensione delle particelle erano 96 e 115 nm. La concentrazione di hUC-MSC-sEV misurata da NTA era 7,75 × 1010 particelle/ml. La concentrazione proteica di hUC-MSC-sEVs misurata con il test BCA era di circa 80 μg/ml.

Nell'analisi western blotting, gli hUC-MSC-sEV hanno dimostrato bande positive per i marcatori esosomici...

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Discussione

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Le EV sono uno dei sottoinsiemi importanti del secretoma nelle MSC che svolgono un ruolo cruciale durante i processi normali e patologici. Tuttavia, le sEV, con un intervallo di dimensioni comprese tra 30 e 200 nm, sono aumentate come potenziale strumento per la terapia senza cellule negli ultimi dieci anni. Sono state sviluppate varie tecniche per isolare i sEV dalle MSC. Tuttavia, l'ultracentrifugazione differenziale, l'ultrafiltrazione, la precipitazione a base di polimeri, la cattura di immunoaffinità e la precipitaz...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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La pubblicazione di questo video è stata supportata da My CytoHealth Sdn. Bhd.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
40% acrilammideNacalai Tesque06121-95Western blot
95% etanoloNacalai Tesque14710-25Disinfettanti
Metanolo assolutoChemiz45081Per attivare la membrana PVDF (Western blot)
AccutaseSTEMCELL Technologies7920Enzima di dissociazione cellulare
persolfato di ammonioChemiz14475catalizzare la polimerizzazione del gel (Elettroforesi su gel
anti-CD 81 (B-11)Santa Cruz Biotechnologysc-166029Anticorpo per marcatore sEVs
anti-TSG 101 (C-2)Santa Cruz Biotechnologysc-7964Anticorpo per marcatore sEVs
Albumina sierica bovinaNacalai Tesque00653-31Membrana PVDF che blocca
il bromofenolo bluNacalai Tesque05808-61marcatore colore elettroforetico
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)MilliporeUFC710008isolamento sEVs
ChemiLumi One LNacalai Tesque7880reagente di rilevamento della chemiluminescenza
CryoStor Freezing MediaSigma-AldrichC3124-100MLCell cryopreserve
Dulbecco' s Eagle modificato' s mediumNacalai Tesque08458-45Terreni di coltura cellulare
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein MarkerSMOBIOPM2610Marcatori di peso molecolare delle proteine
Carta assorbente extra spessaATTObuffer reservior (Western blot)
GliceroloMerckG5516Sostanze chimiche per western blot
Glicina1a baseBIO-2085-500gProdotti chimici per tampone (Western Blot)
proteina legante kappa IgG kappa coniugata con perossidasi di rafano (m-IgGκ BP-HRP)Santa Cruz Biotechnologysc-516102Anticorpo secondario (Western Blot)
Human Wharton' s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs)Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Facoltà di Medicina, The National University Malaysia
mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)Santa Cruz Biotechnology  sc-13118Anticorpo per marcatore sEVs
Nanosight NS300 dotato di una telecamera CMOS, una lente obiettivo 20 & volte, un modulo laser blu (488  nm), e il software NTA v3.2Malvern Panalytical, UK
paraformaldeideNacalai Tesque02890-45Fissazione del campione durante la
penicillina TEM... streptomicinaNacalai Tesque26253-84Antibiotico per
terreni fenilmetilsulfonilfluoruroNacalai Tesque27327-81Inibire le proteasi nei campioni di sEVs dopo l'aggiunta di tampone di lisi
salina tamponata con fosfatoGibco10010023Lavaggio, diluizione del campione
membrana in fluoruro di polivinilidene (PVDF) con
0,45 mm dimensione dei pori		ATTOPer trattenere le proteine durante il trasferimento proteico (Western blot)
cocktail di inibitori della proteasiNacalai Tesque25955-11Inibire le proteasi nei campioni di sEVs dopo l'aggiunta del tampone di lisi
Saggio delle proteine Kit di bicinchoninatoNacalai Tesque06385-00per campioni di misurazione delle proteine
con 2-MENacalai Tesque30566-22Agente riducente per western blot
sodico cloruroNacalai Tesque15266-64sostanze chimiche per western blot
sodio dodecil solfatoNacalai Tesque31606-62tensioattivo ionico durante l'elettroforesi su gel
Tecnai G2 F20 S-TWIN microscopio elettronico a trasmissioneFEI, USA
tetrametiletilendiamminaNacalai Tesque33401-72sostanze chimiche per preparare gel
tris-base1st BaseBIO-1400-500gProdotti chimici per tampone (Western Blot)
  Tween 20GeneTexGTX30962Prodotti chimici per western blot
UVP (Ultra Vision Product) Imager CCD imagerper il rilevamento del segnale western blot
soluzione Soluzione tampone

Riferimenti

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  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
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